westernblottingprotocolWWZ

1、Western blotting protocolBy Wei-Zhang Wang-070610A. 溶液和試劑注意：溶液的配制最好用Milli-Q或同等純度的水!所有下面所用容器使用前都必須洗干凈，并用雙蒸水潤(rùn)洗，最后晾干。A1. 抑制劑：蛋白酶抑制（35mg/ml PMSF）：用無(wú)水乙醇稀釋為35mg/ml，室溫下避光保存，可使用34個(gè)月。（MW：172.4g）絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶抑制劑（5M 氟化鈉（NaF）：取2.1克氟化鈉置于10ml Milli-Q水中，然后vortex劇烈震蕩使其充分溶解，最后分裝成10l/管，置于-20保存（解凍后必須1小時(shí)內(nèi)使用）。酪氨酸磷酸酶抑制劑(1M

2、釩酸鈉（Sodium Orthovanadate）)：稱(chēng)一定量的釩酸鈉置于水中，用鹽酸調(diào)pH至10.0，加熱沸騰至完全溶解且溶液為無(wú)色，待溶液冷卻至室溫后再調(diào)pH至10.0，加熱至溶液變無(wú)色，冷卻后再調(diào)pH至10.0，如此反復(fù)操作至室溫下pH穩(wěn)定在10.0即可，最后定容至濃度為1M。此配制方法是參考網(wǎng)上的WB protocol，實(shí)際是否如此配制尚未實(shí)踐過(guò)！A2. 1PBS（pH7.4）A3. 1SDS裂解液(20ml): Stock 終濃度 Tris-HCL(pH6.8 at 25) 1M Tris(pH6.8) 1.25ml 62.5mM SDS 0.4g 2(w/v) Glycerol(甘

3、油) 2ml 10% DTT(二硫蘇糖醇) 1M 1ml 50mM Bromophenol blue(溴酚藍(lán)) 0.01%(w/v)A4. 轉(zhuǎn)移緩沖液：74.5g甘氨酸,15gTris堿加水定容至1000ml，成5stock，4保存。使用前稀釋成1：取200ml 5stock轉(zhuǎn)膜緩沖液，然后加入600mlddH2O，最后加入200ml無(wú)水甲醇至1L，4預(yù)冷2h以上。A5. Tris-甘氨酸電泳buffer(pH8.3)：Tris base 15.1g 和94g甘氨酸，溶解在900ml水中，然后加入5g SDS，再加水至1000ml，成5X。A6. 配膠所用溶液： 1）30的凝膠儲(chǔ)備液：Acyl

4、 29g+Bis 1 g溶于100ml水，用濾紙過(guò)濾至棕色瓶中，4避光保存。每次使用前先放置室溫15-30min。 2）1.5 mol/L Tris-HCL, pH8.8：18.16g Tris base 溶解在80ml水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.8，待溶液回復(fù)到室溫再用6M的鹽酸調(diào)pH至8.8，最后加水至100ml，室溫保存。 3）1.0 mol/L Tris-HCL, pH6.8：12.12g Tris base 溶解在80ml水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.8，待溶液回復(fù)到室溫再用6M的鹽酸調(diào)pH至6.8，最后加水至100ml，室溫保存。 4）10%SDS：稱(chēng)10克SDS溶于100ml水

5、中，儲(chǔ)存于室溫。 TEMED（四甲基乙二胺）：4避光保存。 5）10APS(過(guò)硫酸銨)：配制10ml,分裝100-200uL至0.5ml離心管中，-20保存。解凍后4保存，不超過(guò)1周。A7. 10Tris Buffered Saline（TBS）： 24.2g Tris堿，80gNaCl，定容至1L，HCL調(diào)pH至7.6。A8. 洗膜液：1TBS中含0.1Tween-20(0.1TBS/T)；或者是1PBS中含0.1 Tween-20(0.1PBS/T) 奶粉封閉液（30ml）：30ml洗膜液（0.1TBS/T）加入1.5g脫脂奶粉，室溫下攪拌半小時(shí)以上。終濃度為1TBS含0.1Tween-2

6、0（0.1TBS/T），5脫脂奶粉（w/v）。BSA封閉液（15ml）：15ml洗膜液（0.1TBS/T）加入0.45g BSA，顛倒混勻。終濃度1TBS含0.1Tween-20，3BSA（w/v）。（牛血清白蛋白BSA）以上封閉液可用1PBS/T代替1TBS/T。注意：一般情況下，BSA用于多克隆抗體的封閉，脫脂奶粉用于單克隆抗體的封閉！建議第一次使用的抗體可同時(shí)用這兩種方法進(jìn)行封閉，以確定哪種方法的封閉效果最好。假如兩種方法的效果無(wú)明顯差別，必須用脫脂奶粉進(jìn)行封閉（脫脂奶粉比BSA便宜很多?。9. 一抗稀釋液（8ml）：8ml洗膜液（0.1TBS/T）加入0.08g BSA（終濃度1%

7、BSA），混勻后加入抗體。常用的抗體加入10%的疊氮鈉（1：1000稀釋?zhuān)K濃度為0.01%，抑菌作用）4保存，不常用的抗體-20保存。A10. 二抗稀釋液（10ml）：用10ml 0.1TBS/T配制（1：500010000）。注意：CST推薦使用NC膜，此protocol對(duì)NC膜進(jìn)行了優(yōu)化！同時(shí)PVDF（聚偏氟乙烯）（使用前用純甲醇泡膜半小時(shí)）也可以使用。B 試驗(yàn)步驟B1. 準(zhǔn)備樣品使用前1ml 1SDS裂解液加入2.5l PMSF（苯甲基磺酰氟），1l 氟化鈉和1l釩酸鈉。終濃度為1mM PMSF、5mM 氟化鈉和1mM 釩酸鈉。注：氟化鈉和釩酸鈉是磷酸酶抑制劑，因此，如果檢測(cè)磷酸化蛋白

8、，則必須在1SDS裂解液加入這兩種抑制劑。1） 按實(shí)驗(yàn)需要準(zhǔn)備好細(xì)胞：懸浮細(xì)胞：400g離心5min收集細(xì)胞，1PBS洗3次，前2次用10/50ml離心管收集并洗細(xì)胞，最后1次轉(zhuǎn)移至1.5ml管中，并計(jì)算細(xì)胞數(shù)。按比例加入1SDS裂解液，一般為4 x 106細(xì)胞加入至少100l裂解液，用heating block 95煮5-10分鐘，期間振蕩一次，至用10uL槍吸取不感覺(jué)有粘稠則可。貼壁細(xì)胞：去掉培養(yǎng)基，1PBS洗3次（去掉培養(yǎng)基中的血清），每個(gè)孔（12孔板）加入適量的1SDS裂解液。以Hep3B為例（檢測(cè)磷酸化蛋白），一般為2x 105細(xì)胞（70的confluence）加入75l裂解液（其它

9、細(xì)胞可根據(jù)細(xì)胞大小及密度調(diào)整裂解液的量），迅速用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至1.5ml管中，用heating block 95煮5-10分鐘，期間振蕩一次，至用10uL槍吸取不感覺(jué)有粘稠則可。其他細(xì)胞所加裂解液的量請(qǐng)參考附錄3。2） 12，000g，4離心8min，收集上清。3） 直接上樣跑膠或者分裝-80C長(zhǎng)期保存。B2 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳1）制備分離膠（5ml/gel）注：不同的分離膠配方可參見(jiàn)附錄2或者分子克隆p1716表A8-9。分離范圍：丙稀酰胺濃度線(xiàn)性分離范圍kDa15 10-431212-631020-807.536-945.057-2122）小心注入分離膠，留2 c

10、m左右的空間（制膠架綠色邊框下緣）給濃縮膠，頂層覆蓋去離子水或水飽和正丁醇。靜置約30分鐘。3) 制備濃縮膠（2ml/gel）4）將濃縮膠注入分離膠上端，注意避免氣泡。5）插入梳子，待濃縮膠凝固（膠與梳子之間有明顯的分界，加上分離膠的凝固時(shí)間要大于2h），用雙蒸水將孔洗凈，去除凝膠碎片，然后用濾紙吸干水。6）將膠放入電泳槽，上下槽均加入1電泳緩沖液（反復(fù)使用不要超過(guò)3次）。7）上樣：取3ul prestained marker加入適量1SDS裂解液（使得總體積與sample孔一樣），load到膠最右側(cè)的孔中。Sample上樣量一般為1025l，先用heating block 95煮5-10分鐘

11、，期間振蕩一次，然后快速離心再上樣跑膠；在沒(méi)有l(wèi)oad sample的孔中加入等體積的1SDS裂解液。8) 電泳：開(kāi)始為恒流10-15mA每塊膠，當(dāng)跑過(guò)濃縮膠后，將電流加大到25mA每塊膠，電泳時(shí)間根據(jù)目標(biāo)蛋白的大小及marker的位置確定，一般為目標(biāo)蛋白跑到分離膠的三分之二的位置即可。B3 膜轉(zhuǎn)移不同大小蛋白的轉(zhuǎn)膜條件：蛋白x(kDa)轉(zhuǎn)膜液轉(zhuǎn)膜條件x2014.9g甘氨酸（0.2M），3.0gTris堿（25mM），200ml甲醇（20%，pH8.5），用水定容至1L。250mA恒流轉(zhuǎn)3 hrs20x120配方同上250mA恒流4 hrs120x20014.9g甘氨酸（0.2M），3.0gT

12、ris堿（25mM），200ml甲醇（20%，pH8.5），0.05%SDS，用水定容至1L。250mA恒流轉(zhuǎn)6 hrs200x配方同上500mA恒流轉(zhuǎn)4 hrsB1. NC膜（表達(dá)豐度高或大于25kDa的蛋白用0.45um孔徑的NC膜，小于25kDa且表達(dá)豐度低的蛋白用0.22um孔徑的NC膜，0.22um孔徑的NC膜比0.45um孔徑的NC膜貴很多）用鉛筆在膜正面的最上方寫(xiě)上待檢測(cè)蛋白名稱(chēng)、日期；然后先把膜置于雙蒸水面自然浸潤(rùn)10分鐘（利用虹吸的作用排掉膜的空氣，注意不要把膜直接浸入水中）后，再連同2張3mm濾紙和海綿完全浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中15分鐘。B2. 在膠的最右側(cè)上方切角做記號(hào)后，完全

13、浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中15分鐘。B3.制備“夾心餅”：依次按如下順序：纖維墊-濾紙-NC膜凝膠濾紙-纖維墊。轉(zhuǎn)膜后marker必 須在膜正面的最右側(cè)。 注意：每加一種物品都要對(duì)齊，并用10ml離心管排氣泡，確保沒(méi)有氣泡。B4. 轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)1）確定。NC膜一邊接正極（紅色），凝膠一邊接負(fù)極（黑色）。接電源前再三確認(rèn)。C 膜封閉和抗體孵育注意：下面所用溶液的量適用于5cm8cm（40cm2）的膜，用于不同面積的膜可根據(jù)比例自行調(diào)整！C1. 轉(zhuǎn)膜以后，用15ml的1TBS室溫洗膜10分鐘；C2. 30ml奶粉封閉液或者15ml的BSA封閉液室溫孵育2h或者4平緩搖動(dòng)（20-30rpm）過(guò)夜；C3.

14、 15ml的0.1TBS/T洗膜3次，每次搖5分鐘（60rpm）；C4. 加入8ml一抗稀釋緩沖液（抗體根據(jù)說(shuō)明稀釋?zhuān)?，室? hrs或者4平緩搖動(dòng)過(guò)夜(對(duì)于磷酸化抗體一般情況下都要4過(guò)夜，因?yàn)榱姿峄鞍锥鄶?shù)豐度較低)，回收一抗，按1：1000加入疊氮鈉（可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)）4保存（不常用的抗體可-20長(zhǎng)期保存），可重復(fù)使用！C5. 15ml的0.1TBS/T洗膜3次，每次搖5分鐘（60rpm）；C6. 加入二抗（10ml TBST配制，一般為1：5000-10000稀釋?zhuān)?，室溫平緩?0-30rpm）搖動(dòng)1h；C7. 15ml的0.1TBS/T洗膜3次，每次搖5分鐘（60rpm）。最后用TBS浸

15、泡；注：每次應(yīng)從雜交盒的同一角倒出液體，然后加入洗膜液潤(rùn)洗一次，馬上倒掉，再加入洗膜液搖5min。每次加入液體應(yīng)沿壁，而不能對(duì)著膜。D顯影，定影D1. 顯色步驟：先鋪吸水紙，在吸水紙上再鋪上保鮮膜；分別將水、顯影液（顏色變黑則不能用）和定影液倒入各自的盤(pán)中。2.5ml ECL-A 和2.5ml ECL-B混合,避光。將ECL混合液、膜等拿入暗房。關(guān)好門(mén)，反鎖，拉回布。ECL混合液倒入小盒中，膜用止血鉗夾住一角提起，用吸水紙吸取膜邊緣多余的液體后放入ECL混合液中，室溫手搖5min（使得ECL均勻的鋪過(guò)膜）。5min后用吸水紙將膜邊緣多余的液體吸取，然后把膜置于保鮮膜上，膜面朝下包好，然后膜面朝

16、上置于夾子中，將剪好的X-film（注意手只能拿X-film的邊緣，且手/手套必須保持潔凈和干燥。X-film大小與待檢測(cè)區(qū)域大小相當(dāng)即可，并在marker一側(cè)的上方剪角）放于膜上， (注意：取膠片時(shí)要把燈光調(diào)到最小，且不要對(duì)著燈光，應(yīng)背著燈光。)，根據(jù)條帶的亮度來(lái)調(diào)整曝光時(shí)間，一般可先曝光2min，觀(guān)察條帶的強(qiáng)度，再確定最佳的曝光時(shí)間。ECL工作液在室溫下避光保存至少2h以上，盡量集中安排實(shí)驗(yàn)。D2. 顯影，定影:取出X-film置于顯影液中一定時(shí)間后(視目的條帶強(qiáng)度與背景而定)，水洗一次再置于定影液中定影5min以上，最后泡水。當(dāng)檢測(cè)條帶較弱時(shí)，可通過(guò)延長(zhǎng)曝光和顯影時(shí)間來(lái)增強(qiáng)信號(hào)。E 一抗

17、和二抗的strippingE1. 一抗的stripping buffer：For 100ml20ml SDS 10%12.5ml Tris HCl（pH 6.8 0.5M）67.5ml 超純水0.8ml -mercaptoethanol（通風(fēng)櫥中加入）操作步驟（下面所有步驟必須蓋上蓋子）：1. 將30ml stripping buffer在50水浴中預(yù)熱10min；2. 把待strip的膜放入預(yù)熱的buffer中；3. 50水浴30min，每10min手搖一次；4. 30min后，用0.1TBS/T洗膜3次，每次10min以上，直至沒(méi)有了2-ME的氣味為止（因?yàn)?ME對(duì)一抗是有害的?。?；5.

18、重新封閉膜。E2. 二抗的stripping buffer：For 100ml20ml 5M NaCl，加入80ml 超純水，使NaCl終濃度為1M。操作步驟：1. 將stripping buffer在37水浴中預(yù)熱10min；2. 把待strip的膜放入預(yù)熱的buffer中；3. 37水浴30min，每10min手搖一次；4. 30min后，用0.1TBS/T洗膜3次，每次10min；5. 重新封閉膜。注：當(dāng)待檢測(cè)的蛋白不止一種，且一抗種屬來(lái)源不同時(shí)，strip二抗即可。附錄1：顯影液和定影液配方顯影液體系A(chǔ)液B液C液自來(lái)水25L5L204ml182ml1L200ml8.2ml7.3ml785ml500ml100ml4.1ml3.65ml393ml30L5L204ml182ml1L167ml6.8ml6.1ml820ml500ml83.5ml3.4ml3.1ml410ml定影液體系A(chǔ)液B液自來(lái)水25L5L460ml1L200ml18.4ml782ml500m