淺析EGb761對(duì)慢性腦缺血大鼠腦組織神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的影響

1、淺析EGb761對(duì)慢性腦缺血大鼠腦組織神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的影響【摘要】? 目的 探討EGb761(銀杏葉提取物)對(duì)慢性腦缺血大鼠腦組織神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的影響。方法 將雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、單純?nèi)毖M、EGb761干預(yù)組。制備慢性腦缺血大鼠模型，藥物干預(yù)12周后，免疫組化方法分別檢測(cè)各組大鼠腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)果 EGb761干預(yù)組大鼠的海馬、胼胝體、皮質(zhì)CNPase陽性細(xì)胞表達(dá)明顯高于單純?nèi)毖M，而海馬、胼胝體、皮質(zhì)GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)明顯低于單純?nèi)毖M(P0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 慢性腦缺血時(shí)，EGb761對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞缺血性反應(yīng)有保護(hù)作用，同時(shí)減少反應(yīng)性星形

2、膠質(zhì)細(xì)胞增生。 【關(guān)鍵詞】? EGb761;慢性腦缺血;少突膠質(zhì)細(xì)胞;反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生;大鼠【Abstract】 Objective To investigate the effects of EGb761(Ginkgo biloba extract) on neuroglial cell in chronic cerebral ischemia rats.Methods Male Sprague Dawley rats were randomly divided into shamoperated group, hypoperfusion group and EGb761 group.

3、 The models of chronic cerebral ischemia were established. Then the rats of EGb761 group were treated by intragastric administration with EGb761 for 12 weeks, the expressions of astrocytes and oligodendrocytes in the hippocampus, corpus callosum and cortex were examined by immunohistochemistry and t

4、he positive cells were counted.Results Compared with the hypoperfusion group, the number of oligodendrocytes increased and the number of astrocytes decreased significantly in the EGb761 group(P0. 05).Conclusion EGb761 plays a protective role in oligodendrocytes ischemic reaction and decreases reacti

5、onary astrogliosis in chronic cerebral ischemia.【Key words】 EGb761; Chronic cerebral ischemia; Oligodendrocytes; Reactionary astrogliosis; Rat慢性腦缺血(chronic cerebral ischemia，CCI)與臨床諸多腦血管疾病密切相關(guān)。慢性腦缺血時(shí)，少突膠質(zhì)細(xì)胞存在易損性，而星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生、氧化應(yīng)激和興奮性毒性等是造成上述情況的重要原因。目前，有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物EGb761(Ginkgo biloba extract 761)在腦缺血時(shí)

6、對(duì)神經(jīng)元保護(hù)作用的研究較多，而針對(duì)其對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞抗腦缺血作用的研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)通過對(duì)慢性腦缺血大鼠模型給予國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)含量的銀杏葉提取物EGb761進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響，為慢性腦缺血的預(yù)防和治療開辟新思路，提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。1 材料與方法1 材料1.1 動(dòng)物與分組：雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量(22030) g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分成3組：A組為假手術(shù)組，B組為單純?nèi)毖M，C組為EGb761干預(yù)組，每組10只。1.2 藥物與試劑：EGb761(達(dá)納康，按國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物要求選取，內(nèi)含24%的銀杏黃酮苷和6%的萜烯內(nèi)酯，40 mg/粒)，由法國(guó)博福益普

7、生制藥工業(yè)公司生產(chǎn);GFAP抗體(膠質(zhì)原纖維酸性蛋白抗體)、CNPase抗體(23環(huán)核苷酸3磷酸二酯酶抗體)，均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。2 方法2.1 CCI模型鼠的制備：參考Wakita等1方法制備動(dòng)物模型。10%水合氯醛(0.3 mg/100g)腹腔內(nèi)注射麻醉后，頸部備皮、消毒，頸正中切開皮膚，切口1.52.0 cm，鈍性分離筋膜、胸骨舌骨肌，分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈，每側(cè)用雙線分別在近心端和遠(yuǎn)心端結(jié)扎，然后在兩結(jié)扎處之間剪斷頸總動(dòng)脈制備出單純?nèi)毖M和干預(yù)組模型，假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈而不結(jié)扎，縫合切口，對(duì)皮并消毒，放回原環(huán)境中飼養(yǎng)。2.2 給藥方法：將達(dá)納康研成粉末狀，用蒸餾水溶解

8、并混勻，術(shù)后24 h按照0.5 ml/100 g予灌胃，單純?nèi)毖M給予等量蒸餾水灌胃，各組灌胃均為1次/d，持續(xù)12周。2.3 標(biāo)本的收集與處理：大鼠經(jīng)麻醉后，常規(guī)生理鹽水及4%多聚甲醛灌注、固定，斷頭取腦，制作腦部冠狀石蠟切片(厚度4 m)，分別采用HE染色和免疫組化染色，檢測(cè)腦組織病理變化和皮層、胼胝體及海馬GEAP、CNPase陽性細(xì)胞數(shù)的情況。2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處 理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05。2 結(jié)果2.1 組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE染色) 假手術(shù)組未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化;單純?nèi)毖M可見神經(jīng)元大量變性、壞死，

9、胞體呈三角形，胞漿致密，周圍出現(xiàn)空暈，白質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)散在的神經(jīng)纖維及髓鞘潰變，表明腦組織有明顯的缺血及腦白質(zhì)受損表現(xiàn);EGb761組神經(jīng)元變性壞死及腦白質(zhì)受損均較單純?nèi)毖M減輕。2.2 大鼠腦膠質(zhì)細(xì)胞CNPase及GFAP的變化情況2.2.1 CNPase變化情況：各組均取皮層、胼胝體、海馬處進(jìn)行觀察并統(tǒng)計(jì)CNPase陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)。單純?nèi)毖MCNPase陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于假手術(shù)組和EGb761組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)果見表1。表1 大鼠皮層、胼胝體、海馬CNPase陽性細(xì)胞表達(dá)情況注：?jiǎn)渭內(nèi)毖M與假手術(shù)組比較，*P0.01;單純?nèi)毖M與干預(yù)組比較，P0.012.2.2 GFAP變

10、化情況：各組均取皮層、胼胝體、海馬處進(jìn)行觀察并統(tǒng)計(jì)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)。單純?nèi)毖MGFAP陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于假手術(shù)組和EGb761組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)果見表2。表2 大鼠皮層、胼胝體、海馬GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)情況注： 干預(yù)組與單純?nèi)毖M比較，P0.01;單純?nèi)毖M與假手術(shù)組比較，*P0.013 討論少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocyte，OLG)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成細(xì)胞，在發(fā)生缺血缺氧性損傷后對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的發(fā)揮產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。而星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)在數(shù)目占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的一類膠質(zhì)細(xì)胞, 被認(rèn)為在神經(jīng)元的整個(gè)發(fā)育過程中起重要作用，它參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元功

11、能的調(diào)節(jié)，在維持神經(jīng)元的生存微環(huán)境中起著重要的作用。缺血性腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞增生并產(chǎn)生許多生物活性物質(zhì)， 對(duì)缺血損傷神經(jīng)元具有保護(hù)作用;而過度增生可作為機(jī)械屏障影響髓鞘和軸索的再生，從而影響周圍神經(jīng)組織的結(jié)構(gòu)修復(fù)和功能恢復(fù)。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)EGb761，含24%的銀杏黃酮苷和6%的萜烯內(nèi)酯等多種活性物質(zhì)，現(xiàn)已證實(shí)，EGb中銀杏黃酮為自由基清除劑， 銀杏內(nèi)酯為特異性PAF 受體阻滯藥，對(duì)缺血時(shí)的神經(jīng)元有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)采用CNPase、GFAP分別標(biāo)記少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，應(yīng)用EGb761對(duì)慢性腦缺血大鼠灌胃治療，觀察大鼠腦內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的變化。OLG對(duì)缺血性損傷高度敏感性的機(jī)

12、制包括氧化應(yīng)激、興奮性氨基酸和凋亡通路激活等。(1)OLG中鐵含量高，而谷胱甘肽含量卻較低，清除自由基能力弱而且顯著依賴于氧化磷酸化，因此容易受到氧化應(yīng)激損傷。另外，膠質(zhì)細(xì)胞比神經(jīng)元更易發(fā)生鐵和鋁的蓄積，加重氧化應(yīng)激。許多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)EGb761能夠清除自由基。EGb761通過抑制細(xì)胞氧自由基的釋放削弱超氧自由基對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞的攻擊，同時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞抗缺氧能力。(2)OLG表達(dá)功能性谷氨酸的非NMDA受體，包括紅藻氨酸受體和AMPA受體，故其對(duì)興奮性氨基酸易感。且OLG缺氧缺血時(shí)產(chǎn)生興奮性損傷，胞內(nèi)Na+的濃度急劇增高，局部谷氨酸濃度顯著增加使AMPA、Kainate 受體過度活化，從而介導(dǎo)C

13、a2+內(nèi)流增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載。EGb761可抑制非競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體，又能作用于谷氨酸受體活化水平，抑制受體活化后引起的一系列級(jí)聯(lián)活化和離子通道的開放，從而對(duì)抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性和Ca2+超載對(duì)細(xì)胞的損傷。(3)OLG含有豐富的神經(jīng)鞘磷脂和酞基鞘氨醇，這兩種化合物在體外試驗(yàn)中均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在利用黃嘌呤誘發(fā)PC12細(xì)胞凋亡模型，Zhou等發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯能削弱由黃嘌呤誘導(dǎo)的p53、cMyc、Bax和Caspase3蛋白酶等多種重要凋亡因子的表達(dá)，直接證實(shí)銀杏內(nèi)酯可拮抗細(xì)胞凋亡，并可在凋亡早期阻斷其進(jìn)程。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，EGb761干預(yù)組腦組織中的少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較單純?nèi)毖M明顯增加

14、(P0.01)，提示EGb761的確能夠減輕OLG在慢性腦缺血時(shí)的損傷。星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性腦損傷后增生并產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)反過來又可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷和功能障礙。它們包括谷氨酸、鉀、乳酸、花生四烯酸、NO 和Ca2+流量變化等。所有這些因子都能影響星形膠質(zhì)細(xì)胞， 而星形膠質(zhì)細(xì)胞功能發(fā)生障礙則可影響神經(jīng)元存活。反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生在一定程度上反映了腦缺血缺氧的程度。EGb761能夠針對(duì)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的多種損傷機(jī)制進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的情況較單純?nèi)毖M明顯改善(P0.01)，提示EGb761能抑制腦缺血時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度表達(dá)。腦損傷的病理生理改變存在諸多環(huán)節(jié)

15、，如氧自由基、Ca2+超載、興奮性氨基酸毒性作用和生物膜損傷等，只要針對(duì)其中某一環(huán)節(jié)施加干預(yù)都將打斷級(jí)聯(lián)反應(yīng)而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。EGb761作用的多重性與慢性腦缺血中的病理生理反應(yīng)多樣性相對(duì)應(yīng)，從而對(duì)慢性缺血的腦起保護(hù)作用。由于慢性腦缺血所致腦損傷除了氧自由基損傷、脂質(zhì)過氧化和興奮性毒性外，還涉及其他因素，盡管EGb761確實(shí)有神經(jīng)保護(hù)作用，但其保護(hù)OLG缺血性損傷及抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞過度增生的確切機(jī)制仍需深入研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】? 1 Wakita H, Tominoto H, Kimurua J. Glia activation and white matter change in the rat

16、 brain induced by c hronic cerebral by hypoperfusion: an immunohistochemical study J. Acta Neuropathol Ber1, 1993,87:484492. 莫永炎, 姜勇, 陳瑗, 等. 腦星形膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)功能研究進(jìn)展J. 生理科學(xué)進(jìn)展, 2002, 33: 71 74. Dewar D, Underhill SM, Goldberg MP. Oligodendrocytes and ischemic brain injury J. J Cerebral Blood Flow & Metab, 20

17、03, 23:263. Laszkiewicz I, Mouzannar R, Wiggins RC, et al. Delayed oligodendrocyte degeneration induced by brief exposure to hydrogen peroxideJ. J Neurosci Res,1999,55(3):303310. McDonald JW, Althomsons SP, Hyre KL, et al. Oligodendroeytes from forebrain are highly vulnerable to AMPA/kainite receptormediated excitotoxicityJ. Nat Med, 1998,4(3):291297. Jarvis WD, Kolesnick RN，F(xiàn)ornari FA, et al. Induction of apoptotic DNA damage and cell death by activation of the s