突變型p27基因治療裸鼠大腸癌移植瘤的研究

1、突變型p27基因治療裸鼠大腸癌移植瘤的研究         08-12-01 13:48:00     編輯：studa20                     作者：杜勇，徐少勇，楊建業(yè)，張麗摘  要  目的：研究外源性突變型p27(p27 mt)基因?qū)?/p>

2、大腸癌的體內(nèi)抑制作用。方法：應(yīng)用細胞移植法把人大腸癌SW480細胞接種于BALB/c裸鼠皮下，構(gòu)建大腸癌裸鼠模型，將腺病毒介導(dǎo)的突變型p27（Ad-p27 mt）及LacZ注射到瘤體內(nèi)，繪制腫瘤生長曲線，計算腫瘤生長抑制率，并進行細胞凋亡及MMP9的相關(guān)檢測。結(jié)果：Adp27 mt基因治療組腫瘤生長明顯受到抑制，MMP9的表達也明顯較低，與LacZ、空白對照組比較，有顯著性差異（P0.01）。結(jié)論：Adp27 mt基因?qū)Υ竽c癌裸鼠的體內(nèi)腫瘤有明顯的抑制作用，并能抑制MMP9。 關(guān)鍵詞  腺病毒；p27 mt；大腸癌；裸鼠；MMP9Abstract:Objective To inves

3、tigate the inhibitory effect of adenovirus mediated p27mt gene tramsfer on xenograft of in colorectal carcinoma nude mice. Methods The xenograft model of colorectal carcinoma in nude mice was established by inoculating the SW480 cells of human colorectal carcinoma. Adp27mt and LacZ was injected into

4、 the tumors respectively. The growth curves and the growth inhibitory rates of tumors were analyzed and compared with control group.Apoptosis and matrix metalloproteinase9 (MMP9) were also detected .Results Adp27mt markedly suppressed the growth of tumors and promoted apoptosis of SW480 cells, which

5、 had a significant difference compared with control group(P<0.01),and MMP9 expression was lower in Adp27mt group than Lacz group and control group. Conclusions Adp27mt has obviously inhibitory effect on the tumor growth of colorectal carcinoma in nude mice in vivo.Key words:Adenovirus p27mt;Color

6、ectal carcinoma;Nude mice;MMP9正常情況下p27基因在G0/G1期表達增高，當細胞進入S期則表達下降。p27基因高表達抑制細胞增殖是一個普遍現(xiàn)象。將外源性p27基因?qū)爰毎麅?nèi)造成p27蛋白高表達，可使細胞DNA合成強烈受抑制，細胞中止于G1期而停止增殖1。把蘇氨酸187換成蛋氨酸187，稱為突變型p27 mt，其比體內(nèi)天然存在的p27有更強的抗腫瘤作用。1  材料和方法1.1  材料SPF級BALB/c裸鼠購自湖北省實驗動物中心，雌雄兼用，大腸癌SW480細胞購自第四軍醫(yī)大學細胞庫，獨立送回風動物飼養(yǎng)籠具(IVC籠具，蘇杭動物實驗器材公司)，pO

7、RF9hp27 mt質(zhì)粒購自Invivogen 公司，腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy1，質(zhì)粒pShuttleCMV,pBluesciptSK(+)，Ad293細胞，大腸桿菌BJ5183和XL10gold購自Stratagene公司，DH5由鄖陽醫(yī)學院臨床醫(yī)學研究所保存；Age，Nhe，Kpn，Not，Pac和Pme購自New England Biolabs公司，Hind ,EcoR，DNA Hind marker,200 bp DNALadderdNTP，Taq酶和T4 DNA 連接酶購自華美生物公司,hp27 mt 引物由北京賽百盛生物公司設(shè)計合成；DMEM購自Gibco公司，CsCl購自Si

8、gma公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。所用試劑AntiMMP9為鼠抗人單克隆濃縮型抗體,濃縮型免疫組化SP試劑盒、DAB 顯色試劑盒、胃蛋白酶和胰蛋白酶均購于福建邁新公司。1.2  方法1.2.1  人大腸癌裸鼠模型的構(gòu)建：重組腺病毒載體構(gòu)建、鑒定、擴增見相關(guān)文獻23。取大腸癌SW480細胞加入DMEM培養(yǎng)液中置37 ,50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代，反復(fù)傳代至75 cm2培養(yǎng)瓶共36瓶，取對數(shù)生長期的SW480細胞經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化后抽取100 l，釋稀后應(yīng)用臺盼藍染色確定細胞活力大于99%后，收集36瓶75 cm2培養(yǎng)瓶中細胞并調(diào)整

9、細胞濃度為1×108/L的細胞懸液，每只按0.2 ml接種于4周齡BALB/c裸鼠右側(cè)背部皮下，共36只，接種后飼養(yǎng)于我院臨床醫(yī)學研究所動物實驗中心SPF實驗室IVC籠具內(nèi)，裸鼠所用飼料、水及用具均經(jīng)滅菌處理后于超凈工作臺內(nèi)更換，腫瘤潛伏期710 d，至2周時腫瘤基本均長至0.410 cm左右，去除個體腫瘤差異較大的裸鼠，選用腫瘤介于0.5 cm左右裸鼠27只，隨機分為3組，每組9只，分為空白對照組、LacZ組及p27 mt組，采用腫瘤局部直接注射法，對照組中每只瘤體內(nèi)注射PBS 0.1 ml,LacZ組為LacZ 0.1 ml(病毒含量1010pfu)，實驗組每只注射Adp27 m

10、t（病毒含量1010pfu）0.1 ml，3 d 1次，共3次，每3日測量腫瘤最長徑（A），最短徑（B）一次，并根據(jù)公式V=/6（A+B）/23計算體積，4 周后斷頸椎處死動物，剝離腫瘤，稱質(zhì)量并繪制腫瘤生長曲線，按公式腫瘤生長抑制率(%)=(對照組腫瘤質(zhì)量實驗組腫瘤質(zhì)量)/對照組腫瘤質(zhì)量×100 %，計算腫瘤生長抑制率。1.2.2  細胞凋亡檢測：無菌剝離腫瘤后用PBS漂洗3次，去除表面血污及脂肪、結(jié)締組織后，切割成1 mm3大小的碎塊，裝入試管中，加入30倍體積0.5 g/L膠原酶，置37 水浴中消化60 min，間斷振蕩數(shù)次，終止消化后，用100目網(wǎng)眼的篩網(wǎng)過濾，去除

11、未消化組織，收集細胞懸浮于離心管中，1 200 r/min離心5 min，去上清液，用PBS漂洗、離心，800 r/min，3 min，共兩次，以除去細胞碎片，用300目篩網(wǎng)過濾，去除粘連細胞，用PBS調(diào)整細胞密度至1×108/L，加入DNA結(jié)合性熒光染料PI染液（50 mg/L）1 ml，染色30 min，流式細胞儀檢測瘤細胞DNA含量及G1/GO期、G2/M期，S期百分數(shù)，檢測時每個樣品測5 000個細胞，其熒光信號經(jīng)流式細胞Multicycle細胞周期分析軟件處理后以直方圖和數(shù)據(jù)表方式顯示。1.2.3  MMP9免疫組化檢測：采用SP 法,按說明書步驟進行。1.2.4

12、  結(jié)果判斷：低倍鏡(×40)下找到癌巢周邊基質(zhì)區(qū)域,高倍鏡(×200)下 每張載玻片計數(shù)5個視野，計數(shù)每個視野中癌細胞總數(shù)及MMP9表達陽性的癌細胞數(shù)。免疫組化MMP9 表達強度根據(jù)陽性物質(zhì)胞漿棕黃色著色深淺及陽性細胞數(shù)的百分比分為4級:(-)陽性細胞數(shù)小于5%；(+)陽性細胞數(shù)在5%25%之間；(+)陽性細胞數(shù)在26%50%之間；(+)陽性細胞數(shù)在50%以上。1.3  統(tǒng)計學處理應(yīng)用SAS統(tǒng)計學軟件，組內(nèi)兩兩比較應(yīng)用t檢驗，組間比較應(yīng)用重復(fù)觀測資料的2分析。2  結(jié)果2.1  對大腸癌裸鼠模型的抑制作用應(yīng)用細胞接種法接種后，腫瘤生長潛伏期710 d，14 d腫瘤平均體積0.5 cm3(0.48±0.23)左右，生長較為均一，動物生長狀況良好，連續(xù)治療觀察4周，動物無死亡。 腫瘤生長曲線（圖 1）：組間比較p27 mt組與對照組、LacZ組有顯著性差異(P0.01），空白對照組與LacZ組無統(tǒng)計學差異（P0.05）。2.2  腫瘤生長抑制率28 d后斷頸椎處死動物，無菌剝離腫瘤，稱瘤質(zhì)量，抑瘤率38.2%(表1)， p27 mt組與對照組、L