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1、吡格列酮對大鼠痛風性關(guān)節(jié)炎滑膜細胞因子表達的作用l24TianjinMedJ,Feb2007,Vol35No2吡格列酮對大鼠痛風性關(guān)節(jié)炎滑膜細胞因子表達的作用黃火高王兆君張彥彬施海燕韓春光劉永學(xué)摘要目的:研究過氧化物酶體增殖物激活受體/(peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma,PPAR/)激動劑吡格列酮.對大鼠急性痛風性關(guān)節(jié)炎滑膜表達細胞因子的調(diào)控作用,探討其作用機制.方法:大鼠單側(cè)踝關(guān)節(jié)注射人工尿酸鈉晶體制作急性痛風性關(guān)節(jié)炎模型,于注射48h后取關(guān)節(jié)滑膜,以RTPCR法檢測吡格列酮(2Omg?kg?d.)口服給藥對滑膜表達腫瘤壞死因子ct(
2、TNFd),白介素1B(IL_1B),白介素1受體拮抗劑(ILIRa),細胞因子誘導(dǎo)中性粒細胞化學(xué)趨化因子(CINC,相當于人的白介素8),干擾素T(IFN一)和白介素4(IL-4)的作用.結(jié)果:吡格列酮用藥組滑膜表達TNFd,CINC和IFN顯著低于對照組,抑制率分別為81.7%,90.9%,65_3%;IL一4表達高于對照組,增加率為340.O%;IFN一L-4比值顯著低于對照組,抑制率為92.6%.2組IL-I和IL-1Ra的表達差別無統(tǒng)計學(xué)意義.結(jié)論:吡格列酮對急性痛風性關(guān)節(jié)炎的抗炎作用與抑制TNFd和CINC的表達.并促使Thl/Th2平衡向Th2為優(yōu)勢轉(zhuǎn)化有關(guān).關(guān)鍵詞過氧化物酶體增
3、殖物激活受體噻唑烷二酮類痛風細胞因子類大鼠EffectsofPioglitazoneonCytokineExpressionsinSynoviuminRatswithAcuteGoutyArthritisHUANGHuogao,WANGZhaojun,ZHANGYanbin,SHIHaiyan,HANChunguang,LIUYongxueDepartmentofEndocrinologyandRheumatology,NavyGeneralHospitalofPLA,Beijing100037,ChinaAbstractObjective:Toinvestigatetheeffectsofp
4、emxisomepmliferatoractivatedreceptorgamma(PPART)agonist,pioglitazone.oncytokineexpressionsinsynoviuminratswitIlacutegoutyarthritisinducedbymonosodiumuratemonohydrateStO.Methods:ModelofacutegoutyarthritisWaSinducedwiththeinjectionof1mgofMSUintorats'anklejointcavity.Fortyeighthoursafterinjection,c
5、ytokinemRNAexpressionsincludingTNF-or,IL-I,ILIRa,CINC(cytokineinducedneutrophilchemoattractant,equivalenttoIL一8),IFN一andIL-4inarthriticsynoviumofratsweredeterminedbyreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR).Results:TheexpressionsofTNF-ct,CINCandIFN一inarthriticsynoviumfrompioglitazonetreate
6、dratsweresignificandylowerthanthosefromcontrolgroup,withreducedratesof81.7%,90.9%and65.3%,respectively.TheexpressionofIL一4wasmuchhigherinsynoviumfromtreatedratsthanthatfromcontrolgroup.withaugmentedrateof340.0%.TheratioofIFNT/IL-4Wassuppressedtoanarithmeticrateof92.6%.whilenodifferenceswerefoundinex
7、pressionofIL一18andIL-1Ra.Conclusions:Pioglitazone,aPPARTagonist,mightexertantiinflammatoryeffectsthroughrepressingtheexpressionsofTNFdandCINC,andthroughshiftingtheThlfrh2balancetoaTh2cytokineresponse.whichtendstocontrolarthritis.Keywordsperoxisomeproliferator-activatedreceptorsthiazolidinedionesgout
8、cytokinesrats痛風是由于尿酸鈉(monosodiumurate.MSU)晶體在體內(nèi)析出引發(fā)的急慢性炎癥反應(yīng).急性痛風性關(guān)節(jié)炎是痛風典型表現(xiàn)形式【".過氧化物酶體增殖物活化型受體y(peroxisomeproliferatoractivatedreceptor,/,PPAR)是一類配體依賴的核受體.PPAR激動劑吡格列酮以改善胰島素抵抗而廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的治療.研究表明,PPAR活化可產(chǎn)生較強的抗炎作用21.胰島素抵抗是包括痛風在內(nèi)的代謝綜合征發(fā)生的中心環(huán)節(jié)翻.本研究小組證實吡格列酮可減輕動物急性痛風性炎癥,但對其抗炎機制目前缺乏研究.為此,本文研究吡格列酮對滑膜表達多
9、種細胞因子的影響.探討吡格列酮對痛風性關(guān)節(jié)炎作用的可能機制.1材料與方法1.1實驗動物二級Wistar雄性大鼠(2504-20)g.由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供并飼養(yǎng).1.2主要試劑吡格列酮由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司惠贈.尿酸鈉由TheBritishDrugHousesLTD生產(chǎn).基質(zhì)顯色鱟試劑購自上海醫(yī)學(xué)化驗所.總RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen.RT-PCR試劑盒和DL2000DNAMarker為TaKaRa產(chǎn)品.引物由北京賽百勝生物有限公司合成并純化.1.3急性痛風性關(guān)節(jié)炎模型的建立根據(jù)筆者研究方法舊制備MSU晶體并建立大鼠急性痛風性關(guān)節(jié)炎模型.作者單位:10003
10、7北京,海軍總醫(yī)院內(nèi)分泌風濕科(黃火高,張彥彬,施海燕);心內(nèi)科(王兆君);軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所藥理毒理研究室(韓春光,劉永學(xué))通訊作者E-mail:liuyxnic.bmi.ac.Clrl天津醫(yī)藥2007年2月第35卷第2期1.4動物分組和用藥方法8只大鼠隨機分為模型對照組,吡格列酮用藥組.每組大鼠各4只.另取未經(jīng)任何處理的4只正常大鼠用于檢測相關(guān)細胞因子的固有表達.將吡格列酮均勻混懸于1%羧甲基纖維素鈉懸液中.吡格列酮用藥組大鼠于誘發(fā)模型前3d按2Omg/(kg?d)劑量開始灌胃給藥,1次,d,連續(xù)5d.模型對照組大鼠以同樣方式給予等體積的1%羧甲基纖維素鈉懸液.1.5RT-PCR
11、檢測滑膜細胞因子的表達大鼠注射MSU48h后,打開脛跗關(guān)節(jié),沿骨骼周邊以眼科剪和手術(shù)刀片剪切滑膜及其周圍組織,于PBS中快速洗滌一遍后立即轉(zhuǎn)入組織勻漿器研磨中以1mLTRIzol抽提總RNA.檢測獲得的RNA量和純度后以2O體系將3的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA模板20,用于PCR檢測.所用引物序列和PCR條件.見表1.除了退火溫度和循環(huán)數(shù).反應(yīng)程式其他部分均相同:94預(yù)變性2min進入循環(huán),94變性45s,不同溫度下退火30S,72延伸1min.循環(huán)結(jié)束后72再延伸5min.降至4.PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳并成像分析,以ImageJ軟件(NIH)對產(chǎn)物條帶光密度值進行計算.結(jié)果以"
12、目的基因/GAPDH"比值表示.表1所用引物序列資料及PCR條件基酩稱.:篙nIF噸X66539S5'-GTCGTAGCAAACCACCAAC,-3283-496214bp52/30AS5I-GGrATG從GTGcC¨1G一3廣1BM98820S5'-TCTGTGACTCGTGGGATC,-3384-701318bp52AS5_TI11GGcTH研TrcC一3E-libM63101S5'-3W.ATCGTI'-347060414bp52C/35CD87927S5'-CL3W,AGGGACI'GTIF,TGG一378-21113
13、4bp52/32AS5-C,CTAAc1TG.ITCG1B一3巧NM一138880S5-c1-rG"GcCTGAGT-387-397311bp52/35AS5'-TGTGCrC,GATCTGTGGGT一3叫X16058S5'-TGCTGTCACCCIV,13L'W,一351-451柏1bp52/35AS5I-Gc從GT1CCrcGTG一3GAPDHXM_2145375'-CCATC,GAGAA3344-538195bp52/305一C從AG11mTGGA1BACc_3TNF-t(Tumornecrosisfactoralpha,腫瘤壞死因子),ILl(
14、Inter-leukin一1beta,白介素1B),IL一1Ra(Interleukin一1receptorantagonist,白介素1受體拮抗劑),CINC(cytokineinducedneutrophilchemoat.tractant,細胞因子誘導(dǎo)中性粒細胞化學(xué)趨化因子),IFNy(Interferongamma,干擾素),IL(Interleukin-4,白介素4),GAPDH(Glycer-aldehyde-3一phosphateDehydrogenase,甘油醛一3壤酸脫氫酶)1.6統(tǒng)計學(xué)方法結(jié)果以-1-s表示.2組間均數(shù)比較方差齊性時以Student-t檢驗,方差不齊時以近似
15、t檢驗.統(tǒng)計學(xué)軟件采用SPSS11.5.2結(jié)果2.1大鼠急性痛風性關(guān)節(jié)炎模型本實驗以MSU125誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎發(fā)生率為100%,表現(xiàn)為急劇發(fā)生的關(guān)節(jié)炎,關(guān)節(jié)紅腫和功能障礙,2h即出現(xiàn),4h表現(xiàn)明顯.812h達高峰,4872h后明顯好轉(zhuǎn),5-6d后自發(fā)緩解.2.2正?;ぜ毎蜃拥墓逃斜磉_正常滑膜僅微量表達TNFOt(0.0090.010),CINC(0.0064-0.004),IFN一(0.0094-0.003)和IL一4(0.0064-0.oo4),未見IL一1B和IL一1Ra表達.2.3關(guān)節(jié)炎滑膜細胞因子的表達及吡格列酮的影響關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MSU晶體誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎48h后.滑膜表達各種細胞因子均不
16、同程度增高,以TNF噸,CINC,IL一1B和IL一1Ra增加尤為明顯.吡格列酮用藥組滑膜表達TNFOt,CINC和IFN一顯著低于對照組,抑制率分別為81.7%,90.9%,65.3%;IL一4表達高于對照組,增加率為340.0%;IFN一L一4比值低于對照組,抑制率為92.6%,見表02組IL_1B和IL一1Ra的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但IL一1B和IL一1Ra表達量存在顯著相關(guān)性r=0.965,P<0.O1).表22組大鼠滑膜細胞因子表達的結(jié)果(n=±s)組另IFN一IL-4IFN一/II,4P<0.05."P<0.013討論
17、急性痛風性關(guān)節(jié)炎的根本病因是高尿酸血癥及其導(dǎo)致的關(guān)節(jié)局部MSU晶體的析出.MSU晶體導(dǎo)致大量炎性細胞浸潤,促使關(guān)節(jié)出現(xiàn)劇烈疼痛,紅腫和功能障礙.關(guān)節(jié)炎單次發(fā)作的病程包含早期急劇進展,高峰期和自發(fā)緩解三個時相【".本實驗以MSU誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎發(fā)生率為100%.表現(xiàn)為急劇發(fā)生的關(guān)節(jié)炎,12h內(nèi)達高峰,5-6d可自發(fā)緩解.結(jié)果表明,該動物模型較充分地模擬了人類急性痛風性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程.研究發(fā)現(xiàn)單核因子TNFOt,IL一1B和IL一1Ra,趨化因子IL一8(大鼠中為CINC)和淋巴因子IFN一均不同程度地參與了痛風的病理過程【71.本研究發(fā)現(xiàn)正常關(guān)節(jié)滑膜僅微量表達這些細胞因子.而MSU誘導(dǎo)關(guān)
18、節(jié)炎48h后這些細胞因子的表達出現(xiàn)不同126程度的增高,尤其以TNFOt,CINC,IL一113和IL一1Ra增加明顯,結(jié)果與文獻報道一致.PPARy主要表達于脂肪組織,也表達于單核/巨噬細胞,淋巴細胞,成纖維細胞和軟骨細胞等21.作為核受體超家族成員,PPARy的主要功能是在mRNA水平調(diào)控基因的表達.文獻報道,激活PPARy可減輕實驗性類風濕關(guān)節(jié)炎81,骨性關(guān)節(jié)炎91和人的銀屑病關(guān)節(jié)炎【l01.PPARy激動劑的抗炎作用可能通過競爭性結(jié)合共激活因子而抑制NFKB和AP一1等轉(zhuǎn)錄因子的活性實現(xiàn)21.本研究小組曾證實PPARy激動劑吡格列酮在大鼠痛風性關(guān)節(jié)炎中有明確的抗炎作用,但需較大的劑量,
19、其機制可能涉及促使巨噬細胞成熟和功能轉(zhuǎn)變.本實驗結(jié)果表明,吡格列酮可顯著抑制大鼠痛風性關(guān)節(jié)炎滑膜TNFOt和CINC的表達,抑制IFN一y并增加IL一4的表達,顯著降低IFN一",filL一4比值,但對IL一1B和IL一1Ra的作用不明顯.IFN一y和IL-4分別是Thl/Th2細胞因子的代表,Thl為優(yōu)勢的細胞因子可加重關(guān)節(jié)炎,相反,Th2為優(yōu)勢的細胞因子則可減輕關(guān)節(jié)炎1l1.結(jié)果提示,抑制TNFOt和CINC的表達及促使Thl/Th2平衡向Th2為優(yōu)勢轉(zhuǎn)化是吡格列酮抗炎作用的重要機制之一參考文獻1】PascualE,PedrazT.GoutJJ.CurtOpinRheumatol
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