項目實訓手冊-項目9-葡萄干菌落總數(shù)快速檢驗-3M試紙片

1、農產(chǎn)品微生物檢驗技術課程實訓指導手冊項目九 葡萄干菌落總數(shù)快速檢驗-3M試紙片（依據(jù) SN/T 0168-2015進出口食品中菌落總數(shù)計數(shù)方法與3M試紙片操作說明書）一、實訓目的以3M試紙片進行樣品中菌落總數(shù)計數(shù)，熟練使用各類3M試紙片進行檢驗操作，明確常用微生物快速檢驗方法的原理與優(yōu)缺點與注意事項。二、實訓原理PetrifilmTM是3M公司專利發(fā)明，將傳統(tǒng)的瓊脂平板或試管的培養(yǎng)方法濃縮在小小的一張測試片上，現(xiàn)階段共有十余種測試片，比較常用的有：菌落總數(shù)測試片、大腸菌群計數(shù)測試片 、快速大腸菌群計數(shù)測試片、高靈敏度大腸菌群計數(shù)測試片、大腸桿菌/大腸菌群計數(shù)測試片 、腸桿菌科測試片、霉菌和酵母

2、菌計數(shù)測試片、快速金黃色葡萄球菌計數(shù)測試片、環(huán)境李斯特菌測試片三、實訓要求本項目3M試紙片進行樣品中菌落總數(shù)計數(shù)快速檢驗依據(jù)SN/T 0168-2015進出口食品中菌落總數(shù)計數(shù)方法與3M試紙片說明書進行檢驗操作，標準與操作說明書規(guī)定了3M試紙片進行樣品中菌落總數(shù)計數(shù)快速檢驗的基本要求、操作程序和結果判定。本項目全面考察學生依據(jù)標準與操作說明進行微生物快速檢驗的能力。本項目實施過程可分為樣品準備、接種、培養(yǎng)、計數(shù)4個步驟。本項目按2人/組為單位進行操作，要求在實驗室完整使用3M試紙片進行樣品中菌落總數(shù)計數(shù)快速檢驗。四、實驗材料和設備 1 試劑和溶液無菌生理鹽水、75%乙醇。2 儀器和設備除微生物

3、實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料包括冰箱、天平、剪刀、鑷子、移液管、錐形瓶、試管、恒溫培養(yǎng)箱、均質器及耗材、達到精度要求的pH計，超凈工作臺或百級潔凈實驗室。五、實訓任務（包含結果計算）1、樣品制備以無菌操作取有代表性的樣品盛于滅菌容器內。如有包裝，用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。a） 固體和半固體樣品：無菌操作，稱取25 g樣品置盛225 mL生理鹽水的無菌均質杯內，8000 r/min10000 r/min均質1 min2 min，或放入盛有 225 mL 稀釋液的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min2 min，制成 1:10 的樣品勻液。如樣品均質時間超過2 min，

4、應在均質杯外加冰水冷卻。b） 干粉：無菌操作，稱取25 g樣品，置盛225 mL生理鹽水和適量玻璃珠的無菌均質杯內，迅速振搖，將樣品混勻，制成 1:10 的樣品勻液。振搖時，幅度為30 cm，7 s內振搖25次，也可以極其振搖15 s。c） 液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL樣品置盛有225 mL生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成 1:10 的樣品勻液。吸取樣品時，吸管插入液面下不要超過2.5 cm。吸管內液體要在24 s內完全排入稀釋劑。不要在稀釋劑中吹洗吸管。無菌制備樣品，制備10-1、10-2、10-3適宜的稀釋度，并均質。在操作手冊中，首先介紹了3M

5、試紙片的合理存放，3M試紙片需要冷藏，并需注意保質期，且需在開包前將包裝物恢復至室溫；對于已開封的包裝，繼續(xù)存放時則需用膠帶封禁封口；并不在冷藏，同時注意需要在1個月內使用完。2、接種a） 選擇合適的連續(xù)3個稀釋度，揭開試紙片上層膜，接種1 mL樣液垂直滴加在試紙片中央處，做兩個平行重復，小心蓋上上層莫，注意不要有氣泡。b） 用包裝中適配的壓板凹面朝下，對準后，輕壓30秒后，靜置試紙片至少1 min待培養(yǎng)基凝固。3、培養(yǎng)3M試紙片透明面朝上，堆疊不超過20片，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，36±1，培養(yǎng)48±2 h。4、計數(shù)到培養(yǎng)時間后立即計數(shù)，如果不能立即進行計數(shù)，可以將試紙片放在-

6、15條件下，不超過7 d.計算結果只保留兩位有效數(shù)字，見表1表1對所有成對的平板都要計數(shù)，并將計數(shù)的結果按規(guī)定的計算后報告。25250 CFU為正常計數(shù)范圍。不足25 CFU或者超過250 CFU計數(shù)結果可能不是實際菌落數(shù)的真實反映。因為菌落數(shù)過少的試紙片（少于25 CFU），稀釋因子可能會夸大計數(shù)結果；二菌落數(shù)過多的試紙片（超過250 CFU），一反面因為難以計數(shù)，另一方面因為會抑制某些細菌的生長，可能會導致計數(shù)結果低于實際菌數(shù)。報告時，將少于25 CFU或者多于250 CFU的試紙片計數(shù)結果報告為試紙片菌落計數(shù)的估計值（EAPC）。a） 菌落數(shù)在25250 CFU正常范圍內的試紙片：選擇無

7、蔓延菌落的平板，技術所有菌落，包括那些極微小的菌落，記錄下計數(shù)的每個試紙片的菌落數(shù)和稀釋倍數(shù)。計算公式：如表2表2結果修約后為2.4×104或者24000 CFU/mL(g)b） 超過250 CFU的試紙片：所有稀釋度試紙片上菌落數(shù)都超過250 CFU，對于接近250 CFU的試紙片，先劃出分布具有代表性的區(qū)域進行計數(shù)，再計算出整塊的菌落數(shù)，用EAPC來報告計算出的需氧菌落數(shù)，以表明該數(shù)值是從25250 CFU范圍外試紙片得出的估計值。其余試紙片都記錄為“多不可計”（TNTC）。如表3。c） 小于25 CFU的試紙片：所有測試片上菌落數(shù)都小于25 CFU，記錄測試片實際的菌落數(shù)，但報

8、告結果為小于25×（1/d），d為該計數(shù)的樣品的最低稀釋度的稀釋因子。如表4。表4d） 無菌落生長的試紙片。如果所有稀釋度的試紙片都沒有菌落生長，則APC報告為小于1乘以樣品的最低稀釋倍數(shù)，報告時將計算出的APC值標上星號，以表明該數(shù)值是從25250 CFU范圍外試紙片得出的估計值。六、原始數(shù)據(jù)記錄表菌落總數(shù)原始記錄樣品編號樣品名稱樣品狀態(tài)固態(tài)，無異常 液態(tài)，無異常 其他：樣品數(shù)量溫 度濕 度%檢驗方法檢測地點4 主要檢測儀器名稱及編號JM023 DHG-9140A型電熱鼓風干燥箱 JM049 GHP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱JM010 TD型電子天平 設備狀態(tài)正常 其他：檢驗項目測試數(shù)據(jù)記錄計算公式檢驗結果菌落總數(shù)CFU/ml(g)培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間及溫度平板計數(shù)瓊脂、36±1、