病理科免疫組化技術員培訓分享

1、真誠為您提供優(yōu)質參考資料，若有不當之處，請指正。病理科免疫組織化學技術員培訓及技術操作規(guī)范一、病理科免疫組織化學技術員培訓規(guī)范：凡新入我科的病理技術員均需進行免疫組化理論知識的學習、培訓，經(jīng)考核合格、具備病理技術員技士資質后方能從事免疫組織化學染色。二、病理科免疫組織化學染色操作規(guī)范1.免疫組織化學染色前的準備事項(一)組織切片的制備常規(guī)切片脫蠟至水（組織固定需用10%中性甲醛） (二)抗體的選擇、稀釋和保存（1）選擇抗體應先了解其反應譜和適用條件包括適用切片(石蠟切片抑或冷凍切片)、稀釋度和溫育時間等。（2）對于未曾使用過的新抗體，應按照有關說明書的提示，以幾個不同的稀釋度對適宜檢材(已知陽

2、性切片/涂片)進行預試驗;根據(jù)染色陽性表達的程度和檢材背景著色程度，確定用于染色的最適稀釋度（3）抗體的原液應于分裝后置于一20冷室中保存，切勿反復凍存(以免效價 降低)。（4）抗體的工作液可置于4冰箱中保存。（5）抗體的稀釋。 (1)一般用0.01M PBS(生理鹽水磷酸鹽緩沖液)，pH值7.2。 (2)或用0.05M TBS(生理鹽水三經(jīng)基氨基甲烷緩沖液)，pH值7.6。 (3)必要時可按需要加適量小牛血清清蛋白。(三)被檢測組織內抗原的修復（1）經(jīng)4%中性甲醛之類含醛基固定劑固定的組織，其切片中的抗原決定簇因醛的交聯(lián)作用而被封閉，從而影響抗原一抗體反應。進行免疫組織化學染色前，對于組織切

3、片進行抗原修復處理，會使組織中的固有抗原盡量多地暴露出來，提升了大部分檢測抗體的陽性率和反應強度。有的抗體不需要進行抗原修復。應按抗體試劑說明書的提示決定是否進行被檢測組織內的抗原修復。（2）抗原修復緩沖液。(l)一般為0.01M檸檬酸緩沖液(2.1g檸檬酸溶于100ml蒸餾水中，用2M NaOH調節(jié)pH值至6.0)。(2)有些抗體需要特殊修復緩沖液，如高PH值的EDTA(50mM Tris.，10mM EDTA，pH9.0)，或商品化的該高，10mM EDTA，pH9.0)，或商品化的該高pH修復液等。（3）抗原修復的常用方法。 (l)胰蛋白酶消化法: 組織切片脫蠟、水化。 滴加一滴0.1%

4、胰蛋白酶液于組織切片上。 37下溫育20-40min(溫育時間取決于組織經(jīng)4%中性甲醛固定時間的長短和被檢測抗原)。 蒸餾水沖洗，終止反應。 阻斷內源性過氧化物酶。 進行免疫組織化學染色。（配制0.1%胰蛋白酶液時，應將0.1g胰蛋白酶溶于0.1%無水氯化鈣水溶液(pH值7.8)中。） （2)胃蛋白酶消化法: 組織切片脫蠟、水化. 滴加胃蛋白酶工作液于組織切片上。 37下溫育10-30min(一般為10min，可延至30min，取決于組織經(jīng)4%中性甲醛固定時間的長短). 浸人蒸餾水，終止反應。 進行免疫組織化學染色。用1%胰蛋白酶液37下處理20min。(應以 0.1M HCI配制胃蛋白酶工作

5、液。過度的胃蛋白酶消化會使組織結構破壞、切片 脫落。) （3)微波修復抗原法: 組織切片脫蠟、水化(硅化玻片或經(jīng)防脫片膠處理的玻片)。 將組織切片置于容器(塑料盒或玻璃缸)中，并向其中加人抗原修復液 200ml，蓋上具有小孔的蓋子。 將該容器置于微波爐(705-800W)中央加熱(95)5min，2次(于兩次之間，應向容器中添加蒸餾水50ml，嚴防組織切片干燥)。將該容器移出微波爐，置于室溫下冷卻15-20min。 蒸餾水沖洗。 阻斷內源性過氧化物酶，而后將切片置于蒸餾水中。 用TBS或 PBS液沖洗。 進行免疫組織化學染色。 (4)熱水浴法: 組織切片脫蠟、水化(硅化玻片或經(jīng)防脫片膠處理的玻

6、片)。 向裝組織切片的容器加人足量(例如200ml)抗原緩沖液，置于水浴鍋中，加熱至95 -99(不沸騰)預熱。 將組織切片插人已預熱的容器內，溫育20-40min。 將該容器由微波爐移出，置于室溫下冷卻20min。 室溫下，用TBS、PBS或水洗。 蒸餾水沖洗。 阻斷內源性過氧化物酶，而后將切片置于蒸餾水中。 用TBS或PBS液沖洗。 進行免疫組織化學染色。 （5)壓力鍋法: 組織切片脫蠟、水化(硅化玻片或經(jīng)防脫片膠處理的玻片)。 向4-5.5L的不銹鋼壓力鍋中加人抗原修復緩沖液(約為鍋容積的2/3)， 不加閥情況 下加熱至沸騰。 將組織切片插放于金屬切片架上，并置于壓力鍋內沸騰的緩沖液中。

7、 加閥情況下，將組織切片加壓2min。 壓力鍋自行冷卻或以流水冷卻減壓后，持續(xù)20min。 將冷卻后的切片取出，蒸餾水沖洗后，置于TBS或PBS液中(以免組織切片干燥)。 蒸餾水沖洗。 阻斷內源性過氧化物酶，而后將切片置于蒸餾水中。 用TBS或PBS液沖洗。 進行免疫組織化學染色。（四）組織切片中內源性酶的阻斷 1.內源性過氧化物酶 主要存在于紅細胞、嗜中性粒細胞、單核細胞了嗜酸性粒細胞和組織內。阻斷方法:最常用0.3%-0.5%H2O2-甲醇液，作用15-30min， 阻斷液必須使用時新鮮配制。由于阻斷內源性過氧化物酶常同時導致被測抗原變性(使特異性著色減弱)，而大部分組織不含有內源性過氧化

8、物酶，所以阻斷內源性過氧化物酶一般不必作為常規(guī)步驟。必須阻斷內源性過氧化物酶時，可安排在第一抗體反應后進行，以減少抗原的破壞。 2.內源性堿性磷酸酶 主要存在于嗜中性粒細胞和內皮細胞。阻斷方法:應用1M左旋咪唑，作用15-30min。 3.內源性生物素 肝、胰、腎等的細胞內含有多量生物素或類生物素物質。 阻斷方法:先將切片浸于卵白素(0.5g/ml)中15min，以緩沖液洗凈后，移浸于生物素飽和溶液中15min，再用緩沖液洗去多余的生物素飽和液;也可應用商供的阻斷試劑盒(按說明書操作)。 (五)正常血清保護 作為檢測試劑的抗體蛋白帶有一定的負電荷，免疫組織化學染色時，易與帶有正電荷的組織特別是

9、纖維組織、變性和(或)壞死的細胞、嗜酸性粒細胞等發(fā)生靜電吸引而導致非特異性染色。去除這種非特異性染色最有效的方法是，在滴加第一抗體前，先滴加用于制備第二抗體動物的非免疫血清或是滴加除制備第一抗體動物以外的其他動物非免疫血清，濃度為1：5-1：20;必要時可滴加2%-5%牛 血清清蛋白。正常血清保護作用時間10-20min。用于阻斷非特異性結合的血清不能有明顯的溶血。 (六)緩沖液 用于稀釋抗體，洗滌切片的緩沖液主要有兩種。 1.TBS(0.05M，pH7.6)， Tris一HCl緩沖液(0 .SM，pH 7.6) 100ml 8 .5%NaCl 100ml 蒸餾水加至 1000ml Tris一

10、HCI緩沖液(0 .5M，pH7.6) 三經(jīng)甲基氨基甲烷(Tris) 61g HCl 37ml 蒸餾水加至 1000ml 2PBS(0 .IM，pH 7.6) Na2 HPO4 · 12H2O2 29g NaH2PO4 · 2H2O 3g NaCl 85g 蒸餾水加至 1000ml 使用時用蒸餾水稀釋10倍即成0.0lM。 二、免疫組織化學染色常用方法 (一)直接法 1.脫蠟和水化。 2.3%過氧化氫或0.5%過氧化氫甲醇液，5min。 3.TBS或PBS緩沖液洗滌。 4.抗原修復。 5.無關動物正常血清(適當稀釋)20-30min。 6.甩去正常動物血清，滴加適當稀釋的辣

11、根過氧化物酶標記抗體，或增強的酶標多聚物一步法(Enhanced Polymer One-step Staining，EPOS)抗體于切片上， 20-60min。 7.TBS或PBS緩沖液洗滌。 8.0.04%-0.05%DAB(二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸)H2O2液顯色5-10min，鏡下觀察控制顯色時間。底物配法:DAB 40-50mg；0.05M TBS(pH 7.6) l00ml；3% H2O2 100-200ml。 9.緩沖液洗，流水洗滌。 10.蘇木精淡染細胞核。 11.脫水，透明，封片。 (二)間接法 l-5步同“直接法”。 6.滴加第一抗體于切片上，濕盒內溫育30-60min。 7.T

12、BS或PBS緩沖液洗滌。 8.HRP標記抗體或用增強的酶標記多聚物(Enhanced Labeled一 Polymer Sys- tem，ELPS)抗體滴加切片上，濕盒內溫育30min。 9-14步同“直接法”的7-11步。 (三)過氧化物酶一抗過氧化物酶(PAP)法 1-5步同直接法。 6.適當稀釋的第一抗體，濕盒內溫育30-60min。 7.緩沖液洗滌。 8.第二抗體，濕盒內溫育30min。 9.緩沖液洗滌。 10.滴加PAP，濕盒內溫育30min。 11-15步同“直接法”的7-11步。 雙PAP法:上述操作進行到第10步后，再重復7-10步1次，然后繼續(xù)11-15步。 (四)葡萄球菌A

13、蛋白(SPA)免疫酶法 1-5步同“直接法”。 6.第一抗體，濕盒溫育30-60min。 7.緩沖液洗滌。 8.酶聯(lián)SPA，濕盒溫育30min。 9.緩沖液洗滌。 10-13步同“直接法”的8-11步。 (五)ABC法和SABC法 ABC法是卵白素-生物素-酶復合物(Avidin-Biotin-Peroxidase Complex)法的簡稱。SABC法是鏈霉卵白素-生物素-酶復合物(Streptavidin一Biotin一peroxidase Complex)法的簡稱。 l-5步同“直接法”。6.第一抗體，濕盒溫育30-60min. 7.緩沖液洗滌。 8.生物素化的第二抗體，30min。 9.

14、緩沖液洗滌。 10.ABC復合物或SABC復合物(皆于使用前新鮮配制)，30-60min。 11-15步同“直接法”7-11步。 (六)LSAB(SP)法 LSAB(SP)法，是標記的鏈酶卵白素-生物素(Labeled Streptavidin-Biotin)法的簡稱，操作步驟同“ABC法”，只是以LSAB復合物替代ABC復合物。 (七)CSA法 CSA法是催化信號放大(Catalyzed Signal Amplifieation)法的簡稱。 1-5步同“直接法”。 6.第一抗體，15-30min。 7.緩沖液洗滌。 8.生物素標記的第二抗體，15-30min。 9.緩沖液洗滌。 10.鏈霉卵

15、白素-生物素-HRP復合物(用前新鮮配制)，15min。 11.緩沖液洗滌。 12.放大液，15min。 13.緩沖液洗滌。 14.HRP-StrePtavidin， 15min。 15-19步同“直接法”的7-11步。 (八)二步法Envision System Envision是通過一個多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個多聚體。 1-5步同“直接法”。 6.第一抗體，30-60min。 7.緩沖液洗滌。 8 .Envision TM，10-30min。 9-13步同“直接法”的7-11步。 (九)雙重免疫組織化學法1 .Sequential (1)鼠或兔抗體1，30-60min。 (2)Envisi

16、on TM，羊抗鼠/羊抗兔/HRP，30 min。 (3)DAB(棕色)，2-10 min。 (4)鼠或兔抗體2，30-60 min。 (5)Envision TM，羊抗鼠/羊抗兔/AP，30 min。 (6)AP(紅色)。 2 .Simnl一Aaneous (1)混合鼠抗體1和兔抗體2，4，過夜或60 min。 (2)Envision TM羊抗鼠/HRP和羊抗兔/AP。 (3)AP染色。 (4)HRP染色。 上述方法除注明溫度者外，均可在室溫(20-25)環(huán)境中進行;第一抗體溫育后，如有必要可置于4下過夜。 三、免疫組織化學染色的常用抗體標記物 (一)上皮源性標記物 1.一般性標記物 （1）

17、CK(角蛋白) CK亞型:CK5/6;CK7;CK8;CK10/13;CK18;CK19;CK20。 (2)EMA(上皮細胞膜抗原)。 2.特異性和(或)相對特異性上皮標記物 （1）CEA(癌胚抗原，標記胃癌、大腸癌). （2）CA242(腫瘤相關粘液抗原，標記胰腺癌、大腸癌)。 （3）TG(甲狀腺球蛋白，標記甲狀腺癌). （4）PSA(前列腺特異性抗原，標記前列腺癌)。 （5）PSAP(前列腺特異性酸性磷酸酶，標記前列腺癌). （6）34E12(標記前列腺底細胞). （7）AFP(甲胎蛋白，標記肝癌、內胚竇癌). （8）Hepatoeyte(標記肝細胞癌)。 (9)-HCG(-絨毛膜促性腺激

18、素，標記胎盤滋養(yǎng)層細胞腫瘤、生殖細胞腫瘤). （10）CA125(卵巢癌). （二)間葉源性標記物 主要是Vimentin(vim，波形蛋白)等. （三）肌源性標記物 1.Desmin(Des，結蛋白) 2.Actin(肌動蛋白）. 3.SMA(平滑肌肌動蛋白). 4.MSA(肌特異性肌動蛋白). 5.Myosin(肌球蛋白).6.Myoglobin(MG，肌紅蛋白)7.Myogen(肌漿蛋白).8.MyoDI(肌調節(jié)蛋白). (四)血管源性標記物 FRAg(第8因子相關抗原).CD31CD34UEA-lBNH9.(五)組織細胞源性標記物 1 .CD68/KP-l.2.Lysozyme(溶菌酶

19、)。3.a1-AT(a1-抗胰蛋白酶).4.a1-ACT(al-抗胰糜蛋白酶) 5.Mac387. 淋巴造血組織源性標記物1.全淋巴細胞(1)CD45/LCA(白細胞共同抗原）。(2)TdT(末端脫氧核昔酸轉移酶)。(3)CD30/Ki-1。2.全B細胞 (1)Ig。(2)Ig。(3)CD20/L26。(4)CD79a。(5)BLA36(B淋巴細胞抗原)。 3.B細胞亞型(1)CDl0。(2)CD21(標記濾泡性樹突狀細胞)。(3)CD23。 (4)CD35(標記濾泡性樹突狀細胞)。(5)CD38.4.全T細胞 (1)CD3。(2)CD5。 (3)CD43。(4)CD45RO/UCHL-1.

20、5.T細胞亞型 (1)CDla。(2)CD4。 (3)CD8。 6.NK細胞 (1)CD56。(2)CD57/Leu-7。(3)CD16/Leu-11。7.粒細胞和單核巨噬細胞 (1)CD11c/LeuM5。 (2)CD15/LeuM5。(3)Lysozyme(溶菌酶)。 (4)al-AT(al-抗胰蛋白酶)。 (5)al-ACT(al-抗胰糜蛋白酶)。(6)CD68.(7)S-100蛋白.(8)Mac387。 8.其他 (1)EMA(上皮細胞膜抗原).(2)CD99(尤因肉瘤標記物).(3)ALK-l(間變性淋巴瘤激酶)。(4)HLA-DR。(5)Bel-2。(6)Bel-6。 (7)Bel-10。 (8)Ki-67。(9)CyclinD1(周期素D1)。 (10)CD25。 (11)CD34。 （七）神經(jīng)源性標記物 1.S-100蛋白. 2.NSE（神經(jīng)原特異性烯醇化酶）. 3.Leu7。 4.Neurofilament(N