噴霧干燥技術在蛋白_多肽類藥物微球制備中的應用

1、接受日期 20072042123 通訊作者 : 何應 , 副教授 ;研究方向 : 控釋和靶向制劑及新藥研制開發(fā) ;T el :022227403913; E 2m ail :heyingxm163. com噴霧干燥技術在蛋白、 多肽類藥物微球制備中的應用白 潔 , 何 應3(, 摘 要 , 多肽類藥物微球的研究進展 , 噴霧干燥、 噴霧冷凍干燥、 噴霧液中冷凍及低溫噴霧提取等制 關鍵詞 ; ; ; 殼聚糖 ; 蛋白 ; 多肽中圖分類號 R97716;R94419 文獻標識碼 A 文章編號 1001-5094(2007 07-0298-05Application of Spray Drying

2、T echnique to Preparation of Protein 2and Peptide 2loaded M icro spheres :a ReviewBAI Jie , HE Y ing(School o f Pharmaceuticals Science and T echnology , Tianjin Univer sity , Tianjin 300072, China Abstract According to different kinds of comm on carrier materials :P LA , P LG A and chitosan , the a

3、dvances in application of spray drying technique to preparation of protein 2and peptide 2loaded microspheres were reviewed classifiedly. And the characteristics of major spray drying techniques , such as s olution spray 2drying , emulsion spray 2drying , spray freeze drying , spray freezing into liq

4、uid and cry ogenic spray extraction , were introduced and com pared.K ey w ords S pray drying ; Microspheres ; P LA ; Chitosan ; Protein ; P olypeptide 隨著 DNA 重組技術的發(fā)展 , 越來越多的蛋白類藥物被開發(fā)出來 , 現(xiàn)已有多種蛋白類藥物獲美國 FDA 批準并上市 。 但是 , 由于蛋白 、 多肽類物質普遍 具有穩(wěn)定性差 、 生物利用度低 、 體內(nèi)生物半衰期短等 缺點 , 使它們在治療學領域的應用受到很大限制 。 通常應用適當?shù)妮d體材料對這

5、類物質進行微囊化而 提高其穩(wěn)定性 。 復乳溶劑蒸發(fā)法是目前實驗室研究 階段普遍采用的微囊化方法之一 , 但是在此過程中 產(chǎn)生的機械應力 、 剪切力和溶劑化會導致聚集 , 從而 造成蛋白質天然結構的改變和生物活性的喪失 , 而 且此方法不適合應用于工業(yè)化大生產(chǎn) 。噴霧干燥技術則是一種快速的一步微囊化過程 , 其條件溫和 , 制得的微球具有粒度分布窄 、 包封 率高等特點 , 其用于不穩(wěn)定藥物微囊化的大規(guī)模生 產(chǎn)極具潛力 。 目前 , 應用該技術生產(chǎn)的重組人生長 激素 (rhGH 聚乳酸 (P LA -聚羥乙酸 (PG A 共聚物(P LG A 微球制劑 Nutropin Depot T M 已獲

6、準上市 , 并有多種蛋白 、 多肽類藥物的緩釋微球尚處于研究階段 。 本文按照不同的常用載體材料 (聚乳酸類和殼聚糖 類 , 分類綜述應用噴霧干燥技術制備蛋白 、 多肽類 藥物微球的研究進展 。綜述與專論 2007年第 31卷 第 7 期 第 298 頁 298 2007, Vol . 31, No . 7 Progress in Pharmaceutical Sciences 1 聚乳酸類生物可降解聚合物 , 如 P LA 和 P LG A 已成功應 用于噴霧干燥法制備蛋白 、 多肽類藥物微球 , 并能使 制劑具緩釋功效 。 111 噴霧干燥法 11111 溶液 噴霧干燥法 (S oluti

7、on S pray 2drying 該方法通常選用醋酸作為加料液 , 將蛋白 、 物與 P LA 或 P LG A 共溶于醋酸溶液中 , 嘴進行噴霧干燥 。Prieto 等 1體材料 (和 P LG A 對生長抑素類 似物 伐 普 肽 進 行 微 化 , 即 將 質 量 分 數(shù) 分 別 為 015%和 5%的伐普肽和聚合物共溶于 40m L 醋酸 中 , 將此溶液以 3m L min 的加料速率通過 017mm 口徑的噴嘴進行噴霧干燥 , 入口和出口溫度分別為 40和 50 , 進風量為 450N L h (N L h :20 、 1個大 氣壓的標準狀況下的風量單位 , 即標準升每小時 。 結

8、果 , 所得微球的粒徑范圍為 115m , 包封率 (質 量分數(shù) 為 46%; 由分子質量為 14kDa 、 末端開放 (uncapped 的 P LG A (P LA PG A :5050 或這種聚合物 與分子質量為 35kDa 、 末端開放的 P LG A (P LA PG A :5050 的混合物作載體所得微球具有較好的緩釋功 效 , 可致血藥濃度持續(xù) 14天維持在理想的 1g L 。Quaglia 等 2選擇胰島素和 P LG A 的醋酸溶液作為加料液 , 以 3m L min 的速率通過 015mm 口徑的 噴嘴進行噴霧干燥 , 制備微球 , 進風量和入口溫度分 別為 450N L

9、h 和 50 , 并且考察了處方中加入羥丙 基 22環(huán)糊精 (HP C D 對胰島素釋放的影響 。結果顯 示 , 應用噴霧干燥技術能夠有效地將胰島素包裹在P LG A 微球中 ; 加入 HP C D 制得的微球其平均粒徑為 1511m , 載藥量 (質量分數(shù) 為 1127%, 大多呈規(guī) 則的球型 。 應用傅里葉變換紅外光譜 (FTIR 觀察微球內(nèi)部胰島素與 HP C D 之間的相互作用 , 發(fā)現(xiàn)胰島素的二級結構發(fā)生了變化 , 胰島素 2HP C D 復合物的 存在使胰島素的釋放速率減慢 3。11112 乳劑 噴霧干燥法 (Emulsion S pray 2drying 該方法與溶液 噴霧干燥法

10、的不同之處在于加料液 為乳劑 , 通常的制備過程為 , 將蛋白 、 多肽類藥物溶 于少量水中 ,P LA 或 P LG A 溶于二氯甲烷中 , 再將藥 物溶液緩緩滴入共聚物溶液中 , 攪拌勻化成乳化液 ,通過噴嘴噴霧干燥即得藥物微球 。G avini 等 4采用該法制備了肽類藥物萬古霉素 的 P LG A 微球 , 用于眼部給藥 。他們首先將萬古霉 素溶于 10m L 蒸餾水中 ,P LG A 溶于 290m L 二氯甲 烷中 , 5分鐘內(nèi) (100005 , 隨后將所得 W O 10L 的加料速率通過口徑為 017mm , 入口和出口溫度分別為 8085和 6870 。 最終得到的微球其藥物

11、包封率接近于理 論值 (8412%9915% , 平均粒徑約為 11m 。Quaglia 等 2 在應用溶液 噴霧干燥法的同時 , 也 考察了應用 W O 乳劑 噴霧干燥技術制備胰島素的 P LG A 微球 。 其噴霧技術參數(shù) :噴嘴口徑為 015mm , 加料速率為 2m L min , 進風量為 500N L h , 入口溫度 為 50 。 與溶液 噴霧干燥法相比 , 應用乳劑 噴霧干燥法制得的胰島素 2HP C D 2P LG A 微球的平均粒徑和載藥量均有所降低 , 分別為 1211m 和 1111%, 微球多呈不規(guī)則形態(tài) 。處方中加入 HP C D 能夠使總 體釋放速率下降 , 胰島

12、素持續(xù)釋放達 45天 , 并且減小 了 突 釋 。當 加 入 表 面 活 性 劑 如 吐 溫 20或 P oloxamer 188時 , 可導致微球具很高的突釋率 (49%54% , 并且釋放速率加快 , 而僅含胰島素的處方 則具有較低的突釋率 。Lane 等 5采用生物可降解聚合物 P LG A 作載體 材料 , 實現(xiàn)了人血清白蛋白 (HS A 的微囊化 , 并比較了兩種不同的制備方法 :W O W 乳化 冷凍干燥法 和 W O W 乳化 噴霧干燥法 。 其中后者噴霧干燥技 術參數(shù) :入口和出口溫度分別為 78或 79和 50 , 進風量為 600N L h 。結果 , 由這兩種方法制得的微

13、 球中未釋放和已釋放的 H AS 其結構完整性相似 ; 應 用乳化 噴霧干燥法和乳化 冷凍干燥法制得的微球 平均粒徑分別為 3146和 6165m , 載藥量分別為 16189和 11164g , 包 封 率 分 別 為 84145%和 58120%。 由此可見 , 乳化 噴霧干燥法更佳 , 可以得到粒徑小 、 載藥量大及包封率高的微球 。 112 噴霧冷凍干燥法噴霧冷凍干燥法 (S pray Freeze Drying 是用于制 備蛋白 、 多肽類微球的一種新方法 , 即將溶解了蛋白 質的溶液通過一個氣霧噴嘴噴于冷的蒸汽相中 , 蒸 汽相下面是低溫液體層 , 小液滴通過蒸汽相的時候 2007

14、, Vol . 31, No . 7 299 Progress in Pharmaceutical Sciences 綜述與專論 2007年第 31卷 第 7期 第 299 頁 開始凍結 , 當接觸到低溫液體層時 , 小液滴完全凍結 , 將收集得到的凍結物置于冷凍干燥器中干燥 , 低溫低壓下使冰升華 , 得到干燥粉末 628。Maa 等 9首次提出應用噴霧冷凍干燥技術制備 蛋白質微球 , 并與噴霧干燥技術比較 , 以重組 -誘導 人免疫球蛋白單克隆抗體 (anti 2IgE M Ab 和重組人 脫氧核糖核酸酶 (rhDNase 作為模型藥 。噴霧干燥 技術參數(shù) :噴嘴口徑為 015mm , 加

15、料速率為 15min , 進風量為 1050L h , 105和 5055 ; :徑 、 加 料 速 率 和 始 溫 度 為 -50 。 結果顯示 315和 217m , 前者所得 微球表現(xiàn)出更好的空氣動力學性質 , 且比表面積較 大 , 這是由于其多呈球形且疏松多孔粒子 , 其密度比 后者得到的微粒減小了 19。C ostantino 等 6考察了噴霧冷凍干燥中霧化條 件對牛血清白蛋白 (BS A 微球粒徑和穩(wěn)定性的影 響 。 結果顯示 , 當噴霧流速增加時 ,BS A 易降解 ; 當 BS A 微球的粒徑減小 , 也就是比表面積增大時 , 干燥后所得 BS A 的單體百分率降低 , 表明所

16、得微球比表 面積對 BS A 降解的影響很大 , 這可能是由于在噴霧 冷凍干燥過程中 BS A 與冰 -水界面接觸時發(fā)生了變 性 ; 當金屬 Zn 與 BS A 形成復合物時 , 會使微球比表 面積減小 , 但對粒徑和蛋白質二級結構的影響不大 ; 另外 , 粒徑的減小也有助于 BS A 突釋率的降低 。C ostantin o 等 7還考察了不同處方因素對噴霧冷 凍干燥制得的 BS A 微球粒徑和穩(wěn)定性的影響。 結果 顯示 , 處方中加入低濃度的表面活性劑或者甘露醇會 在一定程度上增加 BS A 的穩(wěn)定性 , 且對粒徑無影響 ; 加入海藻糖也可成功提高 BS A 的穩(wěn)定性 , 但會使粒徑 顯著

17、增大 ; 當不使用增加穩(wěn)定性的輔料時 , 噴霧過程 的霧化條件會導致 BS A 單體損失約 10%。 113 噴霧液中冷凍法 在噴霧冷凍干燥過程中 , 與冷凍和干燥相關的 應力可能對蛋白質造成不可逆的破壞 , 如結構降解 、聚集及再水化引起的酶活性損失 。 Webb 等 8已通過實驗證明 , 由霧化引起重組人干擾素 (rhIFN 2 在氣 -液表面的吸附會導致其顯著降解 。近年來出現(xiàn)的噴霧液中冷凍技術 (S pray Freezing Into Liquid 則是將蛋白質溶液通過一個絕緣的噴嘴直接噴射到液氮中 , 而不像噴霧冷凍干燥那樣將溶液噴射到冷的蒸汽相中 , 這是噴霧液中冷凍技術的 主要

18、標志 。已有人采用該技術制備了胰島素 、 BS A和一些水不溶性藥物納米粒 10216, 其中制得的胰島 素微球其堆密度小 , , 粒度分布窄 , 且微 %0125%, 表明胰島15; 所得 BS A 微球中蛋白質單14。 在制備重組溶菌酶微球中 , 與噴霧冷凍干燥法相 比 , 噴霧液中冷凍法制得的蛋白質微球更小 , 酶活性 損失更小。 這主要緣于噴霧步驟的不同 , 因為該法在 霧化過程中粒子暴露于空氣 -水界面的時間短 , 所以 蛋白質聚集、 變性的機會減少 , 所得粒子的穩(wěn)定性更 好 17。 114 低溫噴霧提取法Cleland 等 18以可降解聚合物為載體材料 , 采用 一種創(chuàng)新的低溫過

19、程 低溫噴霧提取技術 (Cry o 2genic S pray Extraction , 制備了重組人生長激素微球 (rhGH , 即將 Zn 2rhGH 復合物混懸于溶解了 P LG A 的二氯甲烷溶液中 , 通過一個超聲噴嘴霧化后 , 噴射 到液氮和凍結的乙醇中 , 液氮蒸發(fā)時釋放出的熱量 使乙醇溶解 , 并將二氯甲烷從微球中提取出來 , 最后 將處理后的微球進行過濾 、 干燥即可 (見圖 1 。這 個過程的優(yōu)點在于 , 包載過程中避免了蛋白質接觸 到水 , 這樣也就避免了經(jīng)常發(fā)生在有機相 -水界面 的蛋白質變性 ; 且若在處方中加質量分數(shù)為 1%的 固體碳酸鋅 (粒徑小于 5m , 能減

20、少 rhGH 從微球 中突釋 。目前應用該方法成功開發(fā)出的 rhGH 微 球 , 已以商品名 Nutropin Depot T M上市 。圖 1 低溫噴霧提取法制備 rhGH 微球的工藝示意圖(Fig 11Process for producing rhG H 2containing P LG A microspheres by cry ogenic spray extraction 綜述與專論 2007年第 31卷 第 7期 第 300 頁 300 2007, Vol . 31, No . 7 Progress in Pharmaceutical Sciences 近來 , 這種低溫無水的微

21、球制備工藝已被報道用于制備重組人胰島素樣生長激素 (rhIG F 2I 19、 血管內(nèi)皮生長因子 (rhVEG F 18、 神經(jīng)生長因子 (rhNG F 20以及干擾素 22b (IFN 22b 21的控釋制劑。 2 殼聚糖類已有相關文獻證明殼聚糖是一種生物相容性好 、 毒性低 、 可生物降解的多糖 , 著劑 , 皮細胞 22,23。 至今 , 出殼聚糖微球 , :。G renha 等 24三聚磷酸鹽納米粒能 夠有效改善黏膜表面對肽類的吸收 , 他們將典型的干 粉吸入劑輔料甘露醇和乳糖溶于水后 , 加入到載有蛋 白質的殼聚糖納米粒混懸液中 , 以 215m L min 的加料 速率通過 017

22、mm 口徑的噴嘴進行噴霧干燥 , 以甘露 醇和乳糖為輔料的入口溫度分別為 160和 135 , 出 口溫度分別為 108和 85 , 進風量分別為 400和 320N L h 。 結果 , 得到的微球大多數(shù)為球形 , 直徑在 119410m 之間 , 具有適合于肺部給藥的空氣動力學性質 , 其形態(tài)受殼聚糖納米粒用量的影響很大 ; 這些納 米粒表現(xiàn)出很好的蛋白載藥量 (65%80% , 并能在 15分鐘內(nèi)釋放 75%80%的胰島素。多肽、 蛋白質類口服給藥的關鍵是要保證其在胃 腸道及其他吸收部位不被酸性介質和酶降解。 為此 ,C oppi 等 25,26用噴霧干燥法制備了一個以藻酸鹽和殼 聚糖為

23、載體、 BS A 為模型藥的微粒系統(tǒng) , 即將 BS A 溶 于 20mg L 海藻酸鈉溶液中 , 以 5m L min 的加料速率 通過 015mm 口徑的噴嘴進行噴霧干燥 , 入口和出口 溫度分別為 140和 6065 , 進風量為 600N L h , 制 得的微粒首先置于海藻酸鈉 -氯化鈣 (1 5 溶液中 , 然后放入海藻酸鈉 -殼聚糖 (1 014 溶液中 , 使微粒 硬化以抵御胃腸道的降解 , 最后進行交聯(lián)即可 。結 果顯示 , 最終所得微粒在模擬胃腸道環(huán)境下穩(wěn)定 ; 可 靶向作用于 Peyer s patches (派爾集合淋巴結 ; 系統(tǒng) pH 值低于蛋白質等電點 (pI 時

24、載藥量要高于 pH 與 pI 接近時載藥量 , 這是由于蛋白質和聚陰離子藻酸 鹽之間的靜電作用所致 ; 蛋白質在模擬胃腸液中的 釋放分 3個階段 , 且不受介質種類的影響 。采用噴霧干燥及交聯(lián)劑處理的方法可制備出粒徑小、 形態(tài)好的殼聚糖微球 , 但是所用交聯(lián)劑通常存在毒性 , 導致了交聯(lián)殼聚糖微球在藥學領域的應用受 到一定的限制。 Oliveira 等27將殼聚糖溶于 7mg L醋酸溶液中 , 以 6m L min 的加料速率通過 017mm 口 徑的噴嘴進行噴霧干燥 , 500600N L h , 入 和 8590 , 制得的 無毒的 d , l 2甘油醛進 , 得 微 球 形 態(tài) 好 ,

25、平 均 粒 徑 約 為, 粒度分布窄 , 可用于控釋給藥 ; 且發(fā)現(xiàn)增大d , l 2甘油醛濃度和延長交聯(lián)時間均會使殼聚糖微球的膨脹率和 zeta 電位下降。 3 結 語噴霧干燥工藝制備微球是一個物理過程 , 參數(shù)易 控 , 操作簡單 , 節(jié)省時間 , 且條件溫和 , 適用于蛋白、 多 肽等不穩(wěn)定藥物的微囊化。 因此 , 與傳統(tǒng)技術相比 , 噴霧干燥技術用于制備蛋白類微球具有明顯優(yōu)勢。但是基于蛋白 、 多肽類物質的性質 , 噴霧干燥過 程中的一些因素 , 如噴嘴的剪切力 、 液滴干燥時產(chǎn)生 的熱應力 、 蛋白或多肽在空氣 -液體界面的吸附等 都會對這些生物大分子造成一定的破壞 。 相信隨著 越

26、來越多的蛋白 、 多肽類藥物微球的開發(fā) , 這項技術 一定會愈加完善 。參考文獻 1 Blanco 2Pryeto M J , Campanero M A , Besseghir K, et al.Importance of single or blended polymer types for controlled in vitro release and plasma levels of a s omatostatin analogue entrapped in P LA P LG A microspheres J.J Controlled Re 2lease , 2004, 96(3 :

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