建立FQPCR定量體系檢測(cè)新型隱球菌CAP10 mRNA

1、建立FQPCR定量體系檢測(cè)新型隱球菌CAP10 mRNA                        作者：戴琳孫， 林旎， 陳勇， 江凌程祖建， 歐啟水    【摘要】  目的 建立熒光定量PCR（FQPCR）技術(shù)定量檢測(cè)新型隱球菌（CN）的莢膜相關(guān)蛋白10（CAP10）基因mRNA，為新型隱球菌的診斷、

2、預(yù)后及療效判斷提供依據(jù)。 方法 用逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法從CN標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC34874）中擴(kuò)增得到CAP10，構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pGEMTEasyCAP10，以倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。設(shè)計(jì)引物和探針，建立FQPCR反應(yīng)體系并對(duì)其重復(fù)性、特異性和線性范圍進(jìn)行評(píng)價(jià)。 結(jié)果 成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pGEMTEasyCAP10，并用倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品制備了標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=-3.11X+38.84。批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)CV值為0.31%，批間重復(fù)性試驗(yàn)CV值為2.73%。FQPCR體系能特異擴(kuò)增新型隱球菌，特異性好，該體系的線性范圍為101copies/L108 copies/L。 結(jié)論 成功建立CN的CAP

3、10 mRNA的定量檢測(cè)方法；該方法重復(fù)性好，特異性強(qiáng)。     【關(guān)鍵詞】  細(xì)胞莢膜； 隱球菌，新型； 真菌蛋白質(zhì)類； 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)； mRNA，信使    新型隱球菌（cryptococcus neoformans，CN）的莢膜相關(guān)蛋白10（capsule associated protein 10，CAP10）對(duì)莢膜的形成是必不可少的，它在毒力的形成和維持中起至關(guān)重要作用12。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)診斷項(xiàng)目，如腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）隱球菌計(jì)數(shù)、抗原測(cè)定和培養(yǎng)等手段靈敏度

4、低、耗時(shí)長(zhǎng)，無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)估CN的毒力和活力3。本研究擬建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR（realtime fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)QPCR）技術(shù)檢測(cè)CN的CAP10基因mRNA，既可為CN的診斷，尤其是毒力和活力的判斷提供敏感、特異的定量手段，又可為治療CN的效果和預(yù)后判斷提供依據(jù)。        1  材料與方法        1.1  材料  CN標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC34874）購(gòu)自上海第二軍醫(yī)大學(xué)附

5、屬長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚病學(xué)研究所；結(jié)核桿菌由福州市肺科醫(yī)院提供，腦膜炎雙球菌和金黃色葡萄球菌由本室分離保存；RNA提取Trizol試劑自（美國(guó)invitrogen公司）；Reverse Transcription System、Taq DNA聚合酶、緩沖液、dNTP及pGEMTEasy Vecto購(gòu)自（美國(guó)Promega公司）；DNA純化回收試劑盒、普通質(zhì)粒小提試劑盒和真菌裂解液及溶壁酶自（北京天根生化科技公司）。        1.2  RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)  取CN標(biāo)準(zhǔn)株及CSF標(biāo)本離心沉淀物，加入溶壁酶

6、20 L混勻后37 水浴30 min破壁，離心棄上清，按Trizol RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作抽提RNA。取上述總RNA按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，被逆轉(zhuǎn)錄的為CN的mRNA。        1.3  引物與探針的設(shè)計(jì)與合成  比對(duì)CN 5種血清型（A、B、C、D、AD）CAP10基因，尋找同源序列，用Primer 5設(shè)計(jì)CAP10特異性引物和探針（53）：        上游：CCAAGCCCCCAAACCTCCCATACA

7、0;       下游：AACGCGTACCATTCATCAAAGCCC        TaqMan探針：CCTCTTCTTGTACTCAGCAACGGC        TTCGGGCAA        探針5'端由FAM標(biāo)記，3'端由TRAMA標(biāo)記。引物及探針均由美國(guó)invitrogen公司合成并純化，目的片段

8、大小為175 bp。        1.4  標(biāo)準(zhǔn)品的制備  （1）目的DNA片段的制備：PCR反應(yīng)體系含Mg2（25 mmol/L）3 L，10×buffer 2.5 L，dNTP（10 mmol/L）0.5 L，上下游引物（25 mol/L）各0.25 L，Taq聚合酶（5 U/L）0.3 L，DNA模板3 L，加滅菌純水至總體積為25 L。反應(yīng)條件為94 5 min，94 45 s56 45 s72 45 s，35循環(huán)，72 延伸7 min。1.5瓊脂糖凝膠電泳(電壓6080 V，電流強(qiáng)度

9、2030 mA)，檢測(cè)PCR產(chǎn)物。（2）載體的構(gòu)建、鑒定和拷貝數(shù)的換算：采用膠回收試劑盒純化回收切下的瓊脂糖凝膠上的目的片段，目的片段與質(zhì)粒pGEM T連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5中, 37 過(guò)夜培養(yǎng)，篩選出重組體，提取質(zhì)粒，擴(kuò)增，根據(jù)電泳結(jié)果，重新將重組體培養(yǎng)至LB培養(yǎng)基，37 搖床過(guò)夜，純化質(zhì)粒，送上海生工公司測(cè)序，測(cè)吸光度(D)值,根據(jù)阿佛加德羅常數(shù)(6.023×1023 分子數(shù)/摩爾)換算為分子拷貝數(shù)。        1.5  FQPCR反應(yīng)體系的建立  （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：利

10、用ABI7000 Sequence Detector儀器在最優(yōu)化的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件下，將插有目的DNA的質(zhì)粒10倍倍比稀釋成107，106，105，104，103拷貝數(shù)/微升，用作定量標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此定量未知模板的濃度。（2）FQPCR反應(yīng)及條件：25 L體系中包括Mg2（25 mmol/L）3.5 L，10×buffer 2.5 L，dNTP（10 mmol/L）0.5 L，上下游引物（25 mol/L）各0.25 L，Taq聚合酶（5 U/L）0.3 L，熒光探針0.3 L和1 L倍比稀釋的陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。反應(yīng)條件：94 5 min，94 45 s56 45 s，35個(gè)

11、循環(huán)。儀器根據(jù)陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出樣品檢測(cè)結(jié)果。        1.6  方法學(xué)評(píng)價(jià)  (1)重復(fù)性試驗(yàn)：包括批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)。以提取的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)，批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)是對(duì)同一模板同時(shí)進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定，批間重復(fù)性試驗(yàn)是連續(xù)6 d對(duì)同一樣本進(jìn)行重復(fù)測(cè)定。(2)特異性試驗(yàn)：分別取臨床上常見(jiàn)的腦膜炎病原體含結(jié)核桿菌、腦膜炎雙球菌、金黃色葡萄球菌各一份按標(biāo)準(zhǔn)品目的基因片段的方法制備cDNA作為模板，判斷擴(kuò)增反應(yīng)特異性。(3)線性范圍測(cè)定：將定量標(biāo)準(zhǔn)品用ddH2O進(jìn)行10倍倍比稀

12、釋，以此作為模板進(jìn)行FQPCR，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)對(duì)每一濃度標(biāo)準(zhǔn)品的熒光曲線形狀和各濃度熒光曲線的相關(guān)性大小，確定檢測(cè)線性范圍。    2  結(jié)  果        2.1  重組質(zhì)粒的鑒定  重組質(zhì)粒中插入的CAP10基因片段進(jìn)行測(cè)序并與BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示被測(cè)基因片段序列與GenBank報(bào)道的完全一致。結(jié)果提示，獲得了正確的目的基因，同時(shí)成功構(gòu)建pGEMTEasyCAP10重組質(zhì)粒(圖1)。     

13、;   2.2  重組質(zhì)粒的定量  提取的質(zhì)粒測(cè)其D值，D=0.073，D260=0.068，D260/D280=1.6，計(jì)算得質(zhì)粒DNA濃度為5.0×1012拷貝數(shù)/微升。        2.3  標(biāo)準(zhǔn)曲線  (1)將重組質(zhì)粒模板依次稀釋成107、106、105、104、103拷貝數(shù)/微升濃度梯度，在ABI7000擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，得到重組質(zhì)粒pGEMTEasyCAP10標(biāo)準(zhǔn)品的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=-3.11X+38.84（如圖2），不同濃度模板拷貝數(shù)與

14、Ct值之間有很好的線性關(guān)系（r=0.998）。(2)重組質(zhì)粒pGEMTEasyCAP10標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，如圖3。橫坐標(biāo)為Ct值，縱坐標(biāo)為拷貝數(shù).        2.4  方法學(xué)評(píng)價(jià)        2.4.1  重復(fù)性試驗(yàn)  （1）批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)：對(duì)同一模板同時(shí)進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定，測(cè)得Ct值為22.27，22.37，22.22，22.23，22.17，22.20，平均Ct值為22.24，批內(nèi)CV值為0.31%（圖4）。（2）批間

15、重復(fù)性試驗(yàn)：連續(xù)6 d對(duì)同一樣本進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，測(cè)得的Ct值為18.5，18.7，19.8，18.8，19.6，19.0，平均Ct值為19.1，批間CV值為2.73%?？梢?jiàn)本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性。        2.4.2  特異性試驗(yàn)  FQPCR檢測(cè)結(jié)果，新型隱球菌標(biāo)準(zhǔn)品有熒光曲線增長(zhǎng)，而其余孔無(wú)熒光曲線增長(zhǎng)(圖5)。表明該方法具有良好的特異性。        2.4.3  線性范圍測(cè)定

16、  當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度>108 拷貝數(shù)/微升時(shí)，擴(kuò)增曲線不呈典型“S”形，且標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性不好，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度<101拷貝數(shù)/微升時(shí)，擴(kuò)增曲線也不典型，有時(shí)因濃度太低甚至無(wú)擴(kuò)增曲線。而在此范圍間，擴(kuò)增曲線均呈典型“S”形，故認(rèn)為建立的CAP10基因的FQPCR系統(tǒng)的檢測(cè)線性范圍為101108  拷貝數(shù)/微升(圖6)。    橫坐標(biāo)為擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度.  藍(lán)色、紅色、綠色、紫色分別為新型隱球菌、結(jié)核桿菌、腦膜炎雙球菌、金黃色葡萄球菌.        3

17、  討  論        目前CN的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依據(jù)CSF印度墨汁染色、培養(yǎng)及CN抗原測(cè)定等，這些方法的陽(yáng)性率不高、耗時(shí)長(zhǎng)、無(wú)法準(zhǔn)確判斷CN的活力和毒力。一些文獻(xiàn)報(bào)道，用PCR法檢測(cè)CN，但針對(duì)的靶基因不是毒力相關(guān)基因4。長(zhǎng)期困擾臨床醫(yī)師的問(wèn)題是，有的病人CN數(shù)目不多，可是其臨床癥狀嚴(yán)重，有的病人CN數(shù)量很多，臨床癥狀卻較輕。另外CN的數(shù)量和病情的轉(zhuǎn)歸之間缺乏相關(guān)性，使得醫(yī)師無(wú)法判斷療效和預(yù)后。        本實(shí)驗(yàn)以毒力相關(guān)因子C

18、AP10為研究對(duì)象，建立FQPCR定量檢測(cè)CN的CAP10 mRNA，可提升CN的診斷靈敏度。由于直接檢測(cè)決定致病性的隱球菌的毒力，可為療效觀察、預(yù)后判斷及病情轉(zhuǎn)歸的預(yù)測(cè)提供幫助。此外，實(shí)驗(yàn)表明，相對(duì)于DNA，已死亡致病菌mRNA不穩(wěn)定，直接檢測(cè)致病菌的mRNA能夠真實(shí)地反應(yīng)其活力狀態(tài)。mRNA檢測(cè)不但可以反應(yīng)感染局部致病菌的有無(wú)還可以判斷致病菌的存活狀態(tài)56。        本實(shí)驗(yàn)將FQPCR法應(yīng)用于CN莢膜基因CAP10的檢測(cè)，所建立的定量檢測(cè)體系有如下特點(diǎn)：（1）特異性強(qiáng)，其他細(xì)菌和真菌不對(duì)FQPCR反應(yīng)產(chǎn)生干擾；（2

19、）重復(fù)性好，批內(nèi)重復(fù)實(shí)驗(yàn)及批間重復(fù)實(shí)驗(yàn)變異系數(shù)均<3%；（3）靈敏度高，該檢測(cè)體系線性范圍為101108拷貝數(shù)/微升，能滿足CAP10定量檢測(cè)需要；（4）操作簡(jiǎn)便、易行。本實(shí)驗(yàn)所使用的Taqman探針是目前常用的熒光探針之一，國(guó)內(nèi)很多生物工程公司都能合成，且整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程包括抽提RNA、PCR反應(yīng)等，操作都不復(fù)雜。        此外，F(xiàn)QPCR中的標(biāo)準(zhǔn)品也是該技術(shù)能否準(zhǔn)確定量模板的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)獲得的pGEMTEasyCAP10重組質(zhì)粒穩(wěn)定、純化方法簡(jiǎn)單、易于定量測(cè)定、易于大量擴(kuò)增、純化和保存，是FQPCR中最常使

20、用的定量標(biāo)準(zhǔn)品。因此完全可以滿足臨床對(duì)CN CAP10 mRNA的定量測(cè)定。    【參考文獻(xiàn)】  1 Chang Y C,KwonChung K J. Complementation of a capsuledeficient mutation of Cryptococcus neoformans restores its virulenceJ. Mol Cell Biol, 1994,14(7):49124919.2 Chang Y C,Chung K. Isolation, characterization, and localization of a capsuleassociated gene, CAP10, of Cryptococcus neoformansJ. Journal of Bacterbiology, 1999,181(18):56365643.3 Harrison T S. Cryptococcus neoformans and Cryptococcosis J.