抗－HEV單克隆抗體B4C重鏈可變區(qū)基因的克隆及初步表達(dá)

1、    抗HEV單克隆抗體B4C重鏈可變區(qū)基因的克隆及初步表達(dá)*        關(guān)鍵詞HEV單克隆抗體重鏈可變區(qū)克隆表達(dá)摘要抗HEV87A株單克隆抗體（mAb）B4C經(jīng)體外研究鑒定，證實(shí)對我國暴發(fā)和散發(fā)性HEV毒株有很高的特異性。為從分子水平上了解mAbB4C，我們利用基因工程技術(shù)，從雜交瘤細(xì)胞系中克隆出了重鏈可變區(qū)基因，并對其全部核苷酸序列進(jìn)行了分析，可能屬于小鼠免疫球蛋白重鏈IA亞組。將VHcDNA克隆到高效表達(dá)載體pQE31中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDSPAGE分析，可見1

2、條Mr為16000左右的表達(dá)帶，表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的29.3，主要以包涵體形式存在。中國書資料分類號Q78Cloning and expression of a heavy chain variable region of mAb B4C against HEV Geng Liqing，Liu Minxia，Yuan Xitong，Li Xiaoyu，Huang Rutong，Li Derong(Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850) K

3、eywords HEV mAb heavy chain variable region cloning expression Abstract The monoclonal antibody B4C against HEV strain 87A was proved to be specific to chinese strains of the epidemic and sporadic HEV. The gene of heavy chain variable region was amplified from the hybridoma cells and cloned for sequ

4、ence analysis. It appeared to be in the subgroup IA of mouse immunoglobulin VH. While the VH gene was cloned into a highly expressive vector pQE31 and induced by IPTG, a recombinant protein about 16 000(Mr) was detected by SDSPAGE. The yield was up to 29.3 of the total amount of bacteria protein and

5、 the product was mostly in the form of inclusion bodies. 盡管第二代抗體（mAb）的出現(xiàn)，對生物學(xué)與醫(yī)學(xué)的發(fā)展起了巨大的推動(dòng)作用，但由于人源性mAb的制備技術(shù)尚不完善，來源很困難，目前臨床上診斷、治療用的多為鼠源性mAb，用于人體常?？梢鹑丝故髆Ab的免疫排斥反應(yīng)，嚴(yán)重影響使用效果。近年來隨著生物工程技術(shù)的飛速發(fā)展，人們對已有的鼠源性mAb進(jìn)行改造，研制出單鏈抗體、Fab段、嵌合抗體及重構(gòu)抗體等一系列基因工程抗體，試解決mAb在治療中的免疫排斥反應(yīng)問題。我們將本實(shí)驗(yàn)室研制的具有良好活性的抗?HEVmAbB4C，經(jīng)RTPCR法擴(kuò)增出重鏈可

6、變區(qū)基因，進(jìn)行克隆、測序，并在大腸桿菌中得到高效表達(dá)，為進(jìn)一步研制小分子抗體和嵌合抗體打下基礎(chǔ)。1材料和方法1.1細(xì)胞株、質(zhì)粒及菌株分泌抗HEV87A株mAb的雜交瘤細(xì)胞B4C,是由本實(shí)驗(yàn)室所建立1。pGEMTEasy克隆載體，為Promega公司產(chǎn)品。表達(dá)載體pQE31及宿主菌M15，由本所周育森博士惠贈(zèng)。1.2細(xì)胞總RNA提取及cDNA合成采用酸性異硫氰酸胍酚氯仿一步法2，從8×106B4C雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA，取10g作模板，以1loligo(dT)16(50mol/L)作為反向引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。1.3PCR擴(kuò)增VH基因在50l反應(yīng)體系中，加入10×PCR緩

7、沖液5l，0.2mmol/LdNTP,VH上、下游引物各10pmol/L，cDNA5l，TaqDNA聚合酶2.5U，混勻后，液面加石蠟油封閉進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)。循環(huán)參數(shù)為：94變性1min，55退火1min,72延伸1.5min,反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)在72保溫10min。PCR產(chǎn)物用1.5瓊脂糖凝膠電泳觀察。1.4VH基因的PCR產(chǎn)物的克隆VH基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收純化后，與載體片段按克分子比31（mol/mol)的比例，在T4DNA連接酶催化下，于4連接過夜，轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，在Xgal和IPTG顯色標(biāo)志下，置37孵育12h16h。篩選白色菌落，以堿裂解法提

8、取重組質(zhì)粒，經(jīng)NotI單酶消化鑒定。1.5核苷酸序列的測定將鑒定為陽性的重組子pGEMTEasyVH質(zhì)粒，純化后采用雙脫氧核苷酸鏈末端終止法進(jìn)行序列測定（由北京市朝陽醫(yī)院臨床分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室協(xié)助測定）。1.6重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將酶切鑒定為正向插入的測序質(zhì)粒pGEMTEasyVH7,由PstI單酶切回收386bp的片段，并與PstI單酶切去除5P的pQE31載體連接，轉(zhuǎn)化M15大腸桿菌，篩選正向插入的克隆，作為已構(gòu)建好的pQE31VH表達(dá)質(zhì)粒。1.7大腸桿菌重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將含重組表達(dá)質(zhì)粒pQE31VH的單個(gè)菌落接種于含抗生素的LB培養(yǎng)基中，37活化過夜。次日將1菌液轉(zhuǎn)種于2mlLB培養(yǎng)基中，

9、37振搖至A600=0.40.6。加入IPTG至終濃度為12mmol/L,37誘導(dǎo)3h5h。取1ml誘導(dǎo)表達(dá)菌液離心，回收菌體沉淀，以50l凝膠加樣緩沖液懸浮，煮沸5min，離心后取20l上清進(jìn)行15SDSPAGE，以考馬斯亮蘭染色。2結(jié)果2.1B4C VH基因的PCR擴(kuò)增及克隆鑒定擴(kuò)增VH基因的引物根據(jù)小鼠IgVH基因相對保守的框架區(qū)FR1和FR4序列而設(shè)計(jì)。VH上游引物：（50nt）5GGCGGTGGCGGCTCGGGTGGAGGCGGATCTGT(CG)(AC) A(AG) CTGCAG (CG) AGTC(AT)GG3。VH基因下游引物：（39nt）5CGGGATCCGGAGACGGT

10、GACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG3。VH基因上游引物中，前30個(gè)堿基是為構(gòu)建ScFv與VL基因下游互補(bǔ)形成連接肽Linker而設(shè)計(jì)的。經(jīng)30個(gè)循環(huán)PCR擴(kuò)增后，得到大約390bp大小的清晰條帶（1）。將B4CVH基因PCR產(chǎn)物（約390bp的片段）快速克隆到pGEM?TEasy載體中。因載體上插入片段的兩端各有1個(gè)NotI位點(diǎn)，因此，經(jīng)NotI單酶消化后，VH重組子可得到3.0kb載體片段和420bp左右的插入片段。用PCR方法也可從VH重組子中擴(kuò)增出390bp片段，表明PCR產(chǎn)物已成功地克隆到載體pGEMTEasy中（2）。1B4C重鏈可變區(qū)基因的PCR擴(kuò)增Fig 1 PCR a

11、mplification of B4C VH gene A:PCR product of VH gene; B:pBR322/Hinf I marker 2重組測序質(zhì)粒pGEMTEasyVH的鑒定Fig 2 Identification of recombinant plasmid pGEMTEasyVH A:pBR322/Hinf I marker; B:PCR product of VH from pGEMTEasyVH;C:pGEMTEasyVH/Not I;D:PGEMTEasy/Not I; E: DNA/EcoR IHind III marker 2.2B4CVH核苷酸序列的測定用

12、雙脫氧核苷酸鏈末端終止法自動(dòng)測序，獲得VH基因?yàn)?57bp的核苷酸序列。通過與BLASTN和Kabat數(shù)據(jù)庫中相關(guān)基因比較，該mAbB4CVH基因與TF5139新生小鼠脾細(xì)胞Ig基因的同源性達(dá)91，可能屬于小鼠重鏈可變區(qū)第IA亞組（3）。VH基因編碼119個(gè)氨基酸，包括3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDRs）和4個(gè)框架區(qū)（FRs）。第22位和92位均為Cys，可形成二硫鍵；第104位和106位均為Gly，完全符合鼠源性抗體VH基因的特征。3重鏈可變區(qū)基因的核苷酸序列及相應(yīng)的氨基酸序列Fig 3 Nucleotide and corresponding amino acid sequences of VH g

13、eneNote: Bold face letters in italics represent sequence of primers 2.3B4CVH基因在大腸桿菌中的表達(dá)根據(jù)測序結(jié)果，pGEMTEasyVH中VH基因第4、5位氨基酸6個(gè)堿基恰是PstI限制酶切位點(diǎn)，且多克隆位點(diǎn)下游處也有1個(gè)PstI位點(diǎn)。PstI酶切后，獲得386bp的片段，證明VH基因?yàn)檎蚩寺　⒋似闻cPstI酶切并去除5P的載體pQE31連接（4），轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15，取菌落PCR陽性的重組子，經(jīng)PstI單酶切可切出386bp的片段，證明該質(zhì)粒為正向克隆的表達(dá)重組質(zhì)粒（5）。重組質(zhì)粒pQE31VH在2mmol/LI

14、PTG的誘導(dǎo)下，于37誘導(dǎo)5h，取菌體進(jìn)行SDSPAGE。結(jié)果顯示，在Mr為16000左右有1條很濃的蛋白帶，而誘導(dǎo)的空載體菌則無此帶。將分離的表達(dá)菌的周質(zhì)、胞漿及包涵體進(jìn)行SDSPAGE，并將表達(dá)蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位。結(jié)果顯示，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在，只有極少量蛋白為可溶性的蛋白（6）。通過對脫色后的凝膠薄層掃描，測出重組VH單域抗體蛋白占全菌總蛋白的29.3，Mr為167000，與理論估計(jì)值相一致。4重組表達(dá)質(zhì)粒pQE31VH的構(gòu)建（示意）Fig 4 Construction of recombinant expression plasmid pQE31VH 5重組表達(dá)質(zhì)粒pQE31V

15、H的鑒定Fig 5 Identification of recombinant expression plasmid pQE31VH A: DNA/EcoRI Hind III marker; B:pQE31/PstI; C:pQE31VH/PstI; D:PCR product of pQE31VH; E:pBR322/HinfI marker6 pQE31VH表達(dá)產(chǎn)物的 SDSPAGE分析Fig 6 SDSPAGE analysis of expression product of pQE31VH A:Low molecular weight protein marker; B:Induc

16、ed M15/pQE31; C:Total bacteria of induced M15/pQE31VH; DF:Periplasm, supernatant and inclusion body of induced M15/pQE31VH 3討論本研究利用PCR技術(shù)，從抗HEVmAbB4C雜交瘤細(xì)胞cDNA中，直接擴(kuò)增VH基因，克隆并測定了全部核苷酸序列。目前，研制基因工程抗體的首要條件是，PCR擴(kuò)增mAb的可變區(qū)和恒定區(qū)基因，其引物大多是根據(jù)Kabat3的免疫球蛋白數(shù)據(jù)庫信息而設(shè)計(jì)的。我們擴(kuò)增抗HEVmAbVH基因所采用引物，是根據(jù)Orlandi等4發(fā)表的針對FR1和FR4設(shè)計(jì)的簡并引

17、物，很容易地?cái)U(kuò)增出VH390bp的VH基因片段，證明該引物比較適合我們的mAbB4C。但由于目前已知的抗體基因數(shù)目有限，設(shè)計(jì)的引物并非都能夠擴(kuò)增出所有的抗體基因，這有待于人們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)更多的抗體基因，掌握其規(guī)律，以設(shè)計(jì)出更加完美的引物。近年來，基因工程抗體的表達(dá)已不僅僅局限于淋巴細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、酵母、哺乳動(dòng)物和昆蟲等非淋巴細(xì)胞，大腸桿菌甚至植物細(xì)胞都已成功地表達(dá)出有功能性的抗體分子。由于大腸桿菌表達(dá)異源性蛋白易于操作，成本較低，并可進(jìn)行隨機(jī)誘變構(gòu)建文庫，因而得到了廣泛的應(yīng)用。我們采用的pQE31原核高效表達(dá)載體，含有優(yōu)化的噬菌體T5啟動(dòng)子和2個(gè)Lac操縱子，在IPTG誘導(dǎo)下，插入外源基因的表

18、達(dá)載體在大腸桿菌M15中，可高水平地表達(dá)N端含6×His親和尾的蛋白，并可通過特有的Ni?NTA樹脂吸附6×His尾進(jìn)行純化。將PstI單酶切回收的VH基因的386bp片段重組入pQE31PstI位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化M15宿主菌，經(jīng)2mmol/LIPTG誘導(dǎo)，可高效表達(dá)重組蛋白（Mr為16000左右）。表達(dá)量占全菌蛋白的29.3，主要以不溶性的包涵體形式存在?？笻EVmAbVH基因的克隆、表達(dá)成功，為將來進(jìn)一步設(shè)計(jì)構(gòu)建各種類型的基因工程抗體打下了基礎(chǔ)。*總后指令性課題，NO.9608037作者簡介：耿麗卿，女，26歲，碩士北京市海淀區(qū)太平路27號，Tel:(010)66931535作者單位：耿麗卿劉敏霞苑錫同李曉萸黃如統(tǒng)李德榮（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物學(xué)流行病學(xué)研究所，北京100850）參考文獻(xiàn)1耿麗卿，劉敏霞，苑錫同，等.分泌抗戊型肝炎病毒（HEV）單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系的建立.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1997；21（4）：31?2Chomczynski P, Sacchi N. Single? step method of RNA isolation by acid guanidinium? thiocyanate? phenol? chloroform extraction. Anal Biochem, 1987; 162:156 159 3Kabat EA