單克隆抗體說課講解

1、單克隆抗體技術(shù)【原理及意義】單克隆抗體技術(shù)（The technique of monoclonal antibody）是由 Kchler 和 Milstein 于1975 年創(chuàng)立的。他們發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細胞和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合,形成的雜交細胞既可產(chǎn)生抗體 , 又可無限增殖 , 從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。單克 隆抗體 （monoclonal antibody,M cAb） 具有結(jié)構(gòu)均一、純度高、特異性強、效價高、交叉反 應(yīng)少或無等優(yōu)點 , 缺點是其鼠源性對人具有較強的免疫原性, 反復(fù)人體使用后可誘導(dǎo)產(chǎn)生人抗鼠的免疫應(yīng)答 , 從而削弱其作用 , 甚至導(dǎo)致免疫病理損傷。制備單克

2、隆抗體包括動物免疫、細胞融合、選擇雜交瘤、檢測抗體、雜交瘤細胞的克隆 化、凍存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)等一系列實驗步驟。下面按照制備單克隆抗體的流 程順序 , 逐一介紹其實驗方法。一、細胞融合前的準備（一）免疫方案 選擇合適的免疫方案對于細胞融合的成功 , 獲得高質(zhì)量的 M cAb 至關(guān)重要。一般要 在融合前兩個月左右確立免疫方案開始初次免疫 , 免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性而定。1. 顆粒性抗原免疫性較強 , 不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細胞性抗原為例：免疫細胞數(shù)為每只小鼠 1 X 107/0.5 m L生理鹽水，腹腔注射。1）初次免疫，間隔23周。2）第二次免疫 ，間隔 3周。3）第

3、三次免疫 1 0天后，取血測效價。4）加強免疫 3天后，取脾融合。2. 可溶性抗原免疫原性弱 ， 一般要加佐劑。將抗原和佐劑等體積混合在一起 ， 研磨成油包水的乳糜狀 （放一滴在水面上不易馬上擴散呈小滴狀表明已達到油包水的狀態(tài)）。1）初次免疫 ，Ag5 50微克/只，加弗氏完全佐劑皮下多點注射 ，一般0.2 毫升/點，間隔 3周。2）第二次免疫 ，劑量途徑同上 ，加弗氏不完全佐劑 ，間隔 3周。3）第三次免疫 ，劑量同上 ，不加佐劑 ，于生理鹽水中腹腔注射 ，7 10天后采血測其效 價，檢測免疫效果 ， 間隔 23周。4）加強免疫，劑量50卩g為宜，腹腔或靜脈注射。5）3 天后 ， 取脾融合。

4、（二）飼養(yǎng)細胞在制備單克隆抗體過程中 ， 許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細胞 ， 如 ： 在雜交瘤細胞篩選、克隆化 和擴大培養(yǎng)過程中 ， 加入飼養(yǎng)細胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細胞有 ： 小鼠腹腔巨噬細胞（較為常用）、小鼠脾臟細胞或小鼠胸腺細胞，也有人用小鼠成纖維細胞系3 T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細胞 ， 使用比較方便 ， 照射后可放入液氮罐長期保存 ， 隨用隨復(fù)蘇。 小鼠腹腔巨噬細胞的制備 ：1 .采用與免疫小鼠相同的品系 ，常用 610周齡 B A LB/c 小鼠。2. 拉頸處死 ， 浸泡于 75%酒精中 ， 消毒 3 5 min， 用無菌剪刀剪開皮膚 ， 暴露腹膜。 用無菌注射器注入 68 m L

5、培養(yǎng)液，反復(fù)沖洗，吸出沖洗液。3. 放入10 m L離心管,1200rpm 離心56 min。4. 用20%、牛血清（N CS）或胎牛血清（F CS）的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細胞數(shù)為1 X 105/m L。加入 96孔板,100微升/孔,放入37C、C O2孵箱培養(yǎng)。一般飼養(yǎng)細胞在融合前一天制備 ， 一只小鼠可獲得 5X1068X 106腹腔巨噬細胞 ， 若用小鼠胸腺細胞作為飼養(yǎng)細胞 ，細胞濃度為 5X106/m L， 小鼠脾細胞為 1X106/m L， 小鼠成纖維細胞（3 T3）為1 X 105/m L,均為100微升/孔。（三）骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞系應(yīng)和免疫動物屬于同一品系 , 這樣雜交融合率高

6、 , 也便于接種雜交瘤細 胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量M cAb。常用骨髓瘤細胞系有：N S1、SP2/0、X63、Ag8.653 等。骨髓瘤細胞的培養(yǎng)用一般的培養(yǎng)液，如R P M 11640、D M E M培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10%- 20%,細胞的最大密度不得超過 106/m L, 一般擴大培養(yǎng)以1 : 10稀釋傳 代,每35d傳代一次。細胞的倍增時間為1620 min,上述三株骨髓瘤細胞系均為懸浮或輕微貼壁生長 , 只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細胞。一般在準備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細胞 , 為確保該細胞對 H A T 的敏感 性, 每 36月應(yīng)用 8-A G（8 氮雜鳥

7、嘌呤 ）篩選一次 , 以防止細胞的突變。保證骨髓瘤細 胞處于對數(shù)生長期 , 形態(tài)良好?；罴毎嫈?shù)高于 95%,也是決定細胞融合成敗的關(guān)鍵。（四）免疫脾細胞免疫脾細胞指的是處于免疫狀態(tài)的脾臟中B淋巴母細胞漿母細胞。一般取最后一次加強免疫 3d以后的脾臟，制備成細胞懸液，由于此時B淋巴母細胞比例較大，融合 的成功率較高。脾細胞懸液的制備 ：在無菌條件下取出脾臟 ,用不完全的培養(yǎng)液洗一次 ,置平皿中不 銹鋼篩網(wǎng)上 , 用注射器針芯研磨成細胞懸液后計數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾 臟體積的 2 倍, 細胞數(shù)為 2X 108左右。二、細胞融合及雜交瘤的選擇（一）細胞融合流程1. 取對數(shù)生長的骨髓瘤細

8、胞 SP2/0,1000rp m 離心 5 min, 棄上清 ,用不完全培養(yǎng)液混 懸細胞后計數(shù) , 取所需的細胞數(shù) , 用不完全培養(yǎng)液洗滌 2 次。2. 同時制備免疫脾細胞懸液 ,用不完全培養(yǎng)液洗滌 2次。3. 將骨髓瘤細胞與脾細胞按1 : 10或1 : 5的比例混合在一起，在50 m L塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗 1次,1200rp m,8 min 。4. 棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PE G的濃度。5. 輕輕彈擊離心管底 , 使細胞沉淀略為松動。6. 在室溫下融合 ：（1）30s內(nèi)加入37C預(yù)熱的1 m L、45%PE G（M erck,相對分子質(zhì)量 4000）,含5%D MS

9、O, 邊加邊攪拌。（2）作用 90s, 若冬天室溫較低時可延長至 120s。 加預(yù)熱37 C的不完全培養(yǎng)液，終止PE G作用，連續(xù)每2 min內(nèi)分別加入1 m L、2 m L、 3 m L、 4 m L、 5 m L 和 10 m L。7. 離心 ,800rpm,6 min 。8. 棄上清 ,先用 6 m L 左右 20%小牛血清 R P M I1640 輕輕混懸 ,切記不能用力吹打 , 以免使融合在一起的細胞散開。9. 根據(jù)所用 96孔培養(yǎng)板的數(shù)量 ,補加完全培養(yǎng)液 , 每塊 96孔板需 10 m L。10將融合后的細胞懸液加入含有飼養(yǎng)細胞的96孔板,100微升/孔,37 C、5%C O 2

10、孵箱培養(yǎng)。（二）H A T選擇雜交瘤小鼠骨髓瘤細胞與免疫的小鼠脾細胞在融合劑聚乙二醇（PE G）的作用下，細胞間發(fā)生隨機的融合 , 形成具有 5 種細胞成分的混合體 , 其中包括未融合的骨髓瘤細胞和脾細 胞, 骨髓瘤細胞與骨髓瘤細胞、脾細胞與脾細胞以及骨髓瘤細胞與脾細胞三類融合細胞,只有骨髓瘤細胞與脾細胞融合才能成為雜交瘤細胞。要從眾多細胞中得到雜交瘤細胞 , 首要問題就是清除兩種親本細胞及其各自融合形成的同核體細胞。由于小鼠脾細胞在體 外培養(yǎng)條件下只能存活幾天 , 且不能增殖 , 因此它不會影響雜交瘤細胞的生長 ; 而小鼠的 骨髓瘤細胞生長能力極強 , 增殖速度快 , 所以要篩選出雜交瘤細胞

11、 , 必須及時清除骨髓瘤 細胞、骨髓瘤細胞與骨髓瘤細胞融合的同核體細胞。為此應(yīng)用次黃嘌呤 (H) 、氨基喋呤 (A) 和胸腺嘧啶核苷 (T) 選擇性培養(yǎng)液 (H A T) 加入融合后的培養(yǎng)系統(tǒng)中。 骨髓瘤細胞的 D N A 合成有兩條途徑 : 一條是生物合成的主要途徑 , 由氨基酸及其他 小分子化合物合成核苷酸，進而合成D NA。在此途徑中，葉酸衍生物是必不可少的媒介 物, 它參與嘌呤環(huán)和胸腺嘧啶甲基的生物合成。H A T 培養(yǎng)液中的氨基喋呤是葉酸拮抗劑， 因此可以阻斷骨髓瘤細胞內(nèi) D N A 合成的主要途徑。另一條途徑是補救途徑或稱替 代途徑 ， 正常細胞可利用 H A T 培養(yǎng)液中的次黃嘌

12、呤和胸腺嘧啶核苷， 在次黃嘌呤 - 鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(H G R PT)和胸腺嘧啶核苷激酶(T K)的催化下經(jīng)旁路合成 D N A。骨 髓瘤細胞是經(jīng)過 8-氮雜鳥嘌呤 (8-A G) 或 6-巰基鳥嘌呤 (6-T G) 篩選而得到的遺傳 基因缺陷型的細胞系 ，骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤 (鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 H G R PT-) 或 胸腺嘧啶核苷激酶 (T K-) 。因此， 當(dāng)骨髓瘤細胞主要合成途徑被氨基喋呤阻斷后 ，由于 其缺乏上述兩種酶 ， 從而導(dǎo)致骨髓瘤細胞在 H A T 培養(yǎng)系統(tǒng)中的死亡。由骨髓瘤細胞與 B 細胞融合形成的雜交瘤細胞由于從B細胞獲得上述兩種酶，則能利用補充在培養(yǎng)液中的

13、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷經(jīng)旁路途徑合成 D N A， 使雜交瘤細胞得以生存和擴增。加H A T選擇培養(yǎng)的時間和濃度：一般在融合24h后,加H A T選擇培養(yǎng)液(H T和 H A T均有50X商品化試劑，用時1 m L加入50 m L20%小牛血清完全培養(yǎng)液中)。 因為在培養(yǎng)板內(nèi)已加入飼養(yǎng)細胞、融合后的細胞，200 微升/孔， 所以在加選擇培養(yǎng)液時應(yīng)加 3 倍量的 H A T。50X H A T : H： 5X 10-3mol/LA : 2 X 10-5m ol/LT : 8 X 10-4mol/L 一般用 H A T 選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后 ， 改用 H T 培養(yǎng)液 ， 再維持培養(yǎng)兩周 ， 改

14、用一 般培養(yǎng)液。三、抗體的檢測篩選雜交瘤細胞通過選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細胞系中 ， 僅少數(shù)能分泌針對免疫原的 特異性抗體。一般在雜交瘤細胞布滿孔底 1/10 面積時， 即可開始檢測特異性抗體 ，篩選 出所需要的雜交瘤細胞系。檢測抗體應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同， 選擇不同的篩選方法 ， 一般以快速、簡便、特異、敏感為原則。1. E LISA用于可溶性抗原(蛋白質(zhì))、細胞和病毒等 M cAb的檢測。2. RIA用于可溶性抗原、細胞 M cAb的檢測。3. F A CS(熒光激活細胞分類儀)用于檢查細胞表面抗原的 M cAb檢測。4.IF A 用于細胞和病毒 M cAb的檢測。四、雜交瘤的克隆化

15、和凍存克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。因為經(jīng)過 H A T 篩選后的雜交瘤克隆不 能保證一個孔內(nèi)只有一個克隆。在實際工作中 ， 可能會有所需要的抗體 (特異性抗體 )分 泌細胞和其它無關(guān)抗體分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開 ， 就需要克隆化?？寺』?原則是 ， 對于檢測抗體陽性的雜交克隆應(yīng)盡早進行克隆化 ， 否則抗體分泌的細胞會被抗體 非分泌的細胞所抑制 ， 因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快， 二者競爭的結(jié)果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期地再克隆， 以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失， 從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。(一)克隆化方法 克隆化的

16、方法很多 ，最常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。1 .有限稀釋法(1) 制備飼養(yǎng)細胞懸液 ( 同融合前準備 )。陽性孔細胞的計數(shù),并調(diào)細胞數(shù)在1 X 1035X 103/m L 。(3) 取130個細胞放入 6.5 m L 含飼養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)液 ,即20個細胞每毫升 ,100 微升/孔加A B、C三排為每孔2個細胞。余下2.9 m L細胞懸液補加2.9 m L含飼養(yǎng)細胞的 完全培養(yǎng)液,細胞數(shù)為10個每毫升,100微升/孔加D E、F三排,為每孔1個細胞。余下 的2.2 m L 細胞懸液補加 2.2 m L 含飼養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)液 ,細胞數(shù)為 5個每毫升,100微 升/孔，加G H兩排,為每孔

17、0.5個細胞。(4) 培養(yǎng) 45d 后, 在倒置顯微鏡上可見到小的細胞克隆,補加完全培養(yǎng)液 200微升/孔。(5) 第 8 9d 時 , 肉眼可見細胞克隆 , 及時進行抗體檢測。注: 初次克隆化的雜交瘤細胞需要在完全培養(yǎng)液中加H T。2. 軟瓊脂平板法(1) 軟瓊脂的配制 :含20%FCS小牛血清)的2倍濃縮的 RP MI1640;1%瓊脂水溶液：高壓滅菌,42 C預(yù)熱；0.5%瓊脂液：由1份1%瓊脂加1份含20%、牛血清的2倍濃縮的RP M I1640配制 而成,置42 C保溫。(2) 用上述0.5%瓊脂液(含有飼養(yǎng)細胞)15 m L傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫 中待凝固后作為基底層備

18、用。(3) 按 100/m L,500/m L 或 5000/m L 等濃度配制需克隆的細胞懸液。(4) 1 m L、0.5%瓊脂液(42 C預(yù)熱)在室溫中分別與1 m L不同濃度的細胞懸液相混合。(5) 混勻后立即傾注于瓊脂基底層上，室溫10 min,使其凝固，孵育于37C、5%C O 2孵箱中。46d后即可見針尖大小白色克隆,710d后，直接移種至含飼養(yǎng)細胞的 24孔板中進行培養(yǎng)。(7) 檢測抗體 , 擴大培養(yǎng) , 必要時再克隆化。(二)雜交瘤細胞的凍存 及時凍存原始孔的雜交瘤細胞和每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為 在沒有建立一個穩(wěn)定分泌抗體的細胞系的時候 , 細胞的培養(yǎng)過程中

19、隨時可能發(fā)生細胞的 污染、分泌抗體能力的喪失等等。雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣 , 原則上細胞應(yīng)在每支安瓿含1 X 1 06以上,但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變 ,在24孔培養(yǎng)板中培 養(yǎng), 當(dāng)長滿孔底時 , 一孔就可以凍成一支安瓿。細胞凍存液:50%小牛血清,40%不完全培養(yǎng)液,10%D M SO(二甲亞砜)。凍存液最好預(yù)冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降到0C ,再降溫時一般按每分降溫2 C3 C ,待降至-70 C可放入液氮中；或細胞管立即放入-70 C超低溫 冰箱,次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可以用細胞凍存裝置進行凍存。凍存細胞要定期復(fù)蘇,檢查細胞的活性

20、和分泌抗體的穩(wěn)定性 , 在液氮中細胞可保存數(shù)年或更長時間。五、單克隆抗體的鑒定對制備的 M cAb 進行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的 , 應(yīng)對其做如下方面的鑒定 ：1 .抗體特異性的鑒定 ：除用免疫原 (抗原)進行抗體的檢測外 ,還應(yīng)用與其抗原成分第二篇綜合設(shè)計實驗相關(guān)的其它抗原進行交叉試驗，方法可用E LISA、IFA法。例如制備抗黑色素瘤細胞的 M cAb, 除用黑色素瘤細胞反應(yīng)外 , 還應(yīng)用其它臟器的腫瘤細胞和正常細胞進行交叉反應(yīng),以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。制備抗重組的細胞因子的單克隆抗體 ,應(yīng)首先考慮是否與表達菌株的蛋白有交叉反應(yīng) ,其次是與其它細胞因子間有無交叉。2.M

21、 cAb 的 Ig 類與亞類的鑒定 :一般在用酶標或熒光素標記的第二抗體進行篩選 時, 已經(jīng)基本上確定了抗體的 Ig 類型。如果用的是酶標或熒光素標記的兔抗鼠 IgG 或 Ig M,則檢測出來的抗體一般是IgG類或Ig M類。至于亞類則需要用標準抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴或夾心 ELISA來確定。在作雙擴試驗時，如加入適量的PE G(3%),將有利于沉 淀線的形成。3. M cAb中和活性的鑒定：用動物的或細胞的保護實驗來確定 M cAb的生物學(xué)活性。 例如如果確定抗病毒 M cAb 的中和活性 , 則可用抗體和病毒同時接種于易感的動物或敏 感的細胞 , 來觀察動物或細胞是否得到抗體的保護。4. M cAb 識別抗原表位的鑒定 ：用生物傳感器、競爭結(jié)合試驗、測相加指數(shù)的方法 ,測 定M cAb所識別抗原位點，來確定McAb的識別的表位是否相同。5. M cAb親和力的鑒定：用生物傳感器、E LISA或RIA競爭結(jié)合試驗來確定 M cAb 與相應(yīng)抗原結(jié)合的親和力?！咀⒁馐马棥坑捎谥苽銶 cAb的實驗周