黑曲霉生產(chǎn)纖維素酶工藝設(shè)計(jì)

1、黑曲霉生產(chǎn)纖維素酶工藝設(shè)計(jì)1. 維素酶1.1 纖維素酶的組分纖維素酶是水解纖維素及其衍生物生成葡萄糖的一組酶的總稱，是由多種水解酶組成的一個復(fù)雜酶系。纖維素酶是起協(xié)同作用的多組分酶系，國內(nèi)外多數(shù)根據(jù)纖維素酶的底物及作用的位點(diǎn)和釋放的產(chǎn)物將其分為三類:（1）葡聚糖內(nèi)切酶 (endo-l，4-D-glueanase，EC3.2.1.4)來自真菌的簡稱EG，又稱CMC一Na酶;來自細(xì)菌的簡稱Lne)。這類酶不能水解結(jié)晶纖維素如棉花和微晶纖維素等，主要作用于纖維素內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)和一些可溶性的底物如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素，隨機(jī)降解-1，4糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量帶非還原性末端的小分子纖

2、維素、纖維二糖和葡萄糖, 其分子量大小約23-146KD。(2) 葡聚糖外切酶(exo-1，4-D-glucanase，來自真菌簡稱CBH;來自細(xì)菌簡稱Cex)。作用于纖維素線狀分子末端，分解1，4-D糖苷鍵，每次從底物的非還原端切下一個纖維二糖分子，故又稱纖維二糖水解酶，可以水解無定形纖維素和微晶纖維素，對棉花有微弱的作用分子量約38-118KD。(3)-葡萄糖苷酶(-D一glucosidase，簡稱BG)纖維素大分子首先在GE酶和CBH酶的作用下降解為纖維二糖，再由BG酶水解成二個葡萄糖分子。其分子量約為76KD。1.2纖維素酶的作用機(jī)制目前對纖維素酶的分子機(jī)制大致有3種假說:改進(jìn)的Cl一

3、Cx假說、順序作用假說和競爭吸收模型。它們都認(rèn)為，纖維素酶降解纖維素時，先吸附到纖維素表面，然后其中的內(nèi)切酶在葡聚糖鏈的隨機(jī)位點(diǎn)水解底物產(chǎn)生寡聚糖，外切酶從葡聚糖鏈的還原或非還原端進(jìn)行水解產(chǎn)生纖維二糖，-葡萄糖苷酶水解纖維素二糖為葡萄糖。在纖維素溶解糖化過程中內(nèi)切酶和外切酶的比值會顯著地影響纖維素溶解活力，而且在纖維素糖化過程中-葡萄糖普酶組分的加入會使這種協(xié)同作用大大加強(qiáng)1，應(yīng)該注意的是，這種協(xié)同作用不僅作用順序不是絕對的，而且各酶的功能也不是簡單、固定的。研究表明，GE和CHB都能引起纖維素的分散和脫纖維化 (沿纖維素的經(jīng)度軸方向分層，形成更薄更細(xì)的亞纖維)，這樣纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)被打亂，導(dǎo)

4、致變形，使纖維素酶能深入纖維素分子界面之間，從而使纖維素孔壁、腔壁和微裂隙縫的壓力增大，水分子的介入又使纖維素分子之間的氫鍵被破壞，產(chǎn)生部分可溶性的微結(jié)晶，利于進(jìn)一步被降解。1.3纖維素酶在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用據(jù)統(tǒng)計(jì)，1995年，世界工業(yè)酶的銷售量大于10億美元;而1999年實(shí)際達(dá)到16億美元。工業(yè)酶總供應(yīng)量的60%來自于歐洲，其余40%來自于美國和日本，而且大約75%的工業(yè)酶是水解酶，其中糖營水解酶居第二位17。目前纖維素酶的應(yīng)用還主要集中在微生物纖維素酶的應(yīng)用上。現(xiàn)在纖維素酶已被廣泛地應(yīng)用于食品、釀酒、飼料加工、紡織、洗衣、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等多個領(lǐng)域中。1.3.1纖維素酶在食品加工行業(yè)的應(yīng)用纖維素酶

5、在食品加工行業(yè)應(yīng)用極為廣泛。在果蔬加工行業(yè)中，纖維素酶用來軟化植物組織。和一般的加熱蒸煮、酸堿處理等方法相比，采用纖維素酶處理可以避免營養(yǎng)物質(zhì)特變是維生素的流逝。采用纖維素酶水解法對海藻粉進(jìn)行前處理可以提高海藻脂質(zhì)的抽提率，充分獲取海藻中的脂質(zhì)資源，同時降低生產(chǎn)成本。在油料作物加工中，傳統(tǒng)的壓榨法和有機(jī)溶劑法生產(chǎn)的油制品存在質(zhì)量差產(chǎn)量點(diǎn)的缺點(diǎn)。用纖維素酶代替有機(jī)溶劑進(jìn)行加工，可以避免有機(jī)溶劑的殘留，因而能提高產(chǎn)品質(zhì)量;另外酶反應(yīng)條件溫和，可以避免劇烈條件對產(chǎn)品質(zhì)量的影響，同時也降低了生產(chǎn)成本。在釀酒行業(yè)中，原材料中纖維素含量很高，加入纖維素酶，使纖維素能轉(zhuǎn)換為糖，原料利用率大大提高，且殘?jiān)鄬?/p>

6、銳減，不僅提高了產(chǎn)量，同時使殘?jiān)幚淼墓ぷ髁繙p少，極大的提高了經(jīng)濟(jì)效益。1.3.2纖維素酶在飼料工業(yè)中的應(yīng)用由于家禽家畜一般難消化利用纖維素和半纖維素。而在飼料中加入纖維素酶制劑后，使纖維素和半纖維素轉(zhuǎn)化為易吸收利用的糖類，使飼料得以充分的利用，同時也避免纖維素和半纖維素在動物體內(nèi)累積，促進(jìn)動物的消化吸收。1.3.3纖維素酶在紡織工業(yè)中的應(yīng)用近年來，人們通過微生物工程技術(shù)，利用纖維素酶對紡織品進(jìn)行后處理。因?yàn)槔w維素酶能使麻、棉這類富含纖維素的物質(zhì)表面剝離和縱向復(fù)合細(xì)胞間層侵蝕，使纖維梢絲束化或者脫落，因此，經(jīng)纖維素酶處理過的織物比較蓬松、豐滿、柔軟、滑爽，且懸垂性好，吸濕性強(qiáng)，具有一定的絲光效

7、果。有效地提高了棉麻織物的服用性能及產(chǎn)品的檔次。1.3.4環(huán)境保護(hù)和纖維素廢料處理自然界和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中都有大量含纖維素的廢物，如木屑、廢紙等纖維濾渣，這些廢料經(jīng)理化方法處理后易于酶解17，就可以用纖維素酶將其水解。如利用纖維素酶處理秸桿、蔗渣等農(nóng)業(yè)廢料生產(chǎn)葡萄糖，再經(jīng)過發(fā)酵可生產(chǎn)甲醇、乙醇等工業(yè)物質(zhì)，這些不僅是重要的化工原料，還可以替代汽油等作為燃料解決日益緊張的能源問題。1.3.5在醫(yī)藥中的應(yīng)用中草藥所含成分十分復(fù)雜，既有有效成分，又有無效成分和有毒成分。為了提高中草藥的治療效果，就要盡最大限度提取有效成分，去除無效成分及有毒成分。因此，中草藥提取對于提高中藥制劑的內(nèi)在質(zhì)量和臨床療效最為重要

8、。但常用的提取方法(如煎煮法、回流法、浸漬法、滲流法等)在保留有效成分，去除無效成分方面，存在著有效成分損失大、周期長、工序多等缺點(diǎn)。近年來，用于中藥提取方面研究較多的是纖維素酶，該方法的應(yīng)用，使得中草藥提取既符合傳統(tǒng)的中醫(yī)理論，又能達(dá)到提高有效成分的收率和純度的目的。大部分的中藥材的細(xì)胞壁是由纖維素構(gòu)成，植物的有效成分往往包裹在細(xì)胞壁內(nèi)，用纖維素酶酶解可以使植物細(xì)胞壁破壞，有利于有效成分的提取。1.4纖維素酶的分離純化基本用于分離蛋白質(zhì)的方法都可以用來分離纖維素酶。纖維素酶常用的分離純化方法有:有機(jī)試劑沉法、鹽析法、電泳法、離子交換層析法、分子篩層析法等。無水乙醇和丙酮是最常用來沉淀的有機(jī)溶

9、劑，沉淀再經(jīng)離心分離、風(fēng)干，即得到較純的酶制劑。鹽析常用的試劑為硫酸按，操作簡單，缺點(diǎn)是存在酶活的損失，且除鹽困難15。電泳法和離子交換法都是依據(jù)物質(zhì)的酸堿性、極差的差異，通過離子間的交換吸附實(shí)現(xiàn)組分分離的方法，缺點(diǎn)是當(dāng)雜質(zhì)與所要分離的物質(zhì)具有相類似的極差時，難以分離出雜質(zhì)。分子篩層析是利用具有一定孔徑的分子篩對物質(zhì)按分子大小進(jìn)行分離，方法簡便，缺點(diǎn)是當(dāng)雜質(zhì)和所分離物質(zhì)分子大小接近時，達(dá)不到分離的目的。除了以上常用的分離方法外，雙水相萃取技術(shù)、色譜技術(shù)也應(yīng)用于纖維素酶的分離。雙相萃取技術(shù)又稱水溶液兩相分配技術(shù)，分離過程溫和，酶不易被破壞，且不需要苛刻的條件16。纖維素酶本身就是一個多組分的酶系

10、統(tǒng)，實(shí)際生產(chǎn)中又不可避免得引入一些雜質(zhì)，因此，要得到純組分的纖維素酶，往往需要多種分離手段聯(lián)合應(yīng)用才能實(shí)現(xiàn)。2.產(chǎn)生纖維素酶的微生物纖維素酶的來源很廣泛，真菌，細(xì)菌，放線菌等均有能產(chǎn)生纖維素酶。細(xì)菌有纖維粘菌(CytoPHaga)和纖維桿菌(Cellulomonas)等。放線菌主要有玫瑰色放線菌 (A.Roseus)和纖維放線菌 (A.Cellulase)，鏈霉屬放線菌等。不同微生物合成的纖維素酶在組成上有顯著的差異，對纖維素的酶解能力也不大相同。放線菌的纖維素酶產(chǎn)量極低，研究很少。細(xì)菌的產(chǎn)量也不高，主要是葡聚糖內(nèi)切酶，且大多數(shù)對結(jié)晶纖維素沒有活性，所產(chǎn)生酶是胞內(nèi)酶或吸附在菌壁上，很少能分泌到

11、細(xì)胞外，增加提取純化難度，在工業(yè)上很少應(yīng)用。目前國內(nèi)外最主要的還是利用真菌來發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶。真菌具有產(chǎn)酶的諸多優(yōu)點(diǎn):產(chǎn)生纖維素酶為胞外酶，便于酶的分離和提取;產(chǎn)酶效率高，且產(chǎn)生纖維素酶的酶系結(jié)構(gòu)較為合理;同時可產(chǎn)生許多半纖維素酶、果膠酶、淀粉酶等。真菌纖維素酶主要有木霉 (Trichoderm)青霉(penicillium)、曲霉(Aspergillus)以及腐質(zhì)霉(Humicola)等。其中研究得比較深和透徹的是木霉屬(Trichoderma)和曲霉 (Aspergillus)，綠色木霉和黑曲霉被公認(rèn)是產(chǎn)纖維素酶最穩(wěn)定和無毒安全的菌種，且其產(chǎn)生的是胞外酶對研究纖維素酶的性質(zhì)以及分離純化等都比

12、較方便。2.1綠色木酶簡介綠色木霉(Trichoderma viride)為腐生菌，主要存在于朽木、枯枝、落葉、土壤、有機(jī)肥、植物殘體和空氣中。其分生抱子通過空氣傳播。菌株在馬鈴薯一葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上廣鋪，最初為白色致密的基質(zhì)菌絲，而后出現(xiàn)棉絮狀氣生菌絲，并形成密實(shí)產(chǎn)抱叢束區(qū)，常排成同心輪紋。深黃綠色至深藍(lán)綠色的產(chǎn)抱區(qū)，菌落反面無色，老的培養(yǎng)基散發(fā)一股椰子氣味，菌絲透明，壁光滑，有隔，分枝繁復(fù)，直徑1.512m，透明。厚垣抱子間生于菌絲中頂生于短側(cè)枝上，多數(shù)為球形，極少為橢圓形，透明，壁光滑，直徑可達(dá)14m，通常在基底菌絲中產(chǎn)生.分生抱子梗的特征同屬的特征。小梗瓶形或錐形，基部稍窄，中部較寬，

13、從中部以上變窄成長頸，近于直或中部彎曲，814×2.54.5m，分生抱子大多為球形，直徑254.5m，少數(shù)抱子為短倒卵形，45×3.54m，抱壁具明顯的小擾狀突起，在顯微鏡下單個抱子淡綠色。在分生抱子梗分枝上聚成的孢子頭89林m。綠色木霉生產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)量比較高，可以通過物理或化學(xué)誘變獲得高產(chǎn)菌株，能夠穩(wěn)定地用于生產(chǎn);該霉菌要求的生長環(huán)境粗放，適應(yīng)性較強(qiáng)，易于控制，便于管理;綠色木霉產(chǎn)生的纖維素酶穩(wěn)定性比較好，培養(yǎng)和控制比較容易;該霉菌分泌的纖維素酶是胞外酶，易于分離純化;另外，綠色木霉及其代謝物安全無毒，不會對操作人員和環(huán)境造成不良的影響。因此，綠色木霉是目前用于纖維素酶生

14、產(chǎn)的最普遍的菌種之一。2.2黑曲霉簡介黑曲霉是半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，曲霉屬的一種常見真菌（曹澍澤等，1992）。廣泛分布于植物性產(chǎn)品、籽實(shí)和土壤中，可生產(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、單寧酶、葡萄糖氧化酶、檸檬酸、葡糖酸和沒食子酸等，是一種重要的發(fā)酵工業(yè)菌種。目前, 國內(nèi)外對纖維素酶的研究多集中于木霉。但是木霉毒性嫌疑大, 在食品發(fā)酵工業(yè)和飼料工業(yè)中的應(yīng)用受到限制,而黑曲霉被認(rèn)為是不會產(chǎn)生毒素的纖維素酶產(chǎn)生菌?，F(xiàn)已被許多國家批準(zhǔn)作為食品用酶制劑生產(chǎn)菌，國外已實(shí)現(xiàn)黑曲霉酶制劑商品的工業(yè)化生產(chǎn)33.生產(chǎn)纖維素酶的工藝介紹纖維素酶的生產(chǎn)主要有固體發(fā)酵和液體發(fā)酵兩種方法，生產(chǎn)原

15、料有麩皮、秸稈粉、廢紙、玉米粉和無機(jī)鹽等。3.1纖維素酶的發(fā)酵工藝3.1.1固態(tài)發(fā)酵隨著固體發(fā)酵生產(chǎn)線的相繼建成投產(chǎn)，以及市場競爭對低成本高產(chǎn)出的迫切需求，固體發(fā)酵已日益受到注目。固態(tài)發(fā)酵是指利用不溶性原料作為固體支持物和營養(yǎng)物質(zhì)，體系無自由流動液體，在其上進(jìn)行的任何發(fā)酵過程4。固態(tài)發(fā)酵歷史悠久，應(yīng)用廣泛，是人類利用微生物生產(chǎn)產(chǎn)品歷史最悠久的技術(shù)之一。自20世紀(jì)90年代以來，隨著能源危機(jī)和環(huán)境問題的日益嚴(yán)重，人們重新開始審視固體發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)，并不斷在原料、工藝和設(shè)備等方面進(jìn)行大量深入的研究，使固態(tài)發(fā)酵在酶制劑領(lǐng)域取得了長足的進(jìn)展5。其工藝流程如下斜面試管小三角瓶培養(yǎng)大三角瓶培養(yǎng)種子罐培養(yǎng) 原料

16、粉碎 配料 混合蒸煮滅菌冷卻接種（稻草等） （麩皮、營養(yǎng)鹽等） 成品包裝干燥過濾鹽析濃縮過濾浸提固體發(fā)酵3.1.2液體發(fā)酵液體發(fā)酵法是將玉米秸桿粉碎至20目以下進(jìn)行滅菌處理，送入發(fā)酵釜內(nèi)發(fā)酵，同時加入纖維素酶菌種，發(fā)酵時間約70h，溫度低于60。采用無菌空氣從釜底通入進(jìn)行通氣攪拌，發(fā)酵完的物料經(jīng)壓濾機(jī)壓濾，超濾濃縮和噴霧干燥后制得纖維素酶產(chǎn)品。其生產(chǎn)工藝流程下圖所示。斜面試管小三角瓶培養(yǎng)大三角瓶培養(yǎng)種子罐培養(yǎng) 原料 粉碎 配料 混合蒸煮滅菌冷卻接種（稻草等） （麩皮、營養(yǎng)鹽等） 成品包裝噴霧干燥超濾濃縮壓濾液體深層發(fā)酵此法具有原料利用率高、生產(chǎn)條件易控制、勞動強(qiáng)度小、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、不易染菌、生

17、產(chǎn)效率高等特點(diǎn)，但缺點(diǎn)是動力消耗大、設(shè)備要求高。目前，應(yīng)用于生產(chǎn)纖維素酶的菌種主要是木霉、黑曲霉和變異青霉等，其中木霉應(yīng)用最廣泛。纖維素酶的生產(chǎn)和其它酶制劑一樣，可采用液體培養(yǎng)(包括液體淺盤培養(yǎng)和深層通氣培養(yǎng))和固體培養(yǎng)(包括固體淺盤培養(yǎng)和厚層通風(fēng)培養(yǎng))兩種。美國在原有的液體培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上發(fā)展出了流加培養(yǎng)法、分批發(fā)酵法、連續(xù)發(fā)酵法、二次發(fā)酵法以及細(xì)胞循環(huán)法等等6。從現(xiàn)有的研究結(jié)果來看，纖維素酶的生產(chǎn)以固態(tài)發(fā)酵居多，而且較為經(jīng)濟(jì)合理。其原因主要有以下幾個方面:(1)固態(tài)發(fā)酵能耗低，一般不需攪拌，只需通入少量低壓無菌空氣。液態(tài)發(fā)酵的通氣量比固態(tài)發(fā)酵大得多，而且進(jìn)氣壓力也較高。另外培養(yǎng)液粘度大，氧

18、的傳質(zhì)困難，需要消耗大量的動力做攪拌功;(2)固態(tài)發(fā)酵原料及培養(yǎng)條件比較粗放，成本較低;(3)固態(tài)發(fā)酵設(shè)備投資少，后處理簡單，基本無污染。液態(tài)發(fā)酵設(shè)備投資大，技術(shù)要求高，需要排放大量污水。(4)大量的實(shí)驗(yàn)表明，由于絲狀真菌的菌絲體在固態(tài)發(fā)酵中能夠很好地與纖維質(zhì)原料結(jié)合，因此，固態(tài)發(fā)酵的酶活要比液態(tài)發(fā)酵高。當(dāng)然，固態(tài)發(fā)酵也存在著一些不足:機(jī)械化程度低，勞動強(qiáng)度大;產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，重復(fù)性差等。3.2工藝條件對纖維素酶活性的影響3.2.1原料的影響微生物生長需要從外界獲得營養(yǎng)物質(zhì)，這些物質(zhì)包括碳源，氮源，無機(jī)鹽，生長因子和水分。作為發(fā)酵培養(yǎng)基的原料必須提供微生物生長所需的全部營養(yǎng)物質(zhì)，才能保證生長發(fā)

19、酵過程的實(shí)現(xiàn)。常用的碳源有玉米芯，鼓皮，秸稈，稻草粉，可溶性淀粉等;常用的氮源有硝酸按，硫酸按，酵母膏，尿素，蛋白陳等。楊盛等分別以玉米芯鼓皮比例為2:1-6:1，采用綠色木酶與黑曲霉混合發(fā)酵，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在玉米芯與鼓皮比例為4:1時酶活最高，而且鼓皮比例越高酶活越低，以此推斷出鼓皮只能作為添加碳源，加入過多會對纖維素酶的形成產(chǎn)生抑制，加入越多，抑制越強(qiáng)。以鼓皮和玉米芯為碳源，酵母膏為氮源，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)碳氮比為5:1時，酶活最高7。原料營養(yǎng)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)對微生物生長同樣存在影響，對營養(yǎng)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行有效的改造往往能提高整個微生物生長發(fā)酵過程的效率。通常的預(yù)處理方法包括物理法、化學(xué)法、生物法及上述方

20、法的綜合利用8。預(yù)處理提高發(fā)酵效率的同時也引入了新的工序，因此應(yīng)從經(jīng)濟(jì)效益出發(fā)，選擇合理的預(yù)處理方法。許憲松等研究發(fā)現(xiàn)，將稻殼通過300W的微波處理7min候發(fā)酵，可以得到最高的酶活。但以單位能耗產(chǎn)生的德酶活增加量記，以處理5min時產(chǎn)生的酶活增加量為最高9。3.2.2溫度的影響各種菌種都有其相適應(yīng)的生長溫度。大多數(shù)霉菌生長最適宜的溫度為25一30，在0以下，生長緩慢甚至處于休眠狀態(tài)，而溫度過高時會使其生長繁殖受抑制甚至死亡。王儀明等在不同的溫度下利用綠色木霉固態(tài)發(fā)酵，結(jié)果顯示在35時酶活最高，產(chǎn)Cl酶活力最大為2.38U/mg，產(chǎn)CMC酶活力最大為1.97U/mg，F(xiàn)PA酶活力最大為0.47

21、U/mg，產(chǎn)-葡萄糖營酶活力最大為0.32u/mg10?；炀l(fā)酵中存在多種菌種，其生長產(chǎn)酶的適宜溫度又不盡相同。因此必須通過實(shí)驗(yàn)，選擇合適的溫度，使各菌種之間得以協(xié)調(diào)，達(dá)到互相補(bǔ)充互相促進(jìn)的目的。有的菌種在不同的生長階段所需的事宜溫度也不同，以至于需要采用變溫培養(yǎng)。劉薇等采用串珠霉與鏈霉菌混合發(fā)酵，通過4種方案考查溫度對混菌發(fā)酵的影響:第1組:始終28;第2組:始終37;第3組:先37發(fā)酵緒論4d，再28發(fā)酵Zd;第4組:先28發(fā)酵4d，再37發(fā)酵2d。均在發(fā)酵第6d測酶活。結(jié)果顯示第3組方案的酶活最高:CMC酶、FPA酶和pG酶酶活分別為 3162IU/mL、1151IU/mL、2148lU

22、/mL11。3.2.3pH值的影響和溫度一樣，微生物生長有其適宜的酸堿環(huán)境。細(xì)菌生長環(huán)境的pH值為6.5-7.5，放線菌適宜生長的pH值為7.5-8.0，酵母菌和霉菌的適宜pH值大約為6.0-6.5。pH過高過低都會抑制微生物的生長繁殖，超過一定范圍甚至能導(dǎo)致微生物死亡。鄺哲師等利用玉米秸稈和玉米芯為原料，采用里氏木霉固態(tài)發(fā)酵的方法考察其發(fā)酵條件，結(jié)果表明，在自然pH值(pH=5.5-6.0)和弱酸的環(huán)境下 (pH=4.5-5.5)時，產(chǎn)纖維素酶濾紙酶活較高，達(dá)到32003500U/mL的水平;而在偏堿(pH=7.0-7.5)的環(huán)境下，產(chǎn)纖維素酶濾紙酶活較低，為25002800U/ml12。林

23、捷等以木薯渣為原料，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)考察初始pH值，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)基裝量，接種量對纖維素分解菌混合發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，通過極差分析顯示，初始pH對產(chǎn)酶的影響最大 13。3.2.4水分的影響水分是微生物生長不可或缺的物質(zhì)。而在固態(tài)發(fā)酵中，水分的量是有限的。選擇合適的水分比例，在固態(tài)發(fā)酵中顯得尤為重要。由于固體發(fā)酵是好氧發(fā)酵，水分過多，會影響透氣性，使培養(yǎng)基內(nèi)部散熱難，且易造成雜菌污染，制曲發(fā)酵困難，產(chǎn)品酶活力下降。水分過小，則可能會滿足不了菌種生長的需要，造成產(chǎn)酶活力低下。劉海德等通過實(shí)驗(yàn)對纖維素酶菌與蛋白酶菌混合培養(yǎng)的條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示在培養(yǎng)基含水量為40%-50%時，酶活較低，纖維素酶活為493

24、0U/g，木聚糖酶活為 4013U/g;在培養(yǎng)基含水量為51%-55%時，酶活力大幅度提高，纖維素酶活為7946U/g，木聚糖酶活為4054U/g;而當(dāng)培養(yǎng)基含水量上升到60%時，酶活力略有下降，纖維素酶活為7761U/g，木聚糖酶活為3896U/g。培養(yǎng)基含水量的選取和原料纖維素的含水量有關(guān)。張冬艷等通過研究發(fā)現(xiàn)以麥秸為原料時，料水比1:1.5的條件下產(chǎn)酶活力最高，而玉米秸產(chǎn)最高酶活的料水比為1:2，酒糟產(chǎn)最高酶活的料水比為1:114。4.存在問題纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)在我國尚屬起步階段, 市售產(chǎn)品均為粗制酶, 而精制酶基本上依靠進(jìn)口。造成這一現(xiàn)象主要是因?yàn)槔w維素酶發(fā)酵菌種活力不高, 發(fā)酵

25、后處理技術(shù)不夠成熟。纖維素酶生產(chǎn)過程中濃縮工藝前承浸提工藝, 后接溶劑提取工藝, 是重要的生產(chǎn)環(huán)節(jié)。如果生產(chǎn)產(chǎn)品為液體酶, 則生產(chǎn)工藝將直接至濃縮環(huán)節(jié)結(jié)束。因此, 濃縮技術(shù)已成為影響我國纖維素酶精制的原因之一。5.改進(jìn)辦法5.1濃縮方式的選擇在濃縮工藝設(shè)計(jì)中, 以下2 個基本問題值得我們重視:（1）由于酶浸提液中纖維素酶的摩爾分?jǐn)?shù)僅為8 9 , 而要從如此低濃度的混合物中分離出純纖維素酶, 則需要消耗較大的能量。因此, 必須尋找一種操作可行且能耗較低的濃縮方式來濃縮纖維素酶浸提液, 以減少濃縮過程的能耗。（2）由于酶是一種具有高度催化活性的特殊蛋白質(zhì), 在濃縮操作中, 還必須嚴(yán)格防止酶的變性失

26、活, 以最大限度地提高產(chǎn)品收率。目前, 酶液的濃縮方法主要有3 種: 試劑濃縮、減壓濃縮法和超濾濃縮法。試劑濃縮工藝可用聚乙二醇( PEG) 吸收酶液中的水分, 該法簡便、效率高, 但試劑價格較貴, 作為工業(yè)化生產(chǎn)因成本問題則不予考慮; 減壓蒸發(fā)濃縮法采用減壓裝置使待濃縮酶液在一定的真空度和溫度下進(jìn)行, 對酶液等熱敏性物質(zhì), 減壓裝置多采用離心薄膜蒸發(fā)器和刮板式蒸發(fā)器; 超濾濃縮法是在常溫、無相變時的濃縮過程, 在加壓條件下, 將濃縮液通過一層只允許水分子等小分子選擇性透過的微孔超濾膜, 而酶大分子被滯留, 從而達(dá)到酶液濃縮的目的。5.2 超濾工藝5.2.1 超濾濃縮原理及影響因素超濾膜具有不

27、對稱結(jié)構(gòu)( 稱為不對稱膜) 。表面為活性層, 起過濾作用, 孔隙直徑約為100 nm, 厚度為012 015 Lm; 底部為支撐層, 起支持活性層的作用, 孔隙直徑為011 110 Lm, 厚度為50 100 Lm。由于活性層很薄, 流體阻力較小且不易使孔道阻塞,因而, 顆粒就被截留在膜的表面。膜分離實(shí)質(zhì)是由于物質(zhì)通過膜的傳遞速度的不同而得到分離。超濾過程是一種以壓力為推動力的膜分離技術(shù), 溶質(zhì)或懸浮物料按粒徑大小不同進(jìn)行分離, 比膜孔小的物質(zhì)和溶劑( 水) 一起透過膜, 而較大的物質(zhì)則被截留。能否采用超濾濃縮工藝, 與膜的特性( 空隙度、圓柱形孔道直徑、厚度) 、操作條件 (膜兩側(cè)壓力差、溫

28、度) 、溶液性質(zhì)( 濃度、黏度、pH)等均有直接關(guān)系。此外, 對于生物高分子酶, 會因強(qiáng)力攪拌或高速沖刷而使酶活力損失 3- 4 , 故只能根據(jù)酶的特性適當(dāng)控制流速。5.2.2 工業(yè)化生產(chǎn)纖維素酶使用超濾濃縮的可行性超濾濃縮在常溫或略偏低溫且無相變的情況下進(jìn)行, 操作壓力為低壓( 約0125MPa) , 對熱敏性物質(zhì)的影響很小, 可保證酶不易失活。影響超濾濃縮的壓力、溫度、pH、流體剪力等均可以通過適當(dāng)?shù)墓に嚵鞒淘O(shè)計(jì)和操作控制來滿足生產(chǎn)要求, 防止對酶活力的影響。而就溶質(zhì)分子大小來看, 纖維素酶中的C1、Cx酶的相對分子質(zhì)量為45 000 75 000, 相當(dāng)于球形直徑為350 760 nm,

29、 而超濾適用阻截溶質(zhì)的相對分子質(zhì)量為500 300 000, 溶質(zhì)直徑相當(dāng)于1004 800 nm, 纖維素酶分子恰在超濾膜的切割范圍之內(nèi)。就工業(yè)化生產(chǎn)而言, 超濾具有能耗低、生產(chǎn)成本低等特點(diǎn), 適合于生產(chǎn)酶制劑。因此, 只要選擇合適的膜及其膜組件, 采用超濾法濃縮纖維素酶浸提液應(yīng)當(dāng)是完全可行的。5.2.3 超濾組件的選用目前應(yīng)用在酶制劑濃縮工藝上的超濾組件主要有外壓管式、卷式和中空纖維式3 種。通過對過濾膜表面積、操作難易程度和價格等方面的比較, 設(shè)計(jì)選用中空纖維式超濾組件。中空纖維超濾裝置的特點(diǎn)是運(yùn)用成束( 千根以上) 堅(jiān)實(shí)的中空纖維, 每根纖維內(nèi)腔直徑為012 mm。這些纖維是由惰性的非

30、離子聚合物制成, 具有獨(dú)特的多向異性的結(jié)構(gòu), 故有非常高的流率和抗阻塞性能, 當(dāng)介質(zhì)以軸流形式通過管腔時, 將會在超濾膜面上形成剪切力。因此, 在截留溶質(zhì)分子的同時, 可以將濃差極化降到最低限度。目前用于超濾過程的膜材料主要有: 醋酸纖維 (CA) 、聚砜( PS) 、聚氯乙烯( PVC) 、聚丙烯腈( PAN)和聚砜酰胺( PSA) 等。從膜的耐溫、純水透過量、酶液透過量、使用壽命以及強(qiáng)度等多方面綜合考慮, 宜選用聚砜酰胺膜。5.2.4 工藝流程設(shè)計(jì)超濾膜及其組件確定后, 根據(jù)超濾膜濃縮的原理、影響因素以及酶的生物特性, 為保證酶活力的前提下最大限度地提高堿性纖維素酶的收率, 在工藝流程設(shè)計(jì)

31、中從以下方面采取了一定措施:(1) 采用低溫超濾以減少酶失活, 選用具有冷卻裝置的循環(huán)罐;(2) 將料液預(yù)過濾以除去較大的粒子, 減少膜的負(fù)荷及減輕污染, 同時設(shè)置清洗設(shè)施;(3) 為避免經(jīng)過泵的剪切力使酶失活, 選用剪切力低的泵代替離心泵, 如采用工業(yè)軟管泵等;(4) 配置稀堿和醋酸罐, 以便調(diào)節(jié)酶液pH, 避免pH 對酶的阻流率和活性的影響;(5) 在管道配置方面, 酶液循環(huán)管口需由上部向下插入循環(huán)罐液面, 避免產(chǎn)生泡沫而引起酶的界面失活。2.產(chǎn)品方案及工藝流程2.1產(chǎn)品與產(chǎn)量的確定產(chǎn)品方案明細(xì)表產(chǎn)品名稱 年產(chǎn)量 / t日產(chǎn)量 / t全年生產(chǎn)天數(shù) / d酒精工業(yè)用酶2500.758330飼

32、料添加酶2500.7583302.2工藝流程2.2.1原輔料及菌種（1）原料：玉米秸稈、麥麩（2） 輔料：酵母膏、木質(zhì)纖維、蛋白胨、(NH4) 2SO4、泡敵、CaCl2·2H2O、Tween-80、KH2 PO4（3）菌種：黑曲霉2.2.2工藝流程圖原料餅粕等原料原料淀粉質(zhì)原料按不同原料做不同處理凈化、粉碎水解配制培養(yǎng)基（滅菌）原始菌種試管斜面培養(yǎng)（活化）搖瓶等分級擴(kuò)大培養(yǎng)種子罐培養(yǎng)發(fā)酵罐（液體發(fā)酵）麩皮等原料配制培養(yǎng)基（滅菌）發(fā)酵池（固體發(fā)酵）成品曲發(fā)酵液培養(yǎng)（發(fā)酵）防腐劑、助濾劑（或凝聚劑）除菌體（傾析、過濾、離心）用水抽提棄去濾渣酶液添加澄清促進(jìn)劑過濾、離心濃縮后加溶劑鹽析加

33、Na2SO4或硫酸銨沉淀酶粒狀酶制劑加粘合劑干燥粉碎、過篩、加填料精制酶粉添加穩(wěn)定劑防腐劑稀釋酶液真空濃縮液體酶制劑噴粉（添加充料）粉碎、過篩粗制酶粉固體粗酶制劑2.2.3操作要點(diǎn)（一）菌種培養(yǎng)（1）菌種及菌種保存一般選用的菌種為黑曲霉，發(fā)酵周期為90h左右，纖維素酶產(chǎn)量高且穩(wěn)定性好，產(chǎn)生的纖維素酶為胞外產(chǎn)物，容易分離純化。一般黑曲霉菌種用馬鈴薯瓊脂（PDA）培養(yǎng)基保藏。（2）菌種活化5馬鈴薯瓊脂（PDA）培養(yǎng)基滅菌冷卻至30左右時，在無菌條件下將保藏的原菌接種到培養(yǎng)基中，在2830的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，取出后于04保存?zhèn)溆?。?）種子培養(yǎng)基及種子罐培養(yǎng)玉米秸稈粉(20目篩) 1%、酵母膏

34、 0.05%、木質(zhì)纖維1%、蛋白胨0.3%、MgSO4·7H2O 0.03%、 KH2 PO4 0.4%、CaCl2·2H2O 0.03% 、(NH4) 2 SO4 0.2% 、Tween-80 0.02%（體積比）,121下滅菌30min后使用。菌種活化后按7%的接種量接種到一級種子罐中通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后再接種至二級種子罐中，培養(yǎng)48h后按7%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵6。（二）發(fā)酵過程（1）發(fā)酵培養(yǎng)基的配制 發(fā)酵培養(yǎng)基的組成5玉米秸稈粉19.5%、麥麩5%、酵母膏 0.05%、蛋白胨0.3%、MgSO4·7H2O 0.03%、KH2 PO4 0.4

35、%、CaCl2·2H2O 0.03% 、(NH4) 2 SO4 1.5% 、Tween-80 0.8%（體積比）,121下滅菌30min后使用。 配制培養(yǎng)基的注意事項(xiàng)1I碳源 纖維素酶發(fā)酵大多采用含有纖維素的原料作為碳源。一般是將玉米秸稈粉碎至20目以下后與麥麩等其他輔料混合。麥麩對菌種產(chǎn)酶的影響是雙面的：它一方面為產(chǎn)酶提供必要的生長因子；另一方面，其含量增加又會降低培養(yǎng)基的蓬松程度，使通氣量降低，從而影響產(chǎn)酶。對于黑曲霉，當(dāng)玉米秸稈與麥麩之比為4:1時纖維素酶的產(chǎn)量最高7。II氮源 可用無機(jī)氮，也可用有機(jī)氮，二者差別不大。黑曲霉的最適氮源為硫酸銨和谷氨酸鈉，硫酸銨價格較便宜，因此選

36、用硫酸銨，用1.5%濃度效果較佳。III. 細(xì)胞通透性 增加細(xì)胞通透性對提高纖維素酶活性有一定的作用。一般認(rèn)為Tween-80可以提高黑曲霉的纖維素酶的產(chǎn)量，添加量為0.8%。培養(yǎng)基的配制是在拌料罐中進(jìn)行的。預(yù)先在拌料罐中添加所需質(zhì)量的各種成分，然后加入培養(yǎng)基中所有用水量的60%左右，使最終兩個發(fā)酵罐中的裝料量為14.26 m3。用攪拌槳攪勻后用往復(fù)泵泵入兩個發(fā)酵罐中。（2）發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌8由于發(fā)酵罐的體積較小，因此可采用實(shí)罐滅菌的方式進(jìn)行滅菌。滅菌過程采用蒸汽壓為196kPa（表壓）的蒸汽通入發(fā)酵罐中，利用蒸汽冷凝釋放的熱量加熱培養(yǎng)基，以達(dá)到滅菌的目的。實(shí)罐滅菌過程共分為三個階段： 升溫階

37、段采用直接將活蒸汽通入發(fā)酵罐中的方式把培養(yǎng)基由室溫加熱到滅菌溫度。此過程中通入的蒸汽冷凝形成的水可直接補(bǔ)充配制培養(yǎng)基時未加足的水。 保溫階段蒸汽從與培養(yǎng)基相接觸的管道連續(xù)進(jìn)入，從不與培養(yǎng)基相接觸的管道連續(xù)排出。維持一定的滅菌時間，以到達(dá)滅菌的目的。 冷卻階段完成保溫時間后，關(guān)一路排汽，再關(guān)一路進(jìn)汽（次序不能顛倒），最后排汽與進(jìn)汽全部關(guān)閉。然后引入無菌空氣，再打開蛇管的冷卻水，使培養(yǎng)基的溫度降低到合適的溫度，以進(jìn)行接種。（3）發(fā)酵過程中的條件控制 溫度 發(fā)酵前期，培養(yǎng)溫度應(yīng)稍高些，以有利于菌體的生長，黑曲霉一般控制前期培養(yǎng)溫度為30（即最適生長溫度），大約保持12h；進(jìn)入產(chǎn)酶期后，應(yīng)適當(dāng)降低培養(yǎng)

38、溫度，黑曲霉產(chǎn)酶期培養(yǎng)溫度一般為28，較低的溫度有利于提高酶的穩(wěn)定性，延長細(xì)胞產(chǎn)酶時間9。 pH 黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的最適pH為4.65。在實(shí)際的發(fā)酵過程中，隨著微生物的代謝活動，發(fā)酵液的pH值在不斷變化，要根據(jù)其變化嚴(yán)格控制pH值1。 通風(fēng)量 發(fā)酵早期，菌體剛剛萌發(fā)，數(shù)量較少，呼吸強(qiáng)度較弱，耗氧速度較低，應(yīng)控制通氣量為1:0.20.3；進(jìn)入對數(shù)生長期以后，菌體代謝旺盛，呼吸強(qiáng)度提高，細(xì)胞大量分裂，細(xì)胞濃度迅速增加，因此耗氧速度較快，應(yīng)控制通氣量為1:1；產(chǎn)酶時期，細(xì)胞分裂完全，細(xì)胞濃度最大，形成大量的酶蛋白，也消耗大量的氧氣，應(yīng)控制通氣量為1:11。 攪拌 纖維素酶液體深層發(fā)酵中還需要攪

39、拌，以利于熱交換、營養(yǎng)物質(zhì)與菌體均勻接觸，降低細(xì)胞周圍的代謝產(chǎn)物，從而有利于酶的合成。所以，應(yīng)控制整個生產(chǎn)過程的攪拌速度為100150rpm。 泡沫控制發(fā)酵中往往產(chǎn)生較多的泡沫，其存在阻礙CO2排出，影響溶解氧量。生產(chǎn)上一般采用聚氧丙烯甘油醚或泡敵（聚環(huán)氧丙環(huán)氧乙烷甘油醚）消泡。 產(chǎn)酶量的測定發(fā)酵過程中要定時取樣測定產(chǎn)酶量，一旦發(fā)現(xiàn)到達(dá)最大酶活產(chǎn)量時要及時停止發(fā)酵。（4）發(fā)酵終點(diǎn)的判斷一般利用黑曲霉進(jìn)行纖維素酶發(fā)酵的周期為70h左右。當(dāng)發(fā)酵液的pH上升至5左右，鏡檢觀察到菌絲自溶、斷裂，80%以上的菌絲染色著色淺或染不上色時，可以放罐6。一般發(fā)酵的產(chǎn)酶率為6.5%。（二）纖維素酶的分離與提?。?/p>

40、1）發(fā)酵液的預(yù)處理發(fā)酵結(jié)束后要向冷卻蛇管內(nèi)通入蒸汽，使發(fā)酵液溫度升高至90維持10min，滅活菌體并有利于后續(xù)的過濾過程。加熱結(jié)束后將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至發(fā)酵液儲罐中。同時準(zhǔn)備使用板框過濾機(jī)對發(fā)酵液進(jìn)行過濾，以除去菌體和未發(fā)酵的培養(yǎng)基原料。（2）發(fā)酵液過濾 在黑曲霉生產(chǎn)纖維素酶的過程中，在常壓下濾餅形成后，一般采用加壓至0.30.4MPa來過濾。濾液儲存于儲罐中，分四批進(jìn)行后續(xù)的提取過程。生產(chǎn)中常采用以壓力泵或壓縮空氣為過濾推動力的壓濾機(jī)來進(jìn)行過濾。經(jīng)過濾后濾液中的纖維素酶的收率為95%。（3）濃縮將板框過濾后的濾液調(diào)到pH4.5，在40、2.0kPa的條件下利用三效真空蒸發(fā)儀將濾液濃縮至原體積的30

41、40%1，此過程的酶的收率約為95%。（4）沉淀與酶泥的重新溶解在酶制劑的生產(chǎn)過程中，一般采取鹽析法進(jìn)行纖維素酶的分離。首先向濃縮酶液中加0.2飽和度的硫酸銨，靜置1小時后利用板框過濾機(jī)進(jìn)行過濾，棄去沉淀。然后向收集的清液中加入0.6飽和度的硫酸銨，再靜置1小時后過濾棄去清液，得到纖維素酶的粗品。對于應(yīng)用于飼料工業(yè)中的酶制劑，由于硫酸銨沉淀法析出的酶沉淀，含有大量的無機(jī)鹽，不適合用于食品行業(yè)。因此在其生產(chǎn)過程中，應(yīng)該采用有機(jī)溶劑法進(jìn)行纖維素酶的分離。常用纖維素酶沉淀分離的有機(jī)溶劑為乙醇。乙醇的最適濃度為70%。提取酶制劑過程中容易引起酶的變性失活，所以必須在4左右的低溫下進(jìn)行操作，沉淀析出后要

42、立即分離。有機(jī)溶劑用量一般為酶液體積的2倍左右，而且，要將酶液的pH值調(diào)至纖維素酶的等電點(diǎn)附近，再用0.020.05mol/L的磷酸緩沖液溶液溶解后進(jìn)行進(jìn)一步的純化。沉淀過程的酶的收率為94%，過濾過程的收率為95%1。（5）纖維素酶的純化 單寧是纖維素酶的天然抑制劑，用單寧結(jié)合活化的瓊脂糖做成親和層析柱，用蒸餾水平衡，再將上一步得到的酶液過柱，使單寧專一性結(jié)合纖維素酶，蒸餾水平衡后，用0.020.05mol/L的磷酸緩沖液洗脫出來，就可得到純化的液態(tài)纖維素酶1。酶的親和層析一般控制在較低的溫度下進(jìn)行，以防止由于溫度的升高而使酶在純化過程中變性失活。經(jīng)過該過程后酶的損失率為7%。（6）洗脫液的

43、濃縮 由于黑曲霉生產(chǎn)的纖維素酶在60以上活性迅速下降，所以在真空蒸發(fā)濃縮時，應(yīng)控制濃縮系統(tǒng)的真空度，使蒸發(fā)溫度在60以下。在纖維素酶的生產(chǎn)中一般采用真空蒸發(fā)器，在50進(jìn)行真空濃縮，除去約2/3的水分。濃縮后的收率為90%。（三）酶的成品與包裝10（1）液體酶的混合與包裝向經(jīng)濃縮后的液體酶加入1,2-丙二醇，以維持酶制劑的活性。最終產(chǎn)品的顏色為棕色，密度為1.051.1g/cm3，粘度為50 Pa·s，裝于有環(huán)氧樹脂涂覆的容量為200kg的鐵桶中以及容量為25g的手提桶中。（2）固體酶的造粒與包裝將濃縮后的酶液用噴霧干燥法干燥，形成粉狀的酶。固體酶制劑的包裝外要刷明標(biāo)記，包括成品名稱、

44、生產(chǎn)廠家名稱、廠址、生產(chǎn)日期、保質(zhì)期、使用方法、成品標(biāo)準(zhǔn)編號等。（四）成品的儲存包裝后的成品經(jīng)過水平皮帶輸送機(jī)運(yùn)到成品庫中，再由叉車搬運(yùn)到存放的位置。成品庫要求低溫干燥通風(fēng)，庫內(nèi)溫度在025范圍內(nèi)，保質(zhì)期為半年。避免在30以上長期儲存，避免日光暴曬和雨淋。（五）成品質(zhì)量檢測11酶制劑的成品各項(xiàng)指標(biāo)要符合工業(yè)酶制劑通用檢測規(guī)定和標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸、貯存QB/T 1804-93的要求。并按照下述的測定纖維素酶活力的方法測定其CMC酶、FPA（濾紙?zhí)牵┟负虰G酶活性，并用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法來測定該酶制劑的純度與分子量。ICMC酶活的測定5%CMC溶液（pH4.5、0.025mol/L檸檬酸，

45、0.05mol/L磷酸氫二鈉）1.0mL，適當(dāng)稀釋后的酶液1.0mL，40恒溫水浴60min，用3,5-二硝基水楊酸法測定還原糖；IIFPA酶活的測定取適當(dāng)稀釋后的酶液0.1mL，再加入0.2mL磷酸緩沖液（pH6.0）和0.5×0.5濾紙條1張，其余同CMC測定。IIIBG（-1,3-葡萄糖苷酶）酶活的測定取適當(dāng)稀釋酶液0.5mL，加入0.5ml1%水楊酸溶液（溶于pH4.8、0.1mol/LHAc和NaAc緩沖液），50反應(yīng)30min，加入3mLDNS試劑測糖。3.物料衡算黑曲霉的發(fā)酵時間為90h左右，考慮到裝料、實(shí)消、放料、清洗需要一部分時間，因此確定整個發(fā)酵周期為5d，在33

46、0d的工作日內(nèi)，共有66個生產(chǎn)周期。由設(shè)備計(jì)算（3.4.1）可得，生產(chǎn)中共需要30 m3的發(fā)酵罐8個。發(fā)酵罐的裝料系數(shù)為70%，發(fā)酵產(chǎn)率為6.5%，提取率為70%，種子罐的裝料系數(shù)為75%，發(fā)酵液密度約為1020 kg/m3。主要技術(shù)參數(shù)：發(fā)酵時間：90h 生產(chǎn)周期：5d 生產(chǎn)天數(shù)：330d 年產(chǎn)量：500t 預(yù)設(shè)發(fā)酵罐個數(shù)：8個 發(fā)酵罐裝料系數(shù)：70% 發(fā)酵產(chǎn)率：6.5% 酶提取率：70%FPA酶活：46264781 IU/ g3.1原料計(jì)算（1）玉米秸稈 玉米秸稈需經(jīng)過粉碎后才能用于發(fā)酵。在粉碎過程中隨著運(yùn)輸、粉塵等會有原料損失，按10%的損失率及3t/t(原酶)的投料比計(jì)算，可得每次發(fā)酵

47、周期需要的原料玉米秸稈量為：m1 = 發(fā)酵液總質(zhì)量×產(chǎn)酶率×玉米秸稈投料比÷（1損失率）= 8×30×70%5×3×75%×1020×6.5%×3÷（110%）=39.61t則年用量:M1 = 39.61×66= 2614.26t（2）麥麩碳源中玉米秸稈與麥麩的比例為4:1時纖維素酶的產(chǎn)量最高。由此麥麩的用量為：m2 = 玉米秸稈投料量÷4 = 39.61÷4 = 9.90t年用量:M2 = 9.90×66 = 653.4t（3）酵母膏一個發(fā)酵周

48、期中的培養(yǎng)基的總質(zhì)量為：8×30×70%5×3×75%×1020 = 182.835t酵母膏的用量為0.05%，則一個發(fā)酵周期中酵母膏的用量為：m3 = 182.835×0.05% = 91.42Kg年用量：M3 = 91.42×66 = 6.03t（4）木質(zhì)纖維木質(zhì)纖維在種子培養(yǎng)基中充當(dāng)碳源，在發(fā)酵培養(yǎng)基中作為產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑，其用量為1%。一個發(fā)酵周期中木質(zhì)纖維的用量為：m4 = 182.835×1% = 1.828t年用量：M4 = 1.828×66 = 120.65t（5）蛋白胨蛋白胨在培養(yǎng)基中的用量為

49、0.3%，一個發(fā)酵周期中蛋白胨的用量為：m5 = 182.835×0.3%= 0.549t年用量：M5 = 0.549×66= 36.20t（6）MgSO4·7H2O MgSO4·7H2O 的用量為0.03%，一個發(fā)酵周期中MgSO4·7H2O的用量為：m6 = 182.835×0.03% = 0.055t年用量：M6 = 0.055×66 = 3.63t（7）KH2 PO4KH2 PO4 的用量為0.4%，一個發(fā)酵周期中KH2 PO4的用量為：m7 = 182.835×0.4% = 0.731t年用量：M7 =0

50、.731×66 = 48.27t（8）CaCl2·2H2OCaCl2·2H2O的用量為 0.03% ，一個發(fā)酵周期中CaCl2·2H2O的用量為：m8 = 182.835×0.03% = 0.054t年用量：M8 = 0.054×66 = 3.564t （9）Tween-80發(fā)酵培養(yǎng)基中添加量為0.8%（體積比），種子培養(yǎng)基中添加量為0.02%。一個發(fā)酵周期中的使用量為m9 = 8×30×70%×0.8%5×3×75%×0.02%= 1.3463 m3年用量：M9 = 1.3

51、463×66 = 88.85 m33.2輔料計(jì)算（1）硫酸銨 在整個生產(chǎn)工藝中硫酸銨有兩種用途：一種是作為氮源；另一用途是在纖維素酶的沉淀粗提中作為沉淀劑。作為氮源的添加量為1.5%，作為沉淀劑的用量為20%的飽和度和60%的飽和度。由此進(jìn)行計(jì)算： 氮源用量：(NH4) 2 SO4在發(fā)酵培養(yǎng)基中的用量為1.5% ，在種子培養(yǎng)基中的用量為0.2%。一個發(fā)酵周期中 (NH4) 2 SO4的用量為：M10 = 8×30×70%×1020×1.5%5×3×75%×1020×0.2%= 2.593t = 2.6t

52、年用量：M10 = 2.6×66 = 171.6t 沉淀劑用量：在燃料乙醇工業(yè)用酶制劑的生產(chǎn)過程中使用的沉淀劑為硫酸銨，一個發(fā)酵周期中共有4個發(fā)酵罐用于該酶的生產(chǎn)。在提取過程中，發(fā)酵液經(jīng)過過濾后會有部分體積損失，且過濾后的濾液經(jīng)過真空濃縮。因此可估計(jì)過濾后的濾液體積為30×70%×4×80%×40%= 26.88 m3。在用鹽析法分離纖維素酶的過程中，處理液的(NH4) 2 SO4初始飽和度為0，欲達(dá)到20%的飽和度，在25條件下，需向1m3溶液中加入114kg的(NH4) 2 SO4。經(jīng)靜置、過濾處理后，再向?yàn)V液中加入(NH4) 2 SO4，

53、使(NH4) 2 SO4的飽和度由20%上升至60%，此過程應(yīng)向?yàn)V液中加入262kg的 (NH4) 2 SO412。則提取過程中(NH4) 2 SO4的用量為：m11 = 26.88×11426.88×90%×262 = 9403kg = 9.41t年用量：M11 = 9.41×66 = 621.06t(NH4) 2 SO4的總用量為171.6621.06 = 792.66t （2）乙醇乙醇作為飼料添加用酶的沉淀劑，一個發(fā)酵周期中共有4個發(fā)酵罐用于該酶的生產(chǎn)?？晒烙?jì)過濾后的濾液體積也為26.88 m3。沉淀過程中用的為70%的乙醇，用量為處理液體積的兩倍

54、。因此乙醇用量為：m12 = 26.88×2×70%×789 = 29.7t年用量：M12 = 29.7×66= 1960.2t（3）泡敵發(fā)酵培養(yǎng)基中泡敵的添加量為0.03%，一個發(fā)酵周期中的使用量為：m13 = 8×30×70%×0.03%= 0.0504 m3年用量：M13 = 0.039×66 = 3.4m33.3計(jì)算結(jié)果生產(chǎn)物料衡算表項(xiàng)目名稱指標(biāo)每次發(fā)酵周期實(shí)際量年用量原料玉米秸稈3t/t(原酶)39.61t2614.26t麥麩0.75 t/t(原酶)9.90t653.4t酵母膏0.05%91.42Kg6.

55、03t木質(zhì)纖維1%1.828t120.65t蛋白胨0.3%0.549t36.20tMgSO4·7H2O0.03%0.055t3.63tKH2 PO40.4%0.731t48.27tCaCl2·2H2O0.03%0.054t3.564tTween-800.02%/0.8%1.3463 m388.85 m3輔料硫酸銨114/262 kg/ m39.41t792.66乙醇1.4 m3/ m329.7t1960.2t泡敵0.03%0.0504m33.4 m3包裝材 料纖維板圓筒40Kg/桶70個6127個環(huán)氧樹脂涂覆的圓桶25Kg/桶120個9840個4.生產(chǎn)設(shè)備選型4.1主要生產(chǎn)

56、設(shè)備生產(chǎn)能力計(jì)算由物料衡算表可知：為提高后處理過程中使用的設(shè)備的利用率，四組發(fā)酵罐（每兩臺發(fā)酵罐為一組，生產(chǎn)同一種酶）采用循環(huán)式投料生產(chǎn)。（1）玉米秸稈粉碎機(jī)及20目振動篩分器年用量÷處理時間 =2620×1000÷300÷8 = 1091.6kg/h（2）拌料槽拌料槽的結(jié)構(gòu)由圓柱形槽身和圓錐形底部組成，設(shè)計(jì)體積應(yīng)為：發(fā)酵培養(yǎng)基體積/裝料率 = 14.62×2÷85% = 34.4 m3 （取35 m3）設(shè)圓柱形槽身的高為h1，圓錐形底部的高為h2，且h1 = 3h2，直徑d為3m。則由V = 1/4×3.14×d

57、 2×h1+(1/3)×(1/4)×3.14×d 2×h2 = 35m3得：h1 = 4.46m ；h2 = 1.48m拌料罐的實(shí)際體積為：V = 5/18×3.14×3 2×4.46 = 35.011m3（3）發(fā)酵罐設(shè)發(fā)酵罐的體積為V，則由年產(chǎn)酶量 = 發(fā)酵罐體積×發(fā)酵液密度×發(fā)酵罐個數(shù)×發(fā)酵周期數(shù)×發(fā)酵罐裝液量×產(chǎn)酶率×酶提取率可得：發(fā)酵罐的體積 = 500000÷1020÷66÷0.7÷0.065÷8÷0.7 = 29.15m3由此可確定發(fā)酵罐的有效體積為30 m3。發(fā)酵罐主體結(jié)構(gòu)計(jì)算13：封頭采用標(biāo)準(zhǔn)橢圓封頭 K = 1 H/Di = 2.5 Di/hi = 4橢圓容積 Va = /6×Di×hi =×Di3V ×Di2×hiVa = ×Di2×hi×Di3 = 2/3××Di3Di = 2.43 m 處理后內(nèi)徑為2.5 m即2500 mmH = 2.5Di = 2.