復(fù)合因素誘發(fā)大鼠胃粘膜癌前病變的動物模型

1、    復(fù)合因素誘發(fā)大鼠胃粘膜癌前病變的動物模型         摘要目的：建立實用有效的動物模型，探討胃癌前病變與胃癌發(fā)生的過程及機制。方法：采用符合國人引起胃癌及癌前病變的多種因素(化學(xué)致癌劑MNNG、酒精、膽汁等)進行組合誘發(fā)多組大鼠胃癌前病變模型，研究胃癌前病變異型增生(GED)、腸化生(IM)及胃癌之間的關(guān)系。結(jié)果：誘發(fā)2例腺胃腺癌(均為45周的MNNG普通組)，33例 腺胃GED，4例十二指腸及小腸腺癌(MNNG加強組3只，MNNG乙醇組1只)等；腺胃GED全部是

2、胃型，發(fā)生于幽門腺區(qū)27例，胃底腺區(qū)6例；各組均未觀察到IM。結(jié)論：（1）建立的動物模型成功地誘發(fā)出胃癌及癌前病變；(2) MNNG誘發(fā)大鼠的胃腺癌及GED均來源于胃型上皮，在癌變及演進過程中，逐漸顯示腸型特點，為腫瘤異質(zhì)性表現(xiàn)，證明胃癌前病變亦具有異質(zhì)性；(3) IM可能不是癌前病變。關(guān)鍵詞胃粘膜；癌前狀態(tài)；疾病模型，動物；大鼠中分類號R735.2文獻標(biāo)識碼A文章編號1001-7399(2000)05-0406-03Gastric precancerous lesions in rat induced by composite factorsShi YuLi Lianhong（Sino-Ja

3、pan Clinicopathologic Center, Dalian Medical University,116027）ABSTRACTPurposeTo establish a practical and effective animal model in order to study the course and possible pathogenesis of precancerous lesions and cancer in stomach of rats. MethodsTo induce precancerous lesions and cancer model in ra

4、ts with various factors similar to that in human, such as N-methyl-N'-nitro-N-nitroso guanidine(MNNG), alcohol, bile and so on. Correlation of gastric epithelial dysplasia(GED) and intestinal metaplasia (IM) with gastric carcinoma was detected. ResultsTwo adenocarcinomas, thirty-three GED in gla

5、ndular stomach and four adenocarcinomas of duodenum or small intestine were induced. All thirty-three GED of glandular stomach were gastric type, in which six were in fundic gland area and twenty-seven in pyloric gland area. IM was not found in every group. ConclusionsExperimental gastric carcinoma

6、and precancerous lesions of rats were induced successfully with MNNG, alcohol and bile. Gastric carcinoma and GED of rats induced with MNNG are all derived from gastric type epithelia. During carcinogenesis progression, atypical epithelia are transformed gradually from gastric type to intestinal typ

7、e. It is demonstrated that not only the tumor but also precancerous lesions, appear to be heterogeneous. IM may be not a type of precancerous lesion.KEY WORDSgastric mucosa; precancerous conditions; disease models, animals; rats胃癌是最常見的惡性腫瘤之一1，一般認(rèn)為其發(fā)生需經(jīng)歷多年持續(xù)的癌前病變，因此研究胃粘膜癌前病變及其與胃癌關(guān)系，對于正確認(rèn)識和處理癌前病變、預(yù)防胃癌

8、發(fā)生具有重要的理論價值和臨床指導(dǎo)意義。WHO于1972年提出胃癌前病變，包括胃粘膜上皮異型增生(gastric epithelial dysplasia，GED)、腸化生(intestinal metaplasia, 簡稱IM)等2。最近很多研究證實GED是一種重要的癌前病變，而IM作為一種癌前病變爭議較大。有人認(rèn)為IM不是癌前病變，而只是癌旁病變3。本研究模擬引起胃癌的復(fù)合因素誘發(fā)大鼠胃癌前病變模型，研究胃癌前病變(GED與IM)之間及其與胃癌之間的關(guān)系。1材料與方法11動物SD大鼠(本校實驗動物中心提供，符合遼寧省實驗動物一級標(biāo)準(zhǔn))74只，體重165 g±8 g，各半，分籠飼養(yǎng)。

9、12藥品N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)購自日本片山工業(yè)株式會社。Tween-80購自大連醫(yī)藥集團化玻公司。去氧膽酸鈉購自上海行知化工廠。13動物分組及實驗方法第1組：MNNG普通組。10只,1 g/L MNNG生理鹽水,5 ml/只灌胃,隔日1次,共10次,后改為0.1 g/L MNNG生理鹽水自由飲10天。第2組：MNNG加強組。24只, MNNG溶于0.4% Tween溶液中1 g/L，5 ml/只灌胃，隔日1次，共20次，后改為自來水。第3組：MNNG膽汁組。10只, MNNG溶于0.4% Tween溶液中1 g/L, 5 ml/只, 0.2%去氧膽酸鈉溶液2 ml/只,

10、隔日交替灌胃各10次。第4組：MNNG乙醇組。10只,MNNG溶于0.4% Tween溶液中1 g/L， 5 ml/只，60%乙醇 2 ml/只，隔日交替灌胃各10次。第5組：MNNG復(fù)合組。10只,MNNG溶于0.4% Tween溶液中1 g/L，灌胃 隔日1次, 共10次，間隔日以60%乙醇與0.2%去氧膽酸鈉溶液各2 ml/只交替灌胃各10次。第6組:對照組。10只，正常飼養(yǎng)。實驗共進行45周，于實驗第20周開始每周均對各組中隨機處死或病死的大鼠進行尸檢，觀察癌前病變生長情況。尸檢時除對各主要臟器均取材外，重點對胃進行詳細檢查。將胃沿大彎側(cè)剖開，平鋪于硬紙板上，仔細觀察記錄胃粘膜肉眼改變

11、并照相。對可疑部位取電鏡標(biāo)本(1 mm×1 mm×1 mm大小)。余下部分置10%中性福爾馬林溶液中固定。固定后沿小彎平行方向分塊取材，每塊寬0.40.5 cm，將全胃分成68塊。石蠟包埋，4 m厚切片，分別經(jīng)HE染色及PAS/AB(pH 2.5)染色。取電鏡標(biāo)本大鼠胃31例,經(jīng)2.5%戊二醛固定，常規(guī)制樣，在日本產(chǎn)JEM-2000EX型電子顯微鏡下觀察拍照。14病理診斷標(biāo)準(zhǔn)胃粘膜上皮異型增生(GED)的診斷分型和分級參照吉井隆博提出的標(biāo)準(zhǔn)4。2結(jié)果21實驗動物各種病變的病理觀察211肉眼觀察大部分病變發(fā)生在幽門腺區(qū)的小彎側(cè)，包括2例腺癌、27例GED和5例胃潰瘍，只有6例

12、GED發(fā)生于胃底腺區(qū)。胃粘膜表面常不光滑，皺襞減少，病變多為不規(guī)則的腫塊，由粟粒大至黃豆大。直徑110 mm。較大的病變呈菜花樣腫物。212光鏡觀察實驗組大部分大鼠的胃粘膜有病變，早期表現(xiàn)為不同程度的糜爛或潰瘍，晚期則出現(xiàn)腺體的增生及不同程度的異型增生。2例胃癌出現(xiàn)于觀察時間最長(45周)的MNNG普通組。經(jīng)形態(tài)學(xué)和PAS/AB(pH 2.5)染色認(rèn)定33例GED均為胃型(表1)，甚至在同一腺腔里呈現(xiàn)不同程度的增生，PAS/AB(pH 2.5)染色，顯示PAS染色陽性。4例異型增生的細胞為胞漿嗜堿的主細胞型，腺體擴張呈圓形或橢圓形的囊腔，位于胃底腺區(qū)的腺體底部；2例為胞漿嗜酸的壁細胞型，腺體擴

13、張呈圓形或橢圓形的囊腔，也位于胃底腺區(qū)的腺體底部；2例為干細胞型，位于幽門,細胞較小、立方形、排列密集、形成比較長的隱窩，異型性大的隱窩較迂曲。表1腺胃GED的異型上皮類型及發(fā)生部位部位表面上皮型主細胞型壁細胞型干細胞型胃底腺區(qū)0420幽門腺區(qū)25002合計25422     22動物實驗所致各種病變及其在各組發(fā)生情況見表2，各組均未發(fā)現(xiàn)腸化。23大鼠腺胃癌前病變的電鏡觀察可見異型細胞核增大，形狀不規(guī)則，多呈桿狀，有的核膜有皺褶凹陷；核常染色質(zhì)增多，異染色質(zhì)顆粒增粗，聚集成團塊并靠近核膜內(nèi)側(cè)，有的核仁明顯；胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較豐富；有的具有粘液顆粒，細胞之

14、間有豐富的微絨毛。 3討論表2化學(xué)致癌劑誘發(fā)大鼠胃癌、癌前病變及其它腫瘤結(jié)果(例)分組有效動物數(shù)腺胃腺癌腺胃GED腺胃潰瘍前胃鱗狀上皮異型增生前胃鱗狀上皮乳頭狀瘤十二指腸及小腸腺癌胃底腺區(qū)幽門腺區(qū)MNNG普通組62021100MNNG加強組2204100123MNNG膽汁組100152220MNNG乙醇組90171221MNNG復(fù)合組80021210對照組100010000合計6526275874     31大鼠胃癌發(fā)生的過程胃粘膜的干細胞(增殖細胞)位于腺頸部并牢固附著于基膜，向上以“滾梯式運動”使有發(fā)達連接的表面上皮同步移動，不斷更新；向下形成以單

15、個細胞移動、連接松散并具有分泌功能的腺上皮5。本實驗雖觀察到在動物實驗早期，大部分大鼠的胃有糜爛或潰瘍，但反復(fù)的損傷和修復(fù)本身不一定構(gòu)成對干細胞致癌的原因。而處于增殖狀態(tài)的干細胞，因受致癌劑損傷的基因可能難以及時修復(fù)，而產(chǎn)生可遺傳的基因突變。如果同時胃粘膜上皮損傷嚴(yán)重，加速干細胞增殖，受致癌劑損害而突變的干細胞也增加，損傷部位將由這些突變的干細胞來源的上皮修復(fù)，并逐漸取代正常上皮而發(fā)生GED。向上發(fā)展為表面上皮型，向下發(fā)展為腺細胞型，或直接發(fā)展為未分化型。因為表面上皮最直接受損而最易形成表面上皮型(本實驗表面上皮型GED最多)，但易流失；腺細胞型易由于細胞增生造成腺體出口堵塞，而致囊性擴張。3

16、2IM與GED和胃癌的關(guān)系本動物實驗未見到IM，并且發(fā)生的2例腺胃腺癌和33例GED都是胃型上皮。 對大鼠的GED電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，光鏡形態(tài)學(xué)具有胃型上皮特點的異型上皮細胞，其超微結(jié)構(gòu)卻有腸型上皮的特點，提示在癌前階段，異型上皮細胞就表現(xiàn)出差異，具有異質(zhì)性。以上結(jié)果表明：(1) 化學(xué)致癌劑并不導(dǎo)致大鼠IM。這與Yamamoto等6報道一致。國內(nèi)學(xué)者7復(fù)制大鼠胃癌模型，單純給予MNNG自由飲未出現(xiàn)IM，而同時人工造成膽汁返流卻有較高IM發(fā)生率。其原因可能是胃內(nèi)pH值升高所造成的微環(huán)境誘導(dǎo)干細胞向腸上皮分化8；(2) 胃粘膜癌變過程中出現(xiàn)腸型特點是腫瘤異質(zhì)性的表現(xiàn)。胃癌由胃型上皮發(fā)生，在癌變及進展過程

17、中，此胃型上皮表現(xiàn)出多樣性，從而出現(xiàn)分化及功能上的差異，有的就表現(xiàn)腸型特點，這與Tatematsu等9通過大鼠誘癌實驗所得結(jié)論一致，即癌前干細胞先發(fā)生胃型細胞變化，其中部分可繼發(fā)腸型細胞的變化。國內(nèi)張蔭昌10在論述IM與胃癌關(guān)系時也指出：癌細胞與IM細胞在形態(tài)學(xué)上的共性，并不足以證明癌發(fā)生于良性腸化生細胞，正象正常胃粘膜在某些致病因素作用下可以化生一樣，胃癌細胞在其癌變過程中也可以獲得腸上皮或其它組織的特征。并有報告在彌漫型胃癌中看到了潘氏細胞，在彌漫浸潤的單個癌細胞上看到了帶有刷狀緣的腺樣結(jié)構(gòu)。這實際上就是腫瘤異質(zhì)性的表現(xiàn)。(3) IM可能不是癌前病變。有人11亦報道所謂IM亞型中的型IM，

18、經(jīng)過盲法比較其與GED的形態(tài)學(xué)差異及核仁形成區(qū)嗜銀相關(guān)蛋白(AgNORs)的計數(shù)差異，認(rèn)為型IM是GED的一種。故型IM已不屬于IM的范疇，因IM定義只是胃粘膜上皮被正常腸上皮取代而形成的一種化生8，12。本實驗發(fā)現(xiàn)的球樣異型增生有待進一步證實。基金項目：遼寧省教委資助項目(No 9707211067)作者簡介：石宇，男，29歲，碩士研究生；李連宏，男，39歲，教授，碩士生導(dǎo)師作者單位：石宇（大連醫(yī)科大學(xué)中日臨床病理中心，大連116027）李連宏（大連醫(yī)科大學(xué)中日臨床病理中心，大連116027）參考文獻1，李連弟, 張思維, 魯鳳珠等 中國惡性腫瘤死亡譜及分類構(gòu)成特征研究 中華腫瘤雜志, 19

19、97;19(5):3233282，World Health Organization. Report of a WHO Meeting on the Histological Definition of precancerous lesions. Geneva:WHO, 19723，磨伊正義, 高木. 胃癌前癌病變見直. 癌化學(xué)療法, 1995;22(14):202920374，吉井隆博著 胃病理 特組織像讀方 第4版， 東京：醫(yī)學(xué)書出版株式會社， 1985：1251435，藤田皙也 慢性胃炎癌 東京：協(xié)和發(fā)酵， 1982：36，Yamamoto M, Furihata C, Fujimitsu Y et al. Dose-dependent induction of both pepsinogenaltered pylor