神經(jīng)科論文神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)學(xué)論文神經(jīng)內(nèi)科論文腦缺血恢復(fù)期骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)神經(jīng)功能和促血管生成素-1

1、神經(jīng)科論文神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)學(xué)論文神經(jīng)內(nèi)科論文：腦缺血恢復(fù)期骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)神經(jīng)功能和促血管生成素-1、2及其受體表達(dá)的影響【摘 要】 目的探討腦缺血恢復(fù)期骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植對(duì)神經(jīng)功能和促血管生成素(Ang)-1、Ang-2及酪氨酸激酶受體-2(Tie-2)表達(dá)的影響。方法42只SD大鼠隨機(jī)分為腦缺血對(duì)照組(對(duì)照組，12只)、BMSC移植組(15只)及假手術(shù)組(15只)，各組又分為缺血后28 d、35 d、42 d 3個(gè)亞組。用線栓法制作腦缺血大鼠模型，用改良黏附物移除試驗(yàn)(MST)評(píng)估大鼠神經(jīng)功能。在腦缺血后21 d，給BMSCs移植組大鼠尾靜脈注射BMSCs，對(duì)照組大鼠注射等

2、體積PBS。在腦缺血后28 d、35 d、42 d(移植后7 d、14 d、21 d)，用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及Western Blotting法檢測(cè)大鼠缺血周圍腦組織Ang-1、Ang-2及Tie-2 mRNA和蛋白的水平。結(jié)果BMSCs移植組大鼠各時(shí)間點(diǎn)亞組的MST評(píng)分均顯著高于對(duì)照組(均P0.05);BM-SCs移植組及對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)亞組腦組織的Ang-1、Tie-2 mRNA和蛋白水平明顯高于假手術(shù)組(P0050.01)，腦缺血后28 d、35 d，BMSCs移植組腦組織Ang-1、Tie-2 mRNA及蛋白水平均明顯高于對(duì)照組(均P0.01)，而腦缺血后42 d兩組之

3、間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;3組各時(shí)間點(diǎn)亞組腦組織Ang-2 mRNA及蛋白水平的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論腦缺血恢復(fù)期BMSCs移植能改善神經(jīng)功能，并使缺血周圍腦組織Ang-1、Tie-2的表達(dá)水平明顯增高，而對(duì)Ang-2表達(dá)無(wú)明顯影響?！娟P(guān)鍵詞】 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;腦缺血;促血管生成素-1;促血管生成素-2;酪氨酸激酶受體-2促血管生成素(Ang)-1、Ang-2及酪氨酸激酶受體-2(Tie-2)是介導(dǎo)腦缺血后血管源性水腫、血管生成和血管成熟穩(wěn)定的關(guān)鍵因子。有研究1報(bào)道，在腦缺血急性期移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)能使缺血周圍腦組織的Ang-1、Tie-2表達(dá)上調(diào)，減少血-腦屏障的破壞而減輕血

4、管源性腦水腫。由于條件限制及其他原因使大多數(shù)患者難以在腦梗死急性期得到BMSCs移植治療;有關(guān)腦梗死恢復(fù)期BMSCs移植治療的報(bào)道很少。為探討腦梗死恢復(fù)期BMSCs移植治療的效果及其機(jī)制，本研究在大鼠腦缺血恢復(fù)期進(jìn)行BMSCs移植治療，觀察其對(duì)神經(jīng)功能和腦缺血周圍組織Ang-1、Ang-2和Tie-2表達(dá)的影響。1材料與方法11材料111動(dòng)物及分組 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠42只，質(zhì)量250280 g，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并于該中心屏障系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，自由喂食。動(dòng)物分為腦缺血對(duì)照組(對(duì)照組，12只)、BMSC移植組(15只)、假手術(shù)組(15只)，各組又分為缺血后28 d、35 d、4

5、2 d 3個(gè)亞組。112試劑與儀器 低糖DMEM培養(yǎng)基(L-DMEM)、胎牛血清、025%胰蛋白酶(GIBCO公司)，Trizol(Invitrogen公司)，RT試劑盒、Taq聚合酶、DNAMarker(Takara公司)，兔抗大鼠Ang-1、Ang-2 IgG多克隆抗體(博奧森公司)，兔抗大鼠Tie-2 IgG多克隆抗體(Santacrus公司)，兔抗大鼠-actin IgG單克隆抗體(博士德公司);二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Heraeus公司)，倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)，分光光度計(jì)(Amersham Bioscience公司)，PCR儀(Eppendorf公司)，電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(

6、Bio-Rad公司)。12方法121大鼠腦缺血模型制作 大鼠術(shù)前禁食6 h，參照Longa等2線栓法制作右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)腦缺血模型，缺血90 min后，拔除線栓，術(shù)中和術(shù)后使動(dòng)物肛溫保持在37。假手術(shù)組大鼠除不插入線栓外其他操作相同。在大鼠缺血24 h時(shí)進(jìn)行Longa 5級(jí)4分法評(píng)分，取13分大鼠入組。122 BMSC的分離培養(yǎng)及移植將1只6周齡雄性SD大鼠頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡消毒，無(wú)菌條件下取股骨，參照Z(yǔ)acharek等1方法進(jìn)行BMSCs的原代培養(yǎng)及傳代，取46代的細(xì)胞用于移植。BMSC移植組大鼠在腦缺血21 d后，通過尾靜脈注射1 ml BMSCs懸液(約含2106

7、個(gè)BMSCs)，對(duì)照組大鼠同時(shí)尾靜脈注入1 ml PBS，假手術(shù)組不進(jìn)行注射。123神經(jīng)功能評(píng)定各組大鼠在腦缺血后第21 d、24 d、28 d、35 d和42 d用改良黏附物移除試驗(yàn)(MST)3評(píng)定神經(jīng)功能。用一條醫(yī)用膠帶纏繞在大鼠的左前爪(無(wú)力側(cè))，形成一個(gè)袖套樣膠圈，將大鼠移到籠中觀察30 s，記錄大鼠用嘴或?qū)?cè)前爪撕扯試圖移除膠圈的時(shí)間;每天測(cè)試3次并取最短的兩次計(jì)算平均值，MST評(píng)分=大鼠試圖移除膠圈的時(shí)間與30 s的比值試圖移除膠圈時(shí)間(s)30 s100%。124腦組織Ang-1、Ang-2、Tie-2 mRNA檢測(cè)在各亞組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)將大鼠用頸椎脫臼法處死，對(duì)照組、BMSC移植組

8、大鼠參照文獻(xiàn)4采用組間等位定位法選取缺血周圍腦組織，假手術(shù)組大鼠選取右側(cè)皮質(zhì)腦組織。用Trizol法提取總mRNA，分光光度計(jì)測(cè)定吸光度A260及A280，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法，參照文獻(xiàn)5及自行使用Prime 50設(shè)計(jì)引物，由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。引物序列、退火溫度、循環(huán)數(shù)、產(chǎn)物片段長(zhǎng)度及退火溫度、循環(huán)數(shù)，見表1。取10l PCR產(chǎn)物加樣于15%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像，Image J軟件分析，以目的條帶與-actin條帶光密度值的比值表示被檢測(cè)物的mRNA水平。125腦組織Ang-1、Ang-2、Tie-2蛋白檢測(cè)用Western Bolotting法

9、檢測(cè)，取腦組織40 mg提取總蛋白，10%SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)上PVDF膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，分別加入兔抗大鼠Ang-1、Ang-2、Tie-2 IgG多克隆抗體，4孵育過夜，TBST清洗后加入山羊抗兔IgG-HRP，室溫孵育1 h。將膜置于發(fā)光液孵育，X線膠片曝光顯影。顯影后用Strip溶液將膜洗脫，重新在4條件下使用兔抗大鼠-actin IgG單克隆抗體孵育過夜、二抗孵育、曝光顯影。條帶用Labscan系統(tǒng)掃描分析，以目的條帶的相對(duì)灰度值表示其水平。126統(tǒng)計(jì)學(xué)方法檢測(cè)數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(x珋s)表示，兩樣本均數(shù)間比較采用成組t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)間比較采用單因

10、素方差分析。用SPSS 130軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2結(jié)果21各組大鼠MST評(píng)分比較 見表2。與假手術(shù)組比較，對(duì)照組和BMSC移植組各時(shí)間點(diǎn)亞組MST評(píng)分均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。腦缺血21 d時(shí)，對(duì)照組與BMSC移植組MST評(píng)分的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;BMSCs移植組大鼠自腦缺血24 d開始(移植后)的各時(shí)間點(diǎn)亞組MST評(píng)分均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。22各組大鼠缺血周圍腦組織Ang-1、Ang-2、Tie-2mRNA水平比較見表3、表4。對(duì)照組、BMSCs移植組各時(shí)間點(diǎn)亞組腦組織Ang-1、Tie-2 mRNA水平均顯著高于假手術(shù)組(P0.05001)

11、;BMSCs移植組腦缺血28 d、35 d(移植后7 d、14 d)兩個(gè)亞組Ang-1、Tie-2 mRNA水平均較對(duì)照組顯著增高(均P0.01)，兩組42 d亞組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;3組各時(shí)間點(diǎn)亞組間腦組織Ang-2 mRNA水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。23各組大鼠缺血周圍腦組織Ang-1、Ang-2和Tie-2蛋白水平比較見表5、表6。BMSCs移植組、對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)亞組腦組織Ang-1、Tie-2蛋白水平均顯著高于假手術(shù)組(P0.05001)，BMSCs移植組腦缺血28 d、35 d(移植后7 d、14 d)兩亞組腦組織Ang-1、Tie-2蛋白水平均較對(duì)照組顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P

12、0.01)，兩組腦缺血42 d亞組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;3組各時(shí)間點(diǎn)亞組之間腦組織Ang-2蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3討論BMSCs是一類存在于骨髓網(wǎng)狀間質(zhì)內(nèi)的非造血干細(xì)胞，具有多向分化潛能，在一定條件下能向3個(gè)胚層的多種細(xì)胞分化，包括來(lái)源于外胚層的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等;由于其取材方便，可自體移植避免倫理問題及免疫排斥反應(yīng)而成為干細(xì)胞移植治療腦梗死臨床試驗(yàn)的合適細(xì)胞來(lái)源，具有較好的安全性，并能減輕因缺血周邊區(qū)域腦萎縮而造成的側(cè)腦室擴(kuò)張6，7。本研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血恢復(fù)期移植BMSCs能改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能，在移植后第3 d、7 d、14 d和21 d，BMSCs移植組大鼠的MST評(píng)分均明顯

13、高于對(duì)照組，與Shen等8在腦缺血后1個(gè)月BMSCs靜脈移植的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，其發(fā)現(xiàn)在移植后1周至12周內(nèi)，BMSCs移植能改善大鼠的改良神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分及MST評(píng)分。腦缺血恢復(fù)期時(shí)缺血周邊區(qū)隨病程改變由急性期的血-腦屏障破壞、血管源性水腫逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)檠苌伞?cè)支循環(huán)形成，其中Ang及其受體Tie-2在這些過程中起重要作用。血管生成包括血管內(nèi)皮細(xì)胞的新生、遷移，微血管形成，血管分叉和吻合等過程，血管旁細(xì)胞分泌的Ang-1與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合，激活磷酸酰肌醇-3-激酶(PI3K/Akt)通路使內(nèi)皮細(xì)胞活化，從而吸引血管周圍細(xì)胞環(huán)繞、支持內(nèi)皮細(xì)胞形成完整的血管壁，促進(jìn)血管成熟與穩(wěn)定。在An

14、g-1存在的條件下，Ang-2劑量依賴地拮抗Ang-1對(duì)血管內(nèi)皮Tie-2受體的活化作用，而單一的Ang-2有較弱的激活Tie-2受體作用9。Zhang等10的研究顯示缺血再灌注損傷后的Ang-1、2/Tie-2表達(dá)是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程，腦缺血后228 d缺血周圍腦組織Ang-1、Tie-2的表達(dá)水平較對(duì)側(cè)非缺血區(qū)增高，而Ang-2的表達(dá)水平從腦缺血后114 d升高，28 d后下降。研究11顯示，腦缺血后靜脈移植的BMSCs主要遷移至缺血側(cè)大腦半球的缺血灶周圍、紋狀體等處，在移植的早期(7 d內(nèi))主要分布于血管周圍，隨后遷移至皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)。急性期移植BMSCs能使缺血周圍腦組織的Ang-1、Ti

15、e-2表達(dá)上調(diào)，減少血-腦屏障的破壞而減輕血管源性水腫1。而腦缺血后的血管生成與重塑是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，故本研究選擇腦缺血后21 d為BMSCs移植時(shí)間點(diǎn)，同時(shí)測(cè)定缺血周圍腦組織Ang-1、Ang-2及Tie-2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。與假手術(shù)組相比，對(duì)照組大鼠缺血周圍腦組織的Ang-1、Tie-2 mRNA表達(dá)水平在腦缺血后28 d、35 d、42 d均明顯增高(均P0.05)，表明Ang-1、Tie-2的表達(dá)升高能持續(xù)至腦缺血后6周，而Ang-2的表達(dá)水平無(wú)明顯變化。與對(duì)照組相比，BMSCs移植組大鼠缺血周圍腦組織Ang-1、Tie-2 mRNA在移植后7 d、14 d表達(dá)水平升高(均P

16、0.01)，而21 d時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;3個(gè)時(shí)間點(diǎn)Ang-2 mRNA表達(dá)水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ang-1、Tie-2和Ang-2蛋白水平改變與mRNA水平改變相似。表明BMSCs移植能使MCAO大鼠缺血周圍腦組織促進(jìn)血管生長(zhǎng)的Ang-1、Tie-2表達(dá)水平增高，并持續(xù)至移植后2周，而Ang-1拮抗劑Ang-2的表達(dá)水平未見明顯變化。推測(cè)BMSCs移植能促進(jìn)腦缺血恢復(fù)期大鼠的血管生成和穩(wěn)定，但這尚需要進(jìn)一步的組織形態(tài)學(xué)研究證實(shí)。腦組織缺血后的血管生成和神經(jīng)功能恢復(fù)有一定關(guān)系。有研究12顯示，Ang-1參與了腦缺血周圍神經(jīng)血管新生微環(huán)境的形成，缺血后腦室下區(qū)產(chǎn)生內(nèi)源性新生神經(jīng)元，新生神經(jīng)元的

17、遷移方向與新生血管方向一致，新生血管區(qū)的Ang-1表達(dá)水平增高，通過微量泵注射Ang-1能增加缺血周圍的新生神經(jīng)元數(shù)，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，應(yīng)用Tie-2阻斷劑則能抑制這一作用。而本研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血恢復(fù)期BMSCs移植也有促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的作用，并且持續(xù)至移植后3周，是否與Ang-1參與的神經(jīng)血管新生微環(huán)境、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的作用有直接聯(lián)系尚無(wú)法肯定，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。另一方面，BMSCs移植治療的作用機(jī)制是多方面的，除有血管生成和穩(wěn)定作用以外，抑制炎癥反應(yīng)、減少疤痕組織形成、促進(jìn)突觸重塑的作用也可能參與其中。因此，BMSCs移植對(duì)腦缺血恢復(fù)期治療作用的確切機(jī)制還有待進(jìn)一步的探討。參考文

18、獻(xiàn)1Zacharek A，Chen J，Cui X，et alAngiopoietin1/Tie2 and VEGF/Flk1induced by MSC treatment amplifies angiogenesis and vascular stabiliza-tion after strokeJJ Cereb Blood Flow Metab，2007，27:16842Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et alReversible middle cere-bral artery occlusion without craniectomy in ratsJ

19、Stroke，1989，20:843Komotar RJ，Kim GH，Sughrue ME，et alNeurologic assessmentof somatosensory dysfunction following an experimental rodent modelof cerebral ischemiaJNat Protoc，2007，2:23454Ashwal S，Tone B，Tian HR，et alCore and penumbral nitric ox-ide synthase activity during cerebral ischemia and reperfu

20、sionJStroke，1998，29:10375Yamamoto A，Takahashi H，Kojima Y，et alDownregulation of an-giopoietin-1 and Tie2 in chronic hypoxic pulmonary hypertensionJRespiration，2008，75:3286Bang OY，Lee JS，Lee PH，et alAutologous mesenchymal stem celltransplantation in stroke patientsJAnn Neurol，2005，57:8747林興建，張穎冬骨髓基質(zhì)細(xì)胞治療缺血性腦血管病的研究進(jìn)展J臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2007，20:708Shen LH，Li Y，Chen JL，et alTherapeutic benefit of bone marrowstromal cells administered 1 month after strokeJJ