組織蛋白酶B抑制劑的藥物研究分享

1、真誠(chéng)為您提供優(yōu)質(zhì)參考資料，若有不當(dāng)之處，請(qǐng)指正。組織蛋白酶B抑制劑的藥物研究郝偉麗1 林潔2范玉玲2路新華2 （1.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050016；2.華北制藥集團(tuán)新藥研發(fā)有限責(zé)任公司，河北 石家莊 050015）摘要：目的 對(duì)Cathepsin B（catB）抑制劑藥物的研究概述。方法 以近年來國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)為依據(jù)，進(jìn)行分析歸納。結(jié)果與結(jié)論 catB是一個(gè)豐富而廣泛表達(dá)的半胱氨酸蛋白酶，在許多生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步研究開發(fā)新的catB抑制劑藥物，具有廣闊發(fā)展前景。關(guān)鍵詞：組織蛋白酶B；抑制劑；半胱氨酸蛋白酶；抗癌藥物中圖分類號(hào)：文獻(xiàn)標(biāo)志碼：文章編號(hào)Abst

2、rat OBJECTIVE To investigate and summarize drugs of Cathepsin B（catB） inhibitors. METHODS By analysis and summarization, according to the related literature domestic and abroad for the past few years. RESULTS AND CONCLUSION catB is an abundant and ubiquitously expressed cysteine proteinase, and play

3、s very important roles in many physiological and pathological processes. It will take on a broad development perspective to research new drugs of catB inhibitors.Key words Cathepsin B, inhibitors, cysteine peptidase, anticancer drugs1. 前言組織蛋白酶（Cathepsin，cat）是一大類主要存在于溶酶體的半胱氨酸蛋白水解酶，因催化中心不同而分為不同類型，組織蛋白

4、酶B，C，K，L，M，N和S等屬于半胱氨酸蛋白酶，組織蛋白酶A，G和R屬于絲氨酸蛋白酶，組織蛋白酶D和E屬于天冬氨酸蛋白酶1。圖 1 人類CB的X-射線結(jié)構(gòu)圖Fig.1. X-ray structure of human catB組織蛋白酶B（catB，EC 3.4.22.1）在肝、脾、腎、骨、神經(jīng)細(xì)胞、間質(zhì)成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等都有分布，以酶原的形式貯存在溶酶體中。正常情況下，約10的酶原被生理性分泌至胞漿，被其他的蛋白水解酶水解或自身激活，切除N端和C端多余的氨基酸殘基形成活性形式，參與許多特殊的生理過程，如激素原的激活、抗原呈遞、組織器官發(fā)育等。catB具有廣譜蛋白水解酶活性2，水解位點(diǎn)

5、為-Arg-Arg-/ -Xaa，在pH 3.07.0 都有活性，酸性條件下有外肽酶活性，中性pH下有內(nèi)肽酶活性，堿性條件下會(huì)不可逆失活。根據(jù)X-射線衍射結(jié)構(gòu)圖（圖1），整個(gè)catB結(jié)構(gòu)可分為L(zhǎng)-，R-兩個(gè)結(jié)構(gòu)域3（圖2），活性位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn)位于這兩個(gè)域的界面。底物在catB活性位點(diǎn)的插入，受18個(gè)殘基組成的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)控制。這個(gè)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)也是catB區(qū)別于其他木瓜蛋白酶的特征，它提供了2個(gè)His殘基，以結(jié)合到底物的C末端羧基上。閉合環(huán)形狀是可變的，其穩(wěn)定性與catB所處環(huán)境的pH有關(guān)。在溶酶體的酸性環(huán)境中，catB活性位點(diǎn)是閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，catB為肽鏈外切酶，但當(dāng)pH值升高，閉合環(huán)狀結(jié)

6、構(gòu)被打開，而成為肽鏈內(nèi)切酶。圖 2 底物插入到catB活性位點(diǎn)示意圖Fig.2. Schematic of the binding of a substrate to the active site of catB2. catB 的病理功能如上所述，catB具有雙重蛋白水解活性，這使之能參與多種基底膜蛋白如層粘連蛋白，纖維連接蛋白，型膠原蛋白的降解，繼而破壞一系列組織屏障，為癌細(xì)胞的移動(dòng)打開通道，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向深部組織浸潤(rùn)，參與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，并與腫瘤的復(fù)發(fā)有明顯相關(guān)性4。腫瘤細(xì)胞可分泌catB，該分泌型的catB由于缺乏甘露糖-6-磷酸受體識(shí)別標(biāo)記，故不能被攝入溶酶體，而多以酶原的形式存在

7、于胞漿和細(xì)胞外5。由于腫瘤細(xì)胞能夠酸化其周圍的環(huán)境，其分泌的catB在此環(huán)境中活化，同時(shí)在中性及堿性環(huán)境中活性不受影響，甚至增高，因此癌組織勻漿中catB活性遠(yuǎn)高于遠(yuǎn)離癌腫的正常組織中catB的活性6，這可作為癌細(xì)胞惡性表型-浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的一種指標(biāo)?；罨腸atB除了自身參與胞外基質(zhì)成分的降解外，還能激活蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終生成能夠降解多種胞外基質(zhì)成分的物質(zhì)。病理狀態(tài)下，各種原因所致的細(xì)胞損傷(如病原微生物、炎癥因子、氧化應(yīng)激等)，導(dǎo)致溶酶體膜穩(wěn)定性降低、通透性增高甚至破裂，大量catB釋放到胞漿或組織間隙，并被激活，介導(dǎo)細(xì)胞炎癥性壞死及發(fā)生凋亡，與人類許多疾病如腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏

8、松、Alzheimer病、多發(fā)性硬化癥及其他急慢性炎癥性疾病有關(guān)。因此抑制catB活性已成為相關(guān)疾病治療的重要措施。3. catB 抑制劑藥物研究因?yàn)楦叩腸atB活性是癌癥發(fā)展的重要特征，因此使用catB抑制劑可以減少腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲水平，這在許多體外實(shí)驗(yàn)中都得到了驗(yàn)證，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明選擇性catB抑制劑可減少肝損害7,也顯示了其在腫瘤治療中的潛力。根據(jù)catB 抑制劑的來源，可將其分為內(nèi)源性抑制劑、天然來源的抑制劑和合成抑制劑；還可根據(jù)抑制機(jī)制不同，分為可逆的抑制劑和不可逆的抑制劑。下面將分別描述。3.1.1 內(nèi)源性catB抑制劑迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的半胱氨酸蛋白酶抑制劑，形成一個(gè)超家族。其

9、中最豐富和特征性的內(nèi)源抑制劑可細(xì)分為4個(gè)家族，stefins，西司他汀類和激肽原這三者是真正意義上的半胱氨酸蛋白酶抑制劑，第四類家族在結(jié)構(gòu)上與這個(gè)超家族具有一定的同源性，但不具備抑制半胱氨酸蛋白酶所必需的三個(gè)功能位點(diǎn)。所有的半胱氨酸酶抑制劑都是競(jìng)爭(zhēng)的，可逆的，與底物緊密結(jié)合，抑制水平從mmol到pmol不等。3.1.2 天然來源的catB抑制劑從土壤生物中已經(jīng)分離到三種自然來源的組織蛋白酶抑制劑，醛基肽、氮丙啶肽和環(huán)琥珀酸肽。這些抑制劑一半是非選擇性的，因?yàn)槟竟系鞍酌讣易逵邢嗨频娜S結(jié)構(gòu)，相似的底物特異性。氮丙啶類抑制劑miraziridine8和醛類抑制劑的tokaramide A9，由海綿

10、Theonella mirabilis中分離得到，對(duì)catB的IC50分別為1.4g/mL，29ng/mL。許多潛在的醛類抑制劑也從strepiomyces菌株不同培養(yǎng)物中分離到，酶醛肽是其中最有潛力的catB抑制劑，IC50為9.2ng/mL10；從streptomyces spQ21705中分離到的YM-51804，對(duì)catB的IC50為12.0nM11。最系統(tǒng)研究的poxysuccinyl肽類成員是從Aspergillus japonicus中分離得到E-64（圖3），對(duì)catB，catL和木瓜蛋白酶的IC50分別為55nM，68nM和580nM12。圖 3 poxysuccinyl類抑

11、制Fig.3. poxysuccinyl inhibitors黃酮類化合物也顯示出很強(qiáng)的catB抑制活性。穗花杉雙黃酮，4-methylamentoflavone和 7，4-dimethylamentoflavone 可以從許多植物中分離得到，它們對(duì)catB的IC50低于mmol水平（圖4）13。圖 4 天然來源的黃酮類catB抑制劑結(jié)構(gòu)及其IC50Fig.4. structure of the natural flavonoid catB inhibitor, with their inhibitory activities從海綿動(dòng)物體內(nèi)的Asteropus simplex菌發(fā)酵產(chǎn)物中分離到

12、一個(gè)新的蝶啶衍生物14，Asteropterin（圖5），這是一個(gè)將2,4-二氧四氫蝶啶和N-甲基組胺連接在一起的獨(dú)特分子，并具有catB 抑制活性，IC50為1.4g/mL。圖 5 AsteropterinFig.5. Asteropterin從海洋Pseudomonas sp.PB01的發(fā)酵產(chǎn)物上清里分離到兩種catB抑制劑15，鄰苯甲二酸二丁酯和二-2-乙基己基苯二甲酸酯（圖6），它們都是劑量依賴型catB抑制劑，IC50分別為0.42mM，0.38mM。圖 6 鄰苯甲二酸二丁酯和二-2-乙基己基苯二甲酸酯結(jié)構(gòu)Fig.6. structrue of dibutyl phthalate a

13、nd di-(2-ethylhexyl) phthalate3.1.3 合成catB抑制劑從微生物發(fā)酵產(chǎn)物中分離catB抑制劑作為潛在的抑制劑藥物研究的先導(dǎo)化合物9,16，或者根據(jù)catB的巰基酶特性和特征性的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)17來設(shè)計(jì)特異的catB抑制劑，是合成catB 抑制劑藥物研究的切入點(diǎn)。此外，大分子抑制劑和catB之間形成的復(fù)合物的X射線晶體結(jié)構(gòu)信息也可作為小分子化合物合成的依據(jù)18。3.2.1 不可逆catB抑制劑（1）環(huán)琥珀酸肽類catB抑制劑此類化合物代是最廣泛研究的catB抑制劑，代表性的是E-6419。在結(jié)構(gòu)-活性研究中發(fā)現(xiàn)，這些環(huán)氧環(huán)上的自由羧基取代物是此類化合物對(duì)半胱氨酸蛋

14、白酶選擇性的關(guān)鍵因素20，如果環(huán)上包含一個(gè)酯或酰胺取代物，同時(shí)C-末端有自由羰基取代物（可與His110和111殘基反應(yīng)），則可提高其對(duì)catB的選擇性21,22。一系列環(huán)氧琥珀酰類的衍生物中，對(duì)catB選擇性較高的是CA074 (圖3)，與E-64及其衍生物不同，其SS構(gòu)型是優(yōu)于RR構(gòu)型的。（2）氮丙啶類catB抑制劑圖7 氮丙啶類catB抑制劑母核Fig.7. parent structure of arizidine catB inhibitors環(huán)琥珀酸衍生物的合成包含一個(gè)氮丙啶-2，3-雙羧基作為親電子基團(tuán)，與catB Cys29反應(yīng)。N端未取代的衍生物對(duì)catL的選擇性更高23，而

15、自由羧酸對(duì)氮丙啶環(huán)的攻擊可以增強(qiáng)一系列N-端未取代的氮丙啶類化合物的活性24,25。此類抑制劑也可以在N端質(zhì)子化，因此其抑制活性有極強(qiáng)的pH依賴性，在pH4.0的時(shí)候達(dá)到最大抑制效果。（3）內(nèi)酰胺類catB抑制劑圖 8 內(nèi)酰胺類catB抑制劑Fig.8. structure of -Lactam catB inhibitors內(nèi)酰胺核是抗生素和不可逆蛋白酶抑制劑的藥效基團(tuán)，雖然內(nèi)酰胺類抑制劑對(duì)catB的選擇性不高26，但是可以通過對(duì)其C3，C4位點(diǎn)的修飾使這類化合物成為catB選擇性的新型抑制劑。3.2.2可逆catB抑制劑可逆的抑制劑可以降低毒性，在療效方面極為重要?？赡娴摹⒕o密結(jié)合的cat

16、B抑制劑合成研究已經(jīng)投入很多，但是只取得了有限的效果，因?yàn)閷?duì)S和S位點(diǎn)只能在一個(gè)方向上進(jìn)行修飾而形成親電子區(qū)域。（1）醛類catB抑制劑圖 9 醛類catB抑制劑原理Fig.9. principle of aldehyde catB inhibitorsNMR研究證明，醛類抑制劑可通過其醛基與絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶的羥基形成四面體結(jié)構(gòu)來抑制蛋白酶（圖9）27。盡管醛和肽之間是共價(jià)結(jié)合，這類抑制劑仍然是可逆的抑制劑。過去的10多年里，已經(jīng)合成了大量的醛類抑制劑，但極少有catB選擇性的。最有catB抑制劑潛能的，是圖10所示結(jié)構(gòu)化合物28。圖 10 最有潛力醛類catB抑制劑Fig.10. th

17、e most potent aldehyde cruzain catB inhibitors（2）酮類catB抑制劑圖 11 環(huán)己酮類catB抑制劑一般結(jié)構(gòu)Fig.11. general structure of cyclohexanone catB inhibitors酮類可與catB的Cys29反應(yīng)，而成為潛在的半胱氨酸蛋白酶抑制劑，但醛基一旦被氧化成羧酸后，其抑XXX用很快消失，以吸電子基團(tuán)代替醛基，則可提高對(duì)半胱氨酸蛋白酶抑制劑的選擇性。Nagao等據(jù)此合成了一些對(duì)組織蛋白酶B有活性的吡咯酮類物質(zhì)29。（3）環(huán)丙烯酮類catB抑制劑圖 12 環(huán)己烯酮類 catB 抑制劑母核Fig.12

18、. parent structure of cyclopropenone catB inhibitors環(huán)丙烯酮環(huán)具有兩性特征30，既可作為親電子物質(zhì)，也可作為前體化合物而質(zhì)子化形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，根據(jù)前者可設(shè)計(jì)可逆的catB抑制劑。環(huán)丙烯酮環(huán)與Cys29的巰基反應(yīng)，也可以被這個(gè)酸性的Cys29質(zhì)子化。這類抑制劑和環(huán)琥珀酸衍生物有相似的幾何特征，Ando等在環(huán)丙烯酮結(jié)構(gòu)上連接一個(gè)活化位點(diǎn)導(dǎo)向的肽鏈，對(duì)半胱氨酸蛋白酶表現(xiàn)出強(qiáng)烈抑制活性，而對(duì)絲氨酸蛋白酶沒有抑制活性31。（4）腈類catB抑制劑圖 13 腈類catB抑制劑母核Fig.13. parent structure of nitrile cat

19、B inhiitors長(zhǎng)期以來，腈被認(rèn)作是半胱氨酸蛋白酶的抑制劑（圖13）32。NMR研究顯示這類化合物與酶之間形成可逆的硫代亞胺型中間體，推測(cè)認(rèn)為這個(gè)中間體與catB Cys29殘基的-NH骨架有關(guān)33。在結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上已經(jīng)設(shè)計(jì)出了很多肽基腈類catB抑制劑，通過對(duì)P3和P2位點(diǎn)的取代物進(jìn)行系統(tǒng)和迭代優(yōu)化，可使這類抑制劑對(duì)catB的抑制潛能提高1000倍。將羧基功能域和-C結(jié)合到腈上，與catB的Cys29的His110和His111反應(yīng)，可大大提高這類抑制劑對(duì)catB的選擇性344. 討論catB半胱氨酸蛋白酶在許多生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。在生理?xiàng)l件下，體內(nèi)catB及其抑制劑處于平衡狀態(tài)

20、，病理狀態(tài)下這個(gè)平衡被打破，涉及許多疾病，如炎癥，感染，癌癥等。catB的胞內(nèi)外蛋白水解活性可降解細(xì)胞基質(zhì)，從而為腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移打開通道。因此，抑制catB活性可大大降低腫瘤細(xì)胞的存活率和侵襲力，catB抑制劑被看作是潛在的抗癌和抗轉(zhuǎn)移試劑而給予厚望。但是，20多年的研究和發(fā)展幾乎沒得出臨床前的數(shù)據(jù)，也沒有關(guān)于catB抑制劑在腫瘤治療中的研究數(shù)據(jù)。組織蛋白酶抑制劑應(yīng)用前景看好，尤其catB，針對(duì)其作用特點(diǎn)，尋找相應(yīng)的高效低毒藥物用于臨床疾病的治療，值得進(jìn)一步研究、探索。最近研究發(fā)現(xiàn)，catB在病理過程較腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲方面有更重要的功能，因此除了抗癌藥物，在其他疾病治療方向上開發(fā)新的以catB為

21、靶點(diǎn)的藥物將有重大意義。參考文獻(xiàn)1 Lu Shiying, Ren Honglin, Liu Zengshan, et al. Development about research of cathepsin B, Transaction of Hebei normal university, 2004, 28(3): 306-309.2 Vitot, Boris T, Dusan T, et al. Lysosomal cysteine proteases: Facts and opportunities J . The Embo J,2001, 20(17): 4629-4633.3 Tur

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