蟾蜍骨骼肌興奮與收縮實驗

1、蟾蜍骨骼肌興奮與收縮實驗【摘要】：目的：研究不同刺激強度/頻率對肌肉收縮的影響，探究神經(jīng)-肌肉接頭興奮傳遞和骨骼肌興奮的電變化與收縮之間的時間關(guān)系和特點。方法：制備蟾蜍坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本，利用RM6240多道生理信號采集處理系統(tǒng)和張力換能器，記錄不同刺激強度、刺激頻率對肌肉收縮張力的影響，以及不同波間隔對神經(jīng)、肌膜動作電位和肌肉收縮張力的影響。結(jié)果：在逐步增加刺激強度時，骨骼肌收縮的閾刺激和最大刺激強度分別是0.463±0.286V和0.611±0.389V，對應(yīng)的肌張力是1.172±0.958g和9.908±7.816g。改變刺激頻率時，產(chǎn)生完全強直

2、收縮的頻率是18.2±3.9Hz，對應(yīng)的骨骼肌收縮張力分別是41.76±28.01g。用甘油任氏液處理后肌肉張力逐漸減弱至消失。結(jié)論：當(dāng)刺激強度在閾強度與最大刺激強度范圍內(nèi)時，隨著刺激強度的增加，骨骼肌收縮的幅度也是增大。隨著刺激頻率的增加，骨骼肌的反應(yīng)依次為單收縮、不完全強直收縮和完全強直收縮，骨骼肌收縮的幅度也是增大。同步觸發(fā)雙刺激不同波間隔引起收縮強度不同。甘油任氏液使肌肉失去收縮活力，但依舊有電位產(chǎn)生?！娟P(guān)鍵詞】：蟾蜍坐骨神經(jīng)-腓腸肌 電刺激 刺激強度 刺激頻率 收縮張力1.引言骨骼肌的收縮功能對人體正常生命活動具有重要意義，其主要作用是保持身體姿勢和產(chǎn)生隨意運動，

3、另外還參與呼吸、咀嚼、吞咽、語言活動及產(chǎn)熱等。骨骼肌屬于隨意肌，在中樞神經(jīng)控制下接受軀體運動神經(jīng)的支配，神經(jīng)纖維傳出神經(jīng)沖動，經(jīng)神經(jīng)-肌接頭把興奮傳遞給骨骼肌，引起骨骼肌的興奮，最終通過興奮-收縮耦聯(lián)機制引起骨骼肌的收縮1。 本實驗通過研究蟾蜍坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本，觀察及測量不同刺激強度、頻率下腓腸肌張力變化，不同波間隔下神經(jīng)干電位、肌細胞電位、腓腸肌張力各自變化及其相互聯(lián)系，探究神經(jīng)-肌接頭的興奮傳遞特性和骨骼肌興奮-收縮耦聯(lián)的電生理特點。2.實驗材料2.1 實驗對象：蟾蜍（Toad）一只 （浙江大學(xué)動物實驗中心提供）2.2 實驗儀器：RM6420BD型多通道生理信號采集處理系統(tǒng)（成都儀器廠

4、）肌肉張力換能器JZJ01型（成都儀器廠）神經(jīng)-肌肉標(biāo)本盒探針、玻璃分針、鋅銅弓、手術(shù)剪刀2.3 實驗藥品和試劑：任氏液、甘油高滲任氏液3. 實驗方法3.1 蟾蜍離體坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本制備雙毀髓法處死蟾蜍，針尖刺入顱腔毀腦時，針的傾斜角度必須很小剝離出腓腸肌，然后按常規(guī)操作制備蛙和蟾蜍離體坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本，制備好的標(biāo)本放置在盛有任氏液的培養(yǎng)皿中。3.2 實驗系統(tǒng)連接將坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本固定在肌槽上，并將坐骨神經(jīng)搭在刺激電極上，刺激的輸出線與肌槽刺激電極連接。將張力換能器用雙凹夾固定于鐵支臺上，其換能器的輸出線插入計算機的信號輸人插口將腓腸肌跟腱結(jié)扎線的一端與張力換能器的簧片相連，調(diào)節(jié)好扎線

5、的張力，不可過松或過緊，此連線應(yīng)與桌面垂直(保證肌肉一旦收縮，即可牽動張力傳感器的應(yīng)變梁)，啟動RM6240系統(tǒng)軟件，調(diào)節(jié)微距調(diào)節(jié)器，將前負荷調(diào)至1.82.2g。3.3 刺激強度對骨骼肌收縮的影響刺激方式單次，刺激幅度0.10.3V可調(diào)，刺激波寬0.1ms.開始記錄，點擊“刺激”按鈕，刺激強度從0.1V逐漸增大，強度增量0.020.05V，連續(xù)記錄肌肉收縮曲線,記錄閾刺激和最大刺激值并測量每一刺激強度所對應(yīng)的肌肉收縮張力3.4刺激頻率對骨骼肌收縮的影響刺激頻率按1Hz、2 Hz、3 Hz、4 Hz、5 Hz、30 Hz逐漸增加（或刺激間隔逐漸減?。B續(xù)記錄不同頻率時的肌肉收縮曲線，觀察不同頻

6、率時的肌肉收縮形態(tài)和張力變化。RM6240系統(tǒng)在記錄結(jié)束后，在通道左側(cè)的“處理”下拉菜單中選擇“刺激參數(shù)標(biāo)注”，可顯示刺激頻率。觀察各刺激頻率所對應(yīng)的肌肉收縮最大張力。3.5 坐骨神經(jīng)干不應(yīng)期的測定 測定神經(jīng)干動作電位、骨骼肌動作電位，肌肉收縮的同步關(guān)系及骨骼肌的不應(yīng)期：保持刺激強度（最大刺激強度），刺激持續(xù)時間（0.1 ms），刺激頻率（20ms）一定，采用雙刺激，測量不同波間隔下三者的收縮曲線（波間隔分別為0.5 ms，2 ms，10 ms），記錄收縮曲線和相應(yīng)的骨骼肌收縮張力大小。3.6 觀察甘油高滲任氏液處理對骨骼肌收縮的影響 用浸潤20%-30%甘油高滲任氏液的棉花包裹腓腸肌，每隔3

7、0 s 用單刺激刺激標(biāo)本一次，記錄出現(xiàn)動作電位而腓腸肌不收縮的時間。3.7統(tǒng)計處理 結(jié)果以X±S表示，Students t-test檢驗與方差分析。4.實驗結(jié)果4.1 用鋅銅弓刺激：刺激神經(jīng)時腓腸肌收縮，刺激肌肉時腓腸肌收縮。4.2 不同刺激強度刺激坐骨神經(jīng)對腓腸肌收縮張力的影響：數(shù)據(jù)記錄見下表 閾刺激最大刺激 樣本強度（V）收縮張力（g）強度（V）收縮張力（g）10.220 1.629 0.280 13.211 20.210 2.050 0.270 21.930 30.650 0.500 1.200 8.700 40.600 0.916 0.750 1.924 50.250 3.3

8、10 0.310 22.240 60.260 0.586 0.340 2.530 70.520 0.147 0.640 2.140 80.290 1.430 0.600 14.840 90.260 0.458 0.370 7.180 101.100 0.696 1.350 4.380 average0.436 1.172 0.611 9.908 SD0.286 0.958 0.389 7.816 下圖為一次強度刺激實驗的記錄波形（縱坐標(biāo)收縮張力與橫坐標(biāo)刺激強度）可見骨骼肌收縮的閾刺激和最大刺激強度分別是0.463±0.286V和0.611±0.389V，對應(yīng)的肌張力是1.1

9、72±0.958g和9.908±7.816g。兩者進行t檢驗，有顯性差異（p<0.05)，說明閾刺激強度時的肌肉收縮力顯著低于最大刺激強度時的肌肉收縮力。當(dāng)刺激小于閾值時，骨骼肌沒有收縮，在閾刺激與最大刺激強度之間，腓腸肌的收縮力隨著刺激強度的增大而增大大，刺激強度大于最大刺激強度，腓腸肌的收縮力不再增大。4.3 不同頻率刺激刺激坐骨神經(jīng)對腓腸肌收縮張力的影響：數(shù)據(jù)記錄見下表 單收縮不完全強直收縮完全強直收縮 樣本頻率(Hz)張力(g)頻率(Hz)張力(g)頻率(Hz)張力(g)1110.26 5 19.60 20.0 48.542122.16 5 27.47 22.

10、0 96.17316.78 5 12.64 15.0 41.22411.45 5 1.91 12.0 6.125121.16 5 27.28 19.0 75.49611.98 5 4.76 21.0 32.98710.19 5 0.73 19.0 4.408116.08 5 24.69 17.0 34.22917.14 5 10.08 24.0 46.351013.85 5 8.79 13.0 32.06average19.10 5 13.79 18.2 41.76SD08.11 0 10.30 3.9 28.01下圖為一次頻率刺激實驗的記錄波形（縱坐標(biāo)收縮張力，橫坐標(biāo)刺激頻率）刺激頻率為1H

11、z時刺激頻率肌肉表現(xiàn)為單收縮，5Hz時表現(xiàn)為不完全強直收縮，最低頻率為18.2±3.9Hz。不完全強直最大收縮力和完全強直最大收縮力顯著高于單收縮的最大收縮力（p1<0.05；p2<0.05）。由此可見在逐漸增加刺激頻率時，收縮形式依次出現(xiàn)單收縮、不完全強直收縮和完全強直收縮，隨著頻率刺激的逐漸增大，腓腸肌的收縮力不斷增加，到完全強直收縮后，再增加刺激頻率，腓腸肌的收縮力增大趨緩直至不再變化。4.4 不同刺激波間隔對肌肉收縮的影響：數(shù)據(jù)記錄見下表雙刺激波間隔 樣本0. 5ms2ms10ms10.59 8.28 13.92 210.22 13.63 22.20 34.07

12、4.09 12.62 40.90 2.78 3.68 513.90 15.40 32.80 61.08 5.59 5.31 74.21 9.81 9.89 83.04 8.57 8.87 99.64 7.91 11.28 102.93 11.10 11.91 average5.06 8.72 13.25 SD4.59 3.99 8.52 以下三圖分別為一次試驗中記錄下的間隔分別為0.5ms,2ms,10ms時的波形刺激間隔為0.5ms肌收縮張力5.06±13.73g，2ms肌收縮張力8.72±22.9g，10ms肌收縮張力13.25±35.37g。實驗得出不同波間

13、隔的神經(jīng)干動作電位與肌膜動作電位曲線有所不同。4.5 甘油高滲任氏液處理對骨骼肌收縮的影響：用甘油高滲任氏液處理后的骨骼肌收縮張力逐漸減小至消失，而肌電位和神經(jīng)電位依舊存在。以下兩圖是一次實驗中用甘油高滲任氏液處理后一分鐘和4.5分鐘后的波形記錄。可見在處理后一分鐘時仍有一定張力存在，而4.5分鐘時則基本消失。而肌電位和神經(jīng)電位依舊存在。5.討論：5.1 閾刺激與最大刺激：腓腸肌大多數(shù)是快顫搐型肌纖維1 ，支配腓腸肌收縮的神經(jīng)是A纖維， A纖維的直徑有很大差異，其閾值也有較大差異1，2。單干恒定時間的方波電壓刺激坐骨神經(jīng)干，電壓低于閾值的強度刺激，坐骨神經(jīng)干支配腓腸肌的神經(jīng)纖維不發(fā)生興奮，其所

14、支配的肌細胞也不會發(fā)生興奮和收縮。刺激電壓達到閾強度時，坐骨神經(jīng)干中閾值最低的神經(jīng)開始興奮，其所支配的運動單位的肌纖維興奮并發(fā)生收縮，刺激強度逐漸增大，坐骨神經(jīng)干中興奮的神經(jīng)纖維增加，興奮和收縮的運動單位增加，其所募集的收縮張力也增加。刺激電壓達到使支配腓腸肌的A纖維全部興奮，腓腸肌全部的運動單位增加都興奮并收縮，收縮張力達單收縮最大值。5.2 單收縮、不完全強直收縮、完全強直收縮：以最大刺激電壓的連續(xù)脈沖刺激坐骨神經(jīng)干，剌激波的間隔時間大于單收縮的持續(xù)時間，肌肉收縮波呈現(xiàn)與刺激頻率相同的單收縮波；刺激波間隔小于單收縮的持續(xù)時間，肌肉收縮波發(fā)生融合(總和），融合發(fā)生于舒張期，出現(xiàn)不完全強直收縮

15、；融合發(fā)生于收縮期，出現(xiàn)完全強直收縮波，但神經(jīng)干動作電位不發(fā)生融合。 隨著刺激波間隔的減小，腓腸肌收縮張力也逐漸增大，強直收縮產(chǎn)生的張力顯著大于單收縮。肌肉單收縮時，胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高的持續(xù)時間太短，被激活的收縮蛋白尚未產(chǎn)生最大張力時，胞漿Ca2+濃度即已開始下降，單收縮產(chǎn)生的張力不能達到胞漿內(nèi)Ca2+濃度相應(yīng)的最大張力。強直收縮時，肌細胞連續(xù)興奮，引起終池中的鈣連續(xù)釋放胞漿內(nèi)的Ca2+濃度持續(xù)升高，使肌肉未完全舒張或未舒張時進一步收縮，使收縮張力逐漸增大，完全強直收縮時收縮張力達到了一個穩(wěn)定的最大值3。5.3 不應(yīng)期：刺激波間隔小于0.5ms時，神經(jīng)干的第2個動作電位消失，肌肉的收縮顯著降低。刺激波間隔小于神經(jīng)干不應(yīng)期，第二個刺激落在神經(jīng)干的絕對不應(yīng)期內(nèi)，神經(jīng)