SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE

1、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE    實(shí)驗(yàn)八SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)一. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理2.掌握垂直板電泳的操作方法 3.熟悉蛋白印跡技術(shù)原理和方法二. 實(shí)驗(yàn)原理SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳:是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS(十二烷基磺酸鈉) 1967年,Shapiro等人首先發(fā)現(xiàn),如果在聚丙烯酰胺凝膠電泳(聚丙烯酰胺凝膠中主要取決于三種因素:蛋白大小,形狀和電荷)系統(tǒng)中加入一定量的十二烷基硫酸鈉(SDS),則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)的分子量大小 SDS的作用SDS是一種陰離子去垢劑,

2、SO32-帶負(fù)電荷.因此蛋白質(zhì)在含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中與SDS分子結(jié)合時(shí),可形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物.這種復(fù)合物由于結(jié)合大量帶負(fù)電荷的SDS,好比蛋白質(zhì)穿上帶負(fù)電的"外衣",蛋白質(zhì)本身帶有的電荷則被掩蓋了.從而起到消除各蛋白質(zhì)分子之間自身的電荷差異的作用 因此在電泳時(shí),蛋白質(zhì)分子的遷移速度則主要取決于蛋白質(zhì)分子大小當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15,000-200,000之間時(shí),樣品的遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系.符合如下方程式:Lg MW =-b m R + K 其中,MW 為蛋白質(zhì)的分子量,m R 為相對(duì)遷移率,b為斜率,K為截距.當(dāng)條件一定時(shí),b與K均為常數(shù) 因此通過(guò)已知

3、分子量的蛋白與未知蛋白的比較,就可以得出未知蛋白的分子量SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)按照緩沖液的pH值和凝膠孔徑的差異及有無(wú)濃縮效應(yīng)分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類 連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同,帶電顆粒在電場(chǎng)作用下,主要靠電荷和分子篩效應(yīng) 不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分,pH,凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性,帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng),分子篩效應(yīng),還具有濃縮效應(yīng),因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳Gel5%10%15%294566972002945669720029456697200將通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素/PVDF膜上,

4、然后與能特異性識(shí)別待檢蛋白的抗體進(jìn)行反應(yīng),洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后,加入標(biāo)記的,能識(shí)別特異性抗體的種屬特異性抗體,反應(yīng)一段時(shí)間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體,加入適合標(biāo)記物的檢測(cè)試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等,觀察有無(wú)特異性蛋白條帶的出現(xiàn),也可通過(guò)條帶的密度大小來(lái)進(jìn)行特異性蛋白的半定量實(shí)驗(yàn)操作大致流程圖SDS-PAGE電泳 轉(zhuǎn)膜(PVDF或硝酸纖維素膜) 封閉 一抗 洗滌 酶標(biāo)二抗反應(yīng) 洗滌 顯色或化學(xué)發(fā)光顯影操作過(guò)程1.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干, 準(zhǔn)備2個(gè)干凈的小燒杯2.把玻璃板在灌膠支架上固定好(放好密封條和隔離板)*固定玻璃板時(shí),兩邊用力一定要均勻,防止夾壞玻璃板分離膠(10% 10m

5、l)濃縮膠(5% 10ml)ddH2O4.05ml6.8ml30%Acr3.3ml1.7mlBuffer1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 2.5ml0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 1.25ml10%SDS100 l100 l10%Ap50 l100 lTEMED10 l10 l配 膠 3.按比例配好分離膠,用移液管快速加入(或直接用小燒杯倒入),大約5厘米左右,之后加少許蒸餾水(或異丙醇除泡),靜置至膠凝 * 凝膠配制過(guò)程要迅速, 催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結(jié)無(wú)法注膠.注膠過(guò)程最好一次性完成,避免產(chǎn)生氣泡* 水封的目的:保持分離膠上沿平直,排氣泡

6、* 膠凝好的標(biāo)志:膠與水層之間形成清晰的界面 4.倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干,按比例配好濃縮膠,連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處,迅速插入梳子,靜置到膠凝 * 梳子需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平5.拔出樣梳后,拆掉密封條,在內(nèi)槽中加入緩沖液*用吸瓶將加樣孔內(nèi)和玻璃板下面放密封條位置的氣泡全部排出6.上樣: (1)marker 5 l (2)細(xì)胞樣品10 l + 2×上樣buffer 10 l 共20 l100沸水浴,3-5min (蛋白變性)7. 微量注射器(加樣器)上樣, 上樣量 15 l *微量注射器不可過(guò)低,以防刺破膠體;也不可過(guò)高, 樣品下沉?xí)r易發(fā)生擴(kuò)散,

7、溢出加樣孔8.電泳槽中加入緩沖液,接通 9.凝膠板剝離與染色:電泳結(jié)束后,撬開玻璃板,將凝膠板做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi),加入考馬斯亮藍(lán)染色染色液,染色1小時(shí)左右10.脫色:染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次,再用脫色液脫色,直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰*剝膠時(shí)要小心,保持膠完好無(wú)損,染色要充分11.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析按下式計(jì)算相對(duì)遷移率:每個(gè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對(duì)數(shù)對(duì)它的相對(duì)遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線,量出未知蛋白的遷移率即可測(cè)出其分于量,這樣的標(biāo)難曲線只對(duì)同一塊凝膠上的樣品的分子量測(cè)定才具有可靠性五.分析計(jì)算=蛋白樣品距加樣端遷移距離cm溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離cm相對(duì)遷移率注意的問題蛋白質(zhì)電泳常用的SDS-PAGE:

8、單一亞基組成的蛋白質(zhì)非變性PAGE:多個(gè)不同亞基組成的蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性,操作時(shí)要戴手套在不連續(xù)體系SDS-PAGE中,當(dāng)分離膠加完后,需在其上加一層水,為什么 電極緩沖液中甘氨酸的作用 在不連續(xù)體系SDS-PAGE中,分離膠與濃縮膠中均含有TEMED和AP,試述其作用 樣品液為何在加樣前需在沸水中加熱幾分鐘 濃縮膠的作用濃縮膠的作用是有堆積作用,凝膠濃度較小,孔徑較大,把較稀的樣品加在濃縮膠上,經(jīng)過(guò)大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個(gè)狹窄的區(qū)帶.當(dāng)樣品液和濃縮膠選Tris/HCL緩沖液,電級(jí)液選Tris/甘氨酸.電泳開始后,HCL解離成氯離子,甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子.蛋白質(zhì)帶

9、負(fù)電荷,因此一起向正極移動(dòng),其中氯離子最快,甘氨酸根離子最慢,蛋白居中.電泳開始時(shí)氯離子泳動(dòng)率最大,超過(guò)蛋白,因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū),而電場(chǎng)強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比,因而產(chǎn)生較高的電場(chǎng)強(qiáng)度,使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動(dòng),形成以穩(wěn)定的界面,使蛋白聚集在移動(dòng)界面附近,濃縮成一中間層常見問題及解決辦法1.紋理和拖尾現(xiàn)象:由于樣品溶解不好引起的,克服的方法可以在加樣前離心,增加一些增溶輔助試劑如尿素 2.蛋白帶過(guò)寬,與鄰近泳道的蛋白帶相連是由于加樣量太多,可以減少上樣量 3.電泳時(shí)間比正常要長(zhǎng).可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電級(jí)緩沖系統(tǒng)地PH選擇錯(cuò)誤,即緩沖系統(tǒng)地PH和被分離物質(zhì)的等電點(diǎn)差別太小,或緩沖系統(tǒng)的離子

10、強(qiáng)度太高 4.指示劑成微笑符號(hào)(指示劑前沿呈現(xiàn)向上的曲線形),說(shuō)明凝膠的不均勻冷卻,中間部分冷卻不好,導(dǎo)致分子有不同的遷移率所致 5.指示劑成微笑符號(hào)(指示劑前沿呈現(xiàn)向下的曲線形),由于電泳槽的裝置不合適,尤其是凝膠和玻璃板組成的"三明治"底部有氣泡或靠近隔片得凝膠聚和不完全 6.凝膠時(shí)間不對(duì).通常膠在30min-1H內(nèi)凝.如果凝的太慢,可能是TEMED,APS劑量不夠或者失效.APS應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用,TEMED不穩(wěn)定,易被氧化成黃色.如果凝的太快,可能是APS和TEMED用量過(guò)多,此時(shí)膠太硬易裂 試劑配制(1) 30%丙烯酰胺(Acr):稱Acr30g,甲叉雙丙烯酰胺(Bis

11、)0.8g,加蒸餾水至100ml,過(guò)濾后置棕色瓶中. 4,1-2月(2)10%SDS(十二烷基磺酸鈉)(3)1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl緩沖液:稱取Tris18.2g,加入50ml水,用1mol/L鹽酸調(diào)pH8.8, 最后用蒸餾水定容至100ml(4)1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液:稱取Tris12.1g,加入50ml水,用1mol/L鹽酸調(diào)pH6.8, 最后用蒸餾水定容至100ml(5)0.05mol/LpH8.0Tris-HCl緩沖液:稱取Tris0.6g,加 入50ml水,用1mol/L鹽酸調(diào)pH8.0,最后用蒸餾水定容至100ml(7)10%過(guò)硫酸銨

12、(AP)(8)TEMED(四甲基乙二胺)(9)樣品溶解液:SDS(100mg)+巰基乙醇(0.1ml)+ 溴酚藍(lán)(2mg)+甘油(2g)+ 0.05mol/L pH8.0Tris-HCl(2ml),最后定容至10ml.(10)固定液:50%甲醇454ml,冰乙酸46ml混勻.(11)染色液:稱取考馬斯亮藍(lán)R250 0.125g,加上述固定液250ml,過(guò)濾后備用 (12)脫色液:冰乙酸75ml,甲醇50ml,加蒸餾水定容至1000ml (13)電極緩沖液(內(nèi)含0.1%SDS,0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸緩沖液pH8.3):稱Tris6.0g,甘氨酸28.8g,加入S

13、DS1g,加蒸餾水使其溶解后定容至1000ml影響因素1.溶液中SDS單體的濃度,當(dāng)單體濃度大于1mmol/L時(shí)大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的重量比為1:1.4,如果單休濃度降到0.5 mmol/L以下時(shí),兩者的結(jié)合比僅為1: 0.4這樣就不能消除蛋白質(zhì)原有的電荷差別,為保證蛋白質(zhì)與SDS的充分結(jié)合,它們的重量比應(yīng)該為1:4或1:32.樣品緩沖液的離子強(qiáng)度.SDS電泳的樣品緩沖液離子強(qiáng)度較低,通常是10100mmol/L3.二硫鍵是否完全被還原轉(zhuǎn)膜1 帶手套切2張(L:8.4cm,W:7.6cm)尼龍膜和12張(L:8.2cm,W:7.4cm)的濾紙,并用去離子水浸泡(浸泡時(shí)要讓水從下往上慢慢濕透

14、)過(guò)午.并用鉛筆在膜上做+/-標(biāo)記.2_在轉(zhuǎn)膜前10min,把膜取出浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中.3_在一托盤中注入500ml左右的轉(zhuǎn)移緩沖液,放入4塊海綿和12張濾紙及轉(zhuǎn)膜所用模具.4_在模具的黑色板上先鋪一塊海綿,接著依次放3張浸濕的濾紙,對(duì)齊后,用玻璃棒趕凈氣泡(很關(guān)鍵). 5_在濾紙上放凝膠,放的時(shí)候可加一點(diǎn)緩沖液在凝膠上.2_放好膠后,放尼龍膜.注:尼龍膜一旦放到膠上就不可再作移動(dòng),因?yàn)檫@時(shí)已有蛋白結(jié)合到膜上.然后,在膜上加一點(diǎn)緩沖液,用玻璃棒盡量使之鋪平 3_在膜上依次放好三張濾紙和海綿后,即可夾好轉(zhuǎn)膜模具.注:每層間都要注意趕氣泡 4_黑對(duì)黑,白對(duì)紅在電泳槽中放好模具.并加一塊冰在電泳槽中,

15、以防轉(zhuǎn)膜過(guò)程中溫度過(guò)高,影響轉(zhuǎn)膜效率.5_在用轉(zhuǎn)移緩沖液注滿電泳槽后.紅對(duì)紅,黑對(duì)黑接好轉(zhuǎn)膜裝置(及電泳裝置).設(shè)置電泳參數(shù):60v ,2.5hours麗春紅染色 1. 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,取下轉(zhuǎn)膜裝置,打開夾板,小心用鑷子取出尼龍膜,蛋白面朝上置于10ml 1×的麗春紅染液中,搖床上染色10min左右 2. 蛋白面朝上,用去離子水洗3-4次,至紅色基本褪去后,拍照.3. 再用去離子水洗膜至紅色完全褪去 封閉 取出兩塊膜,用濾紙將殘留液體吸凈后,將兩塊膜的蛋白面相對(duì)放入封閉液2._RT,1-2hours 或 4過(guò)夜一抗 1 把膜從冰箱中取出,RT ,30min. 注: 封閉液可回收 四個(gè)角蘸

16、點(diǎn)水鋪好保鮮膜后,加1:100的一抗500ul(抗體稀釋液495ul+5ul mouse p65抗體)于保鮮膜上 蛋白面朝下,使尼龍膜和一抗充分接觸.注避免產(chǎn)生氣泡,如有氣泡,可用鑷子將膜的四角輕輕提起,排出氣泡蓋上玻璃平皿,RT下孵育2hoursTBST 10min×2 ; TBS 10min×1二 抗 1.同上鋪好保鮮膜,加1:1000 的二抗1000ul(1ul mouse 抗人IgG-HRP+ 999ul抗體稀釋液)2.同上蛋白面朝下放好尼龍膜,要避免產(chǎn)生氣泡3._蓋上平皿,同上RT孵育2 hours4._TBST 10min ×2 ; TBS 10min

17、×1 顯 色 1 鋪好保鮮膜,分別滴加5滴發(fā)光試劑A和B,混合1min2_同上蛋白面朝下放好尼龍膜,要避免產(chǎn)生氣泡.反應(yīng)1min3_ 用鑷子夾起尼龍膜,用濾紙將多余的發(fā)光試劑吸盡,至沒有液體滴下為止4 將尼龍膜蛋白面朝上置于另外兩塊鋪好的保鮮膜上.用濾紙將膜邊的殘余液體吸凈后,折回保鮮膜,將之放到壓膜用的夾板里轉(zhuǎn)膜戴手套,避免用手接觸濾紙,凝膠和膜,因?yàn)槭稚系挠椭瑫?huì)阻斷轉(zhuǎn)移濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致 以適量的轉(zhuǎn)移Buffer室溫平衡濾紙,凝膠和膜5min方向正確:凝膠在陰極,膜在陽(yáng)極排去濾紙,膠和膜間的氣泡電轉(zhuǎn)時(shí)間:200mA 1-2h,轉(zhuǎn)移結(jié)束后,膜用麗春紅染色觀察蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置(3)封閉5%脫脂奶粉或3%BSA (含0.1%Tween20 TBS或PBS配制)時(shí)間:室溫3h或4 C 過(guò)夜 封閉