地龍ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

1、地龍ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化【摘要】 目的建立和優(yōu)化地龍ISSRPCR反應(yīng)體系。方法以地龍藥材為實(shí)驗(yàn)試材，采用異丙醇沉淀法提取了地龍總DNA模板，對地龍ISSR-PCR反應(yīng)體系中各個主要影響因子進(jìn)行了優(yōu)化和篩選。結(jié)果建立了標(biāo)記位點(diǎn)清晰、穩(wěn)定、重復(fù)性好，可用于地龍ISSR分析的最佳反應(yīng)體系，50 l體系中含有：1Taq酶配套緩沖液，DNA模板50 ng，2.5U Taq DNA聚合酶，2 mmolL MgCl2，0.8 molL引物，0.2 mmolL dNTPs。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4預(yù)變性5 min；94變性30 s，（據(jù)不同引物的退火溫度）復(fù)性30 s，72 延伸1.5 min，共3

2、5個循環(huán)；72延伸5 min，反應(yīng)結(jié)束后，4保存。結(jié)論 這一優(yōu)化體系的建立為今后利用ISSR標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行地龍類藥用動物鑒定及種質(zhì)資源遺傳多樣性分析奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】 地龍；ISSR；反應(yīng)體系；建立和優(yōu)化Abstract:ObjectiveTo establish and optimize ISSR-PCR reaction system for earthworm. MethodsEarthworm DNA was extracted by isopropyl alcohol extraction method. Single and double factors experiment

3、methods were used to present the effect of the main reaction system elements(Taq DNA polymerase，template DNA，Mg2+，primer，dNTPs) and annealing temperature on ISSR-PCRResultsA reaction system and amplified procedure suitable for earthworm were established，that was，50 l reaction system containing 1PCR

4、buffer，50ng template DNA，2.5U Taq DNA polymerase, 2 mmolL MgCl2, 0.8 molL primer， and 0.2 mmolL dNTPs. The optimal amplified procedure was as follows：after a predenaturing of 5 min at 94 ，35 cycles were performed with denaturing of 30 s at 94，annealing of 30 s according to denaturing temperature of

5、different primer，extension of 1.5 min at 72，a final extension step of 5min at 72 and hold at 4ConclusionThis optimal system lay the standardization program for the identification of earthworm and the genetic diversity analysis of its germplasm resourceKey words:Earthworm; Inter Simple Sequence Repea

6、t； Reaction system；Establishment and optimization 地龍為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum(E Perrier)、通俗環(huán)毛蚓Pheretima vulgaris（Chen）、威廉環(huán)毛蚓Pheretima guillelmi(Michaelsen)或櫛盲環(huán)毛蚓Pheretima pectinifera（Michaelsen）的干燥體。前一種習(xí)稱“廣地龍”，后三種習(xí)稱“滬地龍”，為常用動物類中藥，具有清熱定驚、通絡(luò)平喘、利尿的功效。地龍類藥用原動物品種較多，目前生藥鑒定所采用的方法，大多仍沿用傳統(tǒng)的經(jīng)典分類方法，通過活體性

7、狀1或者粉末顯微特征的觀察2來鑒別。對于經(jīng)過炮制加工了的藥材，因?yàn)槭テ湓拘誀疃y辨真?zhèn)?，也有人嘗試用一些新技術(shù)和新方法來解決這一難題，如用X射線衍射Fourier譜對廣地龍藥材粉末進(jìn)行了鑒定新方法摸索3,利用高效液相色譜法對地龍藥材進(jìn)行指紋圖譜分析4等。但這些方法并未被得到廣泛的使用，且存在結(jié)果的專屬和可靠性等問題。 簡單重復(fù)序列區(qū)間(inter-simple sequence repeat,ISSR)是Zietkiewicz5等于1994創(chuàng)建的一類在PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，它是根據(jù)基因組內(nèi)廣泛存在的微衛(wèi)星序列設(shè)計的單一引物對基因組進(jìn)行擴(kuò)增的標(biāo)記系統(tǒng)，近年來該技術(shù)已迅速應(yīng)用于

8、品種鑒定6、種質(zhì)資源和遺傳多樣性7的研究，并作為構(gòu)建遺傳連鎖圖譜的工具8。ISSR技術(shù)與RAPD技術(shù)相似，其缺點(diǎn)是對不同引物、不同材料的擴(kuò)增條件有異，PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最佳條件需要一定時間的摸索。在擴(kuò)增條件中，模板DNA的量、引物濃度、鎂離子濃度和Taq酶的量、引物退火溫度等都會影響ISSR擴(kuò)增。 本研究探討地龍ISSR-PCR反應(yīng)的優(yōu)化條件，以期建立可用于地龍ISSRPCR分析的最佳反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，為深入開展地龍類藥用動物鑒定及種質(zhì)資源遺傳多樣性分析奠定基礎(chǔ)。1 器材1.1 儀器Eppendorf5410R型臺式高速冷凍離心機(jī)；TaKaRa TP600梯度PCR；凝膠電泳儀：北京六一儀器廠

9、DYY-6C型；凝膠圖像分析系統(tǒng)：英國UVP公司GDS7600；多功能酶標(biāo)儀：TECAN Spectra FLUOR plus。1.2 材料Taq DNA聚合酶、dNTPs及2000bp DNA Ladder marker購自廣州美津公司；ISSR引物根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的序列，由上海生工生物工程公司合成，經(jīng)初步篩選，確定UBC834序列為（AG）8YT為此次試驗(yàn)的引物。藥材浸泡液組成：10 mmol/L Tris HCl(pH 8.0)，200 mmol/L EDTA(pH 8.0)，50 mmol/L NaCl溶液，滅菌后使用；DNA提取緩沖液組成：0.1 mmol/L N

10、aCl，10 mmol/L Tris HCl(pH 8.0)，100mmol/L EDTA(pH 8.0) ，滅菌后使用。地龍藥材由廣東，福建、湖北、上海等地藥材市場收集后，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)李薇教授鑒定，分別為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum (E Perrier)和威廉環(huán)毛蚓Pheretima guillelmi(Michaelsen)的干燥體，均屬于中國藥典2005年版部“地龍”項(xiàng)下規(guī)定的品種。2 方法2.1 基因組DNA的提取和檢測采用異丙醇沉淀法，從地龍藥材樣品的表皮組織中提取總DNA。步驟：剪取藥材中段，去除腹部泥沙。純水沖洗內(nèi)外，保存在藥材浸泡液中4，2

11、4h以上，棄去浸泡液，剪碎材料，放入玻璃勻漿器中，分2次（1 000，1 000 l）加入共2 000 l DNA提取液于冰上勻漿至不見組織塊狀物，全部倒入5 ml塑料離心管中。加入10SDS 200 l, 20 mg/ml蛋白酶K 20 l，充分混勻，放入5565水浴鍋中溫浴2 h，每隔15 min取出顛倒混勻。吸取800 l于1.5 ml EP管中，加入600 l飽和NaC1，在旋渦混勻器上高速混合30 s，10 000 g離心30 min，移上清到另一EP管中。加入等體積異丙醇，混勻，置20 1 h，然后10 000 g離心20 min，棄上清。沉淀加入70乙醇500 l洗滌3次，干燥后

12、將其溶于100 l TE中，經(jīng)1瓊脂糖凝膠電泳分析，UVP凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，稀釋成終濃度2050 ng/l ,保存-20備用。2.2 ISSR-PCR反應(yīng)初始條件及程序參照文獻(xiàn)中文蛤9、河蟹10等ISSR分析的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)計初始50 l反應(yīng)體系：1Taq酶配套緩沖液，DNA模板50 ng，2.5U Taq DNA聚合酶，2 mmolL MgCl2，0.8 molL引物，0.2 mmolL dNTPs。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4預(yù)變性5 min；然后是94變性30 s，50復(fù)性30 s，72 延伸1.5 min，共35個循環(huán)；72延伸5 min，反應(yīng)結(jié)束后，4保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在

13、1.5(WV)的瓊脂糖凝膠中電泳分離，電壓5Vcm。電泳結(jié)束后，在UVP凝膠成像系統(tǒng)上觀察并照相記錄。2.3 反應(yīng)體系的優(yōu)化在50 l反應(yīng)體系中，模板DNA (2050 ng/l) 分別為0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 l；引物濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mol/L；dNTPs的濃度分別為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mmol/L。Taq酶和Mg2+采用雙因素作用考察見表1。每一個合適條件確定后，作為后續(xù)研究的一個條件。表1 Mg2+濃度和Taq酶雙因素考察（略）2.4 退火溫度的確定采用梯度PCR模式，設(shè)定退火溫度最低47.0 和最高56.

14、0 ，擴(kuò)增儀自動生成l2個溫度梯度，選擇其中6個：49.8，50.9，52，53.1，54.2，56。百事通3 結(jié)果3.1 模板DNA濃度的確定適宜的模板量是保證特異性擴(kuò)增的前提。模板量過多會降低特異性擴(kuò)增效率，增加非特異性產(chǎn)物。研究表明，DNA模板量在10200 ng，擴(kuò)增程度及擴(kuò)增條帶無明顯差異，以其他地龍DNA為模板也得到同樣的結(jié)果（見圖1）。因此，將地龍擴(kuò)增體系中的模板加入量定為50100 ng，即在50 l反應(yīng)體系中，加入模板DNA 2 l（2050 ng/l)。3.2 引物濃度選擇引物濃度關(guān)系到擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量，濃度太低不能進(jìn)行有效地擴(kuò)增，濃度太高會增加引物二聚體地形成，導(dǎo)致條帶不穩(wěn)

15、定及清晰度下降。結(jié)果表明，隨著引物濃度的升高，擴(kuò)增帶由弱到強(qiáng)。引物濃度在0.2，0.4，0.6 mol?L-1時較弱，0.8，1.0 mol?L-1時擴(kuò)增的條帶數(shù)和亮度均一致，當(dāng)達(dá)到1.2 mol?L-1時非特異性擴(kuò)增增強(qiáng)（見圖1）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇0.8 mol?L-1，即在50 l反應(yīng)體系中，加入ISSR引物（20 mol?L-1）2 l。3.3 dNTPs濃度選擇底物dNTPs濃度過高，會導(dǎo)致聚合酶錯誤的摻入，濃度過低，又會影響合成效率，甚至?xí)騞NTPs過早消耗而使產(chǎn)物單鏈化，影響擴(kuò)增效果。通常在PCR反應(yīng)體系中，dNTPs濃度應(yīng)在0.020.2 mmol?L-111，試驗(yàn)結(jié)果表明：d

16、NTPs濃度在0.10.25 mmol?L-1時，均有擴(kuò)增產(chǎn)物。濃度在0.2 mmol?L-1時，PCR反應(yīng)穩(wěn)定性和擴(kuò)增產(chǎn)物效率最高，背景干擾少，條帶清晰（見圖1）。因此，將地龍ISSR-PCR擴(kuò)增體系中的dNTPs濃度定為0.2 mmol?L-1，即在50l反應(yīng)體系中，加入dNTPs（10 mmol?L-1 each）1 l。3.4 Taq酶和Mg2+雙因素作用考察Taq酶的種類以及使用量直接影響擴(kuò)增反應(yīng)的成功與否。使用高濃度的Taq酶不僅提高了成本，而且也容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；而當(dāng)Taq酶濃度過低時，則會使酶過早地消耗完，產(chǎn)物合成效率低。 Mg2+濃度是影響PCR結(jié)果的重要變量之一。選

17、擇合適的Mg2+濃度對PCR反應(yīng)至關(guān)重要。Taq酶是Mg2+依賴酶，對Mg2+濃度非常敏感。引物與模板的雙鏈雜交體的解鏈與退火溫度受二價陽離子的影響，特別是其中的Mg2+濃度能影響反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增片段的產(chǎn)率。在一般的PCR體系中，Mg2+用量比較合適的是1.52.0 mmol?L-111，50 l體系中Taq酶用量為1.05.0 U11。研究結(jié)果表明：在50 l PCR體系中，2.0 mmol?L-1的Mg2+結(jié)合2.0 U Taq酶用量反應(yīng)結(jié)果最佳。見圖2。3.5 引物退火溫度的考察PCR反應(yīng)中，退火溫度的高低直接影響到引物與模板DNA的特異性結(jié)合。用以上所得到的最佳因素水平組合，針對引物

18、的Tm值進(jìn)行梯度退火實(shí)驗(yàn)，PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，以擴(kuò)增出條帶多，背景清晰的溫度作為候選的火候溫度。結(jié)果見圖3。表明52為引物834較合適退火溫度。通過對上述條件的優(yōu)化，篩選出適宜于地龍藥材ISSRPCR的反應(yīng)體系，50ul的體系組成為：1Taq酶配套緩沖液，DNA模板約50 ng，2.5U Taq DNA聚合酶，2 mmolL MgCl2，0.8 molL引物，0.2 mmolL dNTPs。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4預(yù)變性5 min；94變性30 s，50復(fù)性30 s（據(jù)不同引物的退火溫度），72 延伸1.5 min，共35個循環(huán)；72延伸5 min，反應(yīng)結(jié)束后，4保存。利用此優(yōu)化系統(tǒng)，選擇引物UB

19、C834對地龍藥材的18個樣品進(jìn)行了擴(kuò)增，得到了背景清晰、多態(tài)性穩(wěn)定豐富的DNA擴(kuò)增片段（見圖4），可用于地龍藥材的鑒別及遺傳結(jié)構(gòu)分析研究。4 討論 ISSR擴(kuò)增易受多種因素的影響，如模板DNA、Taq酶、dNTPs、Mg2+ 以及引物等，擴(kuò)增條件的變化會對ISSR圖譜產(chǎn)生較大的影響，從而影響ISSR分析的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，因此為了獲得重復(fù)性和可靠性高的ISSR圖譜，對地龍進(jìn)行引物的篩選、PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化及不同引物的退火溫度的確定十分必要。引物選擇是ISSR技術(shù)中最關(guān)鍵和重要的一環(huán)。常為3或5端加錨（14個堿基）的二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)常為48次。實(shí)際研究工作中常參考

20、加拿大哥倫比亞大學(xué)（University of British Columbia，UBC）設(shè)計并公布的ISSR引物序列。本實(shí)驗(yàn)采用逐一研究各因素不同處理水平的影響，較快地建立了適合地龍的ISSRPCR優(yōu)化體系，為后續(xù)地龍藥材的鑒別及遺傳結(jié)構(gòu)分析研究奠定了技術(shù)和理論基礎(chǔ)。【參考文獻(xiàn)】 1吳文如,李薇.地龍類藥用動物的比較鑒別J.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2007,7(11):1754.2國家藥典委員會.中國藥典，部S.北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2005：80.3李蘭燕,王樹春,吳云山,等廣地龍的X射線衍射Fourier譜鑒定J.中成藥,2002,24(5):380.4姜文紅,張清波.地龍HPLC指紋圖譜分析方法的研究J.中醫(yī)藥學(xué)報，2006,34(6):13.5Zietkiewicz E,Rafalski A,Labuda DGenom