抗CD58蛋白單克隆抗體的制備及鑒定

1、抗CD58蛋白單克隆抗體的制備及鑒定    英文題名 Preparation and Identification of Monoclonal Antibodies Against CD58 Protein  關(guān)鍵詞 CD58蛋白; 單克隆抗體; 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA; 英文關(guān)鍵詞 CD58 protein; monoclonal antibody; indirect competitive ELISA; 中文摘要 CD58又名淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-3(LAF-3),在機(jī)體免疫中發(fā)揮重要作用,對(duì)動(dòng)物妊娠早期子宮局部細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)也存在著影響。

2、本試驗(yàn)利用酶消化法結(jié)合柱層析法制備了綿羊紅細(xì)胞表面活性蛋白CD58;通過(guò)小鼠免疫,細(xì)胞融合以及有限稀釋法篩選陽(yáng)性克隆,制備了抗CD58蛋白單克隆抗體,并進(jìn)行了鑒定;建立了檢測(cè)山羊血清中CD58的間接競(jìng)爭(zhēng)抑制性ELISA方法,檢測(cè)了未發(fā)情,發(fā)情和懷孕山羊血清中CD58的含量。獲得以下結(jié)果: 1.酶消化法結(jié)合柱層析法制備了綿羊紅細(xì)胞表面活性蛋白CD58,SDS-PAGE結(jié)果表明制備了高純度的CD58蛋白。玫瑰花環(huán)抑制試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果抑制率為64.68±3.93%。 2.建立了抗CD58蛋白抗體測(cè)定的間接ELISA方法。方陣滴定法確定包被原最適工作濃度為10.0g/mL,最佳的包被溫度和時(shí)間為

3、371h后4過(guò)夜,1.0%明膠封閉,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(酶標(biāo)二抗)最適稀釋倍數(shù)為l3 2 000,作用時(shí)間為30min。 3.用45%聚乙二醇(PEG)4000融合骨髓瘤細(xì)胞和免疫脾細(xì)胞,用間接ELISA法篩選陽(yáng)性孔,克隆率為81.94%,陽(yáng)性克隆率45. 英文摘要 CD58, also known as lymphocyte function-associated antigen -3 (LAF-3), playing an important role in immunization and has an impect on the regulatory function

4、in secretion of the loca-uterine cytokines during early pregnancy. In this study, the surfactant protein CD58 of sheep red blood cells (SRBC) was prepared with enzymatic digestion and column chromatography. The anti-CD58 monoclonal antibodies were prepared by immunization of mice, cell fusion and li

5、mited dilution screening of positive clones 摘要 4-5 ABSTRACT 5-6 第一章 CD58 蛋白和單克隆抗體的研究進(jìn)展 11-19     1.1 CD58 研究進(jìn)展 11-15         1.1.1 基因結(jié)構(gòu) 11-12         1.1.2 CD58 功能研究 12-14        

6、1.1.3 CD58 與EPF 的關(guān)系研究 14         1.1.4 檢測(cè)方法 14         1.1.5 CD58 分子應(yīng)用研究 14-15     1.2 單克隆抗體技術(shù)的研究進(jìn)展 15-19         1.2.1 單克隆技術(shù)的研究 15-16         1.

7、2.2 單克隆抗體的特性 16         1.2.3 單克隆抗體的應(yīng)用 16-19 第二章 CD58 蛋白的制備 19-26     2.1 材料與方法 19-23         2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 19         2.1.2 主要試劑 19         2.1.3 儀

8、器 19         2.1.4 方法 19-23     2.2 結(jié)果 23-24         2.2.1 SDS-PAEG 鑒定結(jié)果 23         2.2.2 玫瑰花環(huán)抑制試驗(yàn)結(jié)果 23-24         2.2.3 樣品提取物中蛋白質(zhì)的濃度 24  &#

9、160;  2.3 討論 24-25     2.4 小結(jié) 25-26 第三章 間接ELISA 法檢測(cè)CD58 抗體方法的建立 26-32     3.1 材料與方法 26-28         3.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 26         3.1.2 主要試劑 26         3.1.3 儀器 26  

10、       3.1.4 血清的制備 26         3.1.5 CD58 蛋白間接ELISA 檢測(cè)方法的建立 26-28         3.1.6 小鼠免疫效果檢測(cè) 28     3.2 結(jié)果 28-31         3.2.1 CD58 蛋白間接ELISA 檢測(cè)方法的建立 28-30

11、         3.2.2 小鼠免疫效果檢測(cè) 30-31     3.3 討論 31         3.3.1 間接ELISA 條件的選擇 31         3.3.2 小鼠免疫的結(jié)果 31     3.4 小結(jié) 31-32 第四章 抗CD58 蛋白的單克隆雜交瘤株的建立 32-40    

12、 4.1 材料與方法 32-36         4.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 32         4.1.2 主要試劑 32         4.1.3 儀器 32         4.1.4 方法 32-36     4.2 結(jié)果 36-38    

13、60;    4.2.1 骨髓瘤細(xì)胞的制備 36         4.2.2 飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備 36         4.2.3 細(xì)胞融合 36         4.2.4 雜交瘤細(xì)胞的形態(tài)觀察 36-37         4.2.5 雜交瘤細(xì)胞株的亞克隆 37   &

14、#160;     4.2.6 雜交瘤細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇 37         4.2.7 雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性的檢測(cè) 37-38     4.3 討論 38-39         4.3.1 骨髓瘤細(xì)胞的狀態(tài) 38         4.3.2 飼養(yǎng)層細(xì)胞 38      &

15、#160;  4.3.3 細(xì)胞融合效率的影響因素 38         4.3.4 雜交瘤細(xì)胞的篩選及克隆 38-39     4.4 小結(jié) 39-40 第五章 抗CD58 蛋白的單克隆抗體的制備及鑒定 40-48     5.1 材料與方法 40-43         5.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 40        

16、 5.1.2 主要試劑 40         5.1.3 主要儀器設(shè)備 40         5.1.4 試驗(yàn)方法 40-43     5.2 結(jié)果 43-46         5.2.1 腹水中抗體蛋白含量的測(cè)定 43         5.2.2 腹水McAb 效價(jià)測(cè)定（ELISA 法）

17、 43         5.2.3 單克隆抗體的純化結(jié)果 43         5.2.4 單克隆抗體亞型的測(cè)定 43-45         5.2.5 單克隆抗體的特異性檢測(cè) 45         5.2.6 單克隆抗體親和常數(shù)測(cè)定 45-46     5.3 討論 46-47 

18、0;       5.3.1 單克隆抗體制備方法的選擇 46-47         5.3.2 單克隆抗體性質(zhì)的分析 47         5.3.3 單克隆抗體親和力 47     5.4 小結(jié) 47-48 第六章 山羊血清中CD58 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)方法的建立 48-53     6.1 材料與方法 48-50  &

19、#160;      6.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 48         6.1.2 主要試劑 48         6.1.3 儀器 48         6.1.4 方法 48-50     6.2 結(jié)果 50-51         6.2.1

20、 腹水抗體工作濃度的測(cè)定結(jié)果 50         6.2.2 簡(jiǎn)接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 50-51         6.2.3 靈敏度的測(cè)定結(jié)果 51         6.2.4 精確度的測(cè)定結(jié)果 51         6.2.5 山羊血清中游離 CD58 含量的檢測(cè)結(jié)果 51   &#

21、160; 6.3 討論 51-52     6.4 小結(jié) 52-53 結(jié)論 53-54 參考文獻(xiàn) 54-60 附錄 試驗(yàn)用液 60-63 致謝 63-64 第六章 山羊血清中CD58 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)方法的建立 48-53     6.1 材料與方法 48-50         6.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 48         6.1.2 主要試劑 48    &#

22、160;    6.1.3 儀器 48         6.1.4 方法 48-50     6.2 結(jié)果 50-51         6.2.1 腹水抗體工作濃度的測(cè)定結(jié)果 50         6.2.2 簡(jiǎn)接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 50-51       

23、  6.2.3 靈敏度的測(cè)定結(jié)果 51         6.2.4 精確度的測(cè)定結(jié)果 51         6.2.5 山羊血清中游離 CD58 含量的檢測(cè)結(jié)果 51     6.3 討論 51-52     6.4 小結(jié) 52-53 結(jié)論 53-54 參考文獻(xiàn) 54-60 附錄 試驗(yàn)用液 60-63 致謝 63-64 第六章 山羊血清中CD58 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)方法的建立 48

24、-53     6.1 材料與方法 48-50         6.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 48         6.1.2 主要試劑 48         6.1.3 儀器 48         6.1.4 方法 48-50     6.2 結(jié)果 50-51 &#

25、160;       6.2.1 腹水抗體工作濃度的測(cè)定結(jié)果 50         6.2.2 簡(jiǎn)接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 50-51         6.2.3 靈敏度的測(cè)定結(jié)果 51         6.2.4 精確度的測(cè)定結(jié)果 51        

26、; 6.2.5 山羊血清中游離 CD58 含量的檢測(cè)結(jié)果 51     6.3 討論 51-52     6.4 小結(jié) 52-53 結(jié)論 53-54 參考文獻(xiàn) 54-60 附錄 試驗(yàn)用液 60-63 致謝 63-64 第六章 山羊血清中CD58 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)方法的建立 48-53     6.1 材料與方法 48-50         6.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 48      &

27、#160;  6.1.2 主要試劑 48         6.1.3 儀器 48         6.1.4 方法 48-50     6.2 結(jié)果 50-51         6.2.1 腹水抗體工作濃度的測(cè)定結(jié)果 50         6.2.2 簡(jiǎn)接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 50-51         6.2.3 靈敏度的測(cè)定結(jié)果 51         6.2.4 精確度的測(cè)定結(jié)果 51