倉鼠cAMP反應元件結合蛋白(CREB)酶聯免疫分析試劑盒

1、倉鼠cAMP反應元件結合蛋白(CREB)酶聯免疫分析試劑盒使用說明書產品編號：E1318haUSCNLIFE TMwww.uscn- 本試劑盒僅供體外研究使用!預期應用ELISA法定量測定倉鼠組織勻漿或其它相關生物液體中cAMP反應元件結合蛋白(CREB)含量。實驗原理用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗CREB抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗CREB抗體、HRP標記的親和素，經過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的CREB呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品

2、濃度。 試劑盒組成及試劑配制 1. 酶聯板：一塊（96孔） 2. 標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為100 ng/ml，做系列倍比稀釋(注：不要直接在板中進行倍比稀釋)后，分別稀釋成100 ng/ml，50 ng/ml，25 ng/ml，12.5 ng/ml，6.25 ng/ml，3.12 ng/ml，1.56 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/ml，臨用前15分鐘內配制。如配制50 ng/ml標準品：取0.5ml (不要少于0.5ml ) 100 ng/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀

3、釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。3. 樣品稀釋液：1×20ml。4. 檢測稀釋液A：1×10ml。5. 檢測稀釋液B：1×10ml。6. 檢測溶液A：1×120l（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（100l/孔），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10l檢測溶液A加990l檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。7. 檢測溶液B：1×120l/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。8. 底物溶液：1

4、×10ml/瓶。 9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 11. 覆膜：5張12. 使用說明書：1份自備物品 1. 酶標儀（建議參考儀器使用說明提前預熱） 2. 微量加液器及吸頭，EP管3. 蒸餾水或去離子水，全新濾紙 標本的采集及保存 1. 組織勻漿：將動物的組織標本先用PBS洗滌，去除多余血液，勻漿化后放在20ml PBS中于-20放置過夜，第二天，經過二次反復凍融破膜，將勻漿物5000x g離心5分鐘，取上清即可檢測。2. 其它生物標本：請1000 x g離心20分鐘，取上清即

5、可檢測，或將標本放于-20或-80保存，但應避免反復凍融。注：以上標本置4保存應小于1周，-20或-80均應密封保存，-20不應超過1個月，-80不應超過2個月；標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。操作步驟實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫（試劑不能直接在37溶解）；試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應預測樣品含量，如樣品濃度過高時，應對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數。1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00l，余孔分別加標準品或待測樣品100l，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于

6、酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37反應120分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100l（在使用前一小時內配制），酶標板加上覆膜, 37反應60分鐘。3. 溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400l/每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。 4. 每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100l，酶標板加上覆膜37反應60分鐘。5. 溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350l/每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。6

7、. 依序每孔加底物溶液90l，酶標板加上覆膜37避光顯色（30分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。7. 依序每孔加終止溶液50l，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。8. 用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后立即進行檢測。注：1. 試劑準備：所有試劑都必須在使用前達到室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。 實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。2. 加樣：加樣或加試劑時，請注意在吸取標本 / 標準品，

8、酶結合物或底物時，第一個孔與最后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的 “預孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。一次加樣時間（包括標準品及所有樣品）最好控制在10分鐘內，如標本數量多，推薦使用多道移液器加樣。3. 孵育：為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態(tài);同時應嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。4. 洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上充分拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響最后的酶標儀讀數。5. 試劑配制

9、：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需的量配置使用，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請精確配置標準品及工作液，盡量不要微量配置（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10l），以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差；請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。6. 反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數。7. 底物：底物請避光保存，在儲存和溫

10、育時避免強光直接照射。 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請最后乘以稀釋倍數。洗板方法1. 手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘，根據需要，重復此過程數次。2. 自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。特異性 本試劑盒可同時檢測重組或天然的倉鼠CREB，且與其它相關蛋白無交叉反應。計算 以標準物的濃度為縱坐標（對數坐標），OD值為橫坐標（對數坐標），在對數坐標紙上繪出標準曲線。推

11、薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如curve expert 1.3，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度，再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。 檢測范圍：1.56 ng/ml - 100 ng/ml最低檢測限：0.78 ng/mL說明 1. 只有全部使用USCNLIFETM試劑才能保證檢測效果，因為所有試劑都是有關聯的，不能混用其他制造商的產品。只有嚴格遵守USCNLIFETM試劑的試驗說明才會得到最佳的檢測結果。2. 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現錯誤的結果。3. 試劑盒保存：短期（1周