脈沖電磁場結(jié)合堿性成纖維細(xì)胞生長因子促進(jìn)軟骨修復(fù)的實驗研究

1、脈沖電磁場結(jié)合堿性成纖維細(xì)胞生長因子促進(jìn)軟骨修復(fù)的實驗研究         11-02-09 10:04:00     編輯：studa20                作者：胡小鵬，陶海榮，許志興，金文杰，傅智軼，丁歡 【摘要】  研究脈沖電磁場結(jié)合堿性成纖維細(xì)胞生長因子促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的作用機制。40只

2、新西蘭大白兔，隨機分成4組，每組10只。在雙側(cè)股骨髁關(guān)節(jié)面制成直徑為0.6 cm、深0.3 cm的軟骨缺損，分別以bFGF、磁場、磁場結(jié)合bFGF治療，另外一組為空白組未給予治療。分別于術(shù)后4、8、12和16周取材，行大體形態(tài)觀察、組織學(xué)檢查和透射電鏡檢查，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果表明：磁場結(jié)合bFGF組在4周時基底層的軟骨樣組織增生，而磁場組、bFGF組少量軟骨樣組織增生。8、12周結(jié)合組透明樣軟骨層明顯增厚，免疫組化型膠原多。而磁場組、bFGF組軟骨層增厚，細(xì)胞數(shù)量相對少，無型膠原?？瞻捉M偶見軟骨樣組織或纖維組織。16周結(jié)合組軟骨層與正常軟骨相似，軟骨細(xì)胞成熟，bFGF、磁場組纖維軟骨細(xì)胞團(tuán)

3、狀增生。改良的軟骨缺損修復(fù)Wakitani評分有顯著性差異，結(jié)合組最大。說明低能量脈沖電磁場結(jié)合堿性成纖維細(xì)胞生長因子修復(fù)軟骨缺損，治療方法簡便，效果良好，可應(yīng)用于臨床。 【關(guān)鍵詞】  脈沖電磁場；堿性成纖維細(xì)胞生長因子；軟骨缺損；修復(fù)    Abstract：To study mechanism of the cartilage repair with pulsed electromagnetical fields combined with b-fibral  growth factor.40 New Zealand white rabbi

4、ts were devided into 4 groups   as bFGF group,magnetic group, pulsed electromagnetical fields combined with b-fibral  growth factor group and  nontreatment group randomly. The animals were sacrificed at 4、8、12 and 16 weeks after treatment. The specimens were examined with the gro

5、ss, histological and TEM evaluation . Results showed that four weeks after treatment,cartilage-like tissue grew at the bottom. The cartilage of germinative layer and basal layer grew better than that in bFGF group, magnetic group. Chondrocytes grew better and secreted collagen , while the cartilage

6、like tissue proliferated less. At 8 and 12 weeks, fibrous cartilage in combined group was thicker than that in other groups, and the cells were larger and muturer and more collagen .At 16 weeks, the cartilage was similar to normal one. The chondrocytes were muturer. Wakitani score of  cartilage

7、 repair was significantly different in all groups, it was better in the combined group at 16 weeks.Cartilage repairing defects with pulsed electromagnetical fields combined with b-fibral  growth factor is a promising method. It can be used in clinic in the future.    Key words：Pu

8、lsed electromagnetical fields；B-fibral growth factor；Cartilage defect repair    由創(chuàng)傷和退行性病變引起的骨關(guān)節(jié)炎是臨床常見的疾病，其治療是臨床的難題之一。常見的治療方法有鉆孔術(shù)、微骨折、骨膜和軟骨膜移植、細(xì)胞移植、骨軟骨移植等。其結(jié)果是纖維軟骨修復(fù)或透明樣軟骨修復(fù)，很快退變，治療效果不理想1。利用細(xì)胞生長因子、基因轉(zhuǎn)染等2促進(jìn)軟骨修復(fù)是近年來軟骨組織工程研究的熱點。我們用低強度脈沖電磁場結(jié)合堿性成纖維細(xì)胞生長因子治療軟骨缺損，取得較好療效?，F(xiàn)報告如下。   

9、; 1  材料與方法    40只新西蘭大白兔，平均體重2.4 Kg（2.22.5 Kg），隨機分成4組，每組10只。分為磁場結(jié)合bFGF組、bFGF組、磁場組和空白對照組。以30 mg/kg戊巴比妥鈉耳緣靜脈麻醉。麻醉后剪毛、消毒、鋪巾，取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)正中切口，切開2 cm的皮膚，切開深筋膜，髕骨內(nèi)側(cè)切開關(guān)節(jié)囊，暴露股骨內(nèi)外側(cè)髁，在雙側(cè)股骨髁關(guān)節(jié)面分別制成直徑為0.6 cm,深0.3 cm的軟骨缺損。bFGF組雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)每周注入bFGF 10 ug一次，連續(xù)三周。磁場組每天給予低能量脈沖電磁場（3000高斯，50 Hz）刺激6 h， 磁場結(jié)合bFGF

10、組給予bFGF注射和低能量脈沖電磁場，空白組軟骨缺損模型制成后不做任何處理。術(shù)后青霉素鉀(單位40萬)肌內(nèi)注射三天。  1.1  觀察指標(biāo)    1.1.1  大體標(biāo)本形態(tài)觀察  術(shù)后4、8、12和16周取2只兔子，麻醉注射處死，取材，觀察標(biāo)本修復(fù)后軟骨面的光澤、完整性、周圍軟骨情況，關(guān)節(jié)的活動度等。    1.1.2  組織學(xué)檢查  大體標(biāo)本形態(tài)觀察后，標(biāo)本用40 g/L 多聚甲醛/PBS 緩沖液固定，150 g/L EDTA 脫鈣，石蠟包埋切片，HE染色、型膠原免疫組化染

11、色（ 操作步驟按試劑盒內(nèi)說明進(jìn)行）。觀察組織學(xué)形態(tài)變化，觀察指標(biāo)見組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)。    1.1.3電鏡檢查  術(shù)后4、8、12、16周兔處死后，每組各取2只股骨頭，經(jīng)2.5%戊二醛固定液固定，4.13%EDTA脫鈣,1%鋨酸后固定，脫水,0.5%醋酸鈾染色，包埋。觀察軟骨細(xì)胞成熟度。    1.2  統(tǒng)計學(xué)方法    采用SPSS11.0軟件包處理，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行改良的軟骨缺損修復(fù)Wakitani評分，ANOVA進(jìn)行分析。 樣本用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。  &#

12、160; 2  結(jié)果    2.1  大體標(biāo)本    4周時磁場結(jié)合bFGF組乳白色的纖維軟骨樣組織覆蓋，新生的軟骨未完全填平缺損。磁場組乳白色纖維樣組織覆蓋，量少。bFGF組纖維組織填充，淡黃色或白色。空白對照組仍無組織填充。8周時磁場結(jié)合bFGF組新生軟骨增生明顯，低于軟骨面（見圖1）。磁場組、bFGF組軟骨樣組織增多?？瞻讓φ战M少數(shù)有纖維組織充填，缺損旁邊的軟骨有變性破壞。12周磁場結(jié)合bFGF組新生軟骨飽滿外，形態(tài)和顏色與正常軟骨相似。bFGF組少量軟骨樣組織增生。空白組有纖維組織增生。16周磁場結(jié)合bFG

13、F組軟骨進(jìn)一步成熟，新生軟骨略平或向表面隆起,與正常軟骨相似（見圖2）?？瞻捉M骨質(zhì)增生，周圍軟骨有磨損，有破壞。    2.2  HE染色和免疫組織學(xué)檢查    4周時，HE染色磁場結(jié)合bFGF組基底軟骨樣細(xì)胞和纖維細(xì)胞，少量陷窩內(nèi)的細(xì)胞存在纖維組織（見圖3）。磁場組和bFGF組可見少量的基底軟骨樣細(xì)胞和纖維細(xì)胞。空白組無軟骨和纖維生長。8周時磁場結(jié)合bFGF組軟骨層明顯增厚，有軟骨島，細(xì)胞體積大，數(shù)量多。軟骨基底層和生發(fā)層均良好（見圖4），可見 型膠原。磁場和bFGF組以纖維細(xì)胞為主，偶見軟骨島。12周時磁場結(jié)合bFGF組

14、表層細(xì)胞生長良好（見圖5）。而bFGF組和磁場組可見大量的纖維組織，bFGF組有軟骨樣細(xì)胞?？瞻捉M有大量的纖維細(xì)胞。16周時磁場結(jié)合bFGF組軟骨層與正常軟骨相似，細(xì)胞排列成柱狀（見圖6）。免疫組化顯示型膠原進(jìn)一步增多(見圖7)，bFGF、磁場組均有纖維軟骨細(xì)胞團(tuán)狀增生，空白組細(xì)胞相對少，以成纖維細(xì)胞為主，少量的軟骨樣細(xì)胞。    2.3  電鏡檢查    電鏡檢查4周后，結(jié)合組軟骨和纖維細(xì)胞增多，軟骨細(xì)胞內(nèi)溶酶體較豐富,細(xì)胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器多(見圖8)。bFGF組、磁場組細(xì)胞表現(xiàn)較為幼稚，細(xì)胞內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器

15、較少，細(xì)胞周圍膠原纖維均較少(見圖9)?？瞻捉M未見軟骨細(xì)胞。    (×10 000)12周時結(jié)合組軟骨細(xì)胞內(nèi)線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多，空白組有少量纖維軟骨細(xì)胞。    第16周時結(jié)合組與磁場組、bFGF 組，單因素方法分析，方差齊性，各參數(shù)組兩兩相比較，結(jié)合組在細(xì)胞形態(tài)、基質(zhì)染色表、新生軟骨平均厚度與周圍結(jié)合度均高于其他組，有差異性，表面光滑度無差異性。bFGF組和磁場組除新生軟骨厚度外其余均無差異性?？瞻捉M各指標(biāo)除表面光滑度外明顯低于其他組。    3  討論    正常關(guān)節(jié)軟骨為白色、透明、光滑、邊緣規(guī)則整齊、富有彈性