LC-MS知識介紹

1、1、如何看質譜圖(1)確定分子離子，即確定分子量：氮規(guī)則：含偶數個氮原子的分子，其質量數是偶數，含奇數個氮原子的分子，其質量數是奇數。與高質量碎片離子有合理的質量差，凡質量差在38和1013，2125之間均不可能，則說明是碎片或雜質。(2)確定元素組成，即確定分子式或碎片化學式： 高分辨質譜可以由分子量直接計算出化合物的元素組成從而推出分子式，低分辨質譜利用元素的同位素豐度。M-1，M-15，M-18，M-20，M-31.意味著失H，CH3，H2O，HF，OCH3.(3)峰強度與結構的關系，豐度大反映離子結構穩(wěn)定：在元素周期表中自上而下，從右至左，雜原子外層未成鍵的電子越易被電離，容納正電荷能

2、力越強，含支鏈的地方易斷。2、離子源EI(Electron Impact Ionization):電子轟擊電離硬電離。CI(Chemical Ionization):化學電離核心是質子轉移。FD(Field Desorption):場解吸目前基本被FAB取代。FAB(Fast Atom Bombardment):快原子轟擊或者銫離子(LSIMS,液體二次離子質譜)。 ESI(Electrospray Ionization):電噴霧電離是最軟的電離方式，采用離子蒸發(fā)，通常小分子得到M+H+,M+Na+或M-H-單電荷離子；化合物無需具有揮發(fā)性，離子在溶液中已生成；樣品流速0.2-1mLmin；適

3、宜極性分子的分析，能分析小分子及大分子(如蛋白質分子多肽等)，生物大分子產生多電荷離子，通常只產生分子離子峰，因此可直接測定混合物，并可測定熱不穩(wěn)定的極性化合物；通過調節(jié)離子源電壓控制離子的碎裂（源內CID）測定化合物結構。APCI(Atmospheric Pressure Chemical Ionization): 大氣壓化學電離也是軟電離技術，高壓放電發(fā)生了質子轉移而生成MH+或M-H-離子；化合物要具有揮發(fā)性且熱穩(wěn)定，離子在氣態(tài)條件中生成；樣品流速0.2-2mLmin；只產生單電荷峰，適合測定質量數小于2000Da的弱極性的小分子化合物；適應高流量的梯度洗脫/高低水溶液變化的流動相；通過

4、調節(jié)離子源電壓控制離子的碎裂。APPI(Atmospheric Pressure PhotoSpray Ionization):更適宜做非極性分子。其中ESI，APCI，APPI統(tǒng)稱大氣壓電離(API)。MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption):基體輔助激光解吸電離，通常用于飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）和FT-MS，特別適合蛋白質，多肽等大分子。NanoSpray離子源：適合于做微量的生化樣品，其流速范圍可從5nLmin-1uLmin。一滴樣品就可做數小時的分析，可在最小的樣品消耗量下獲得最大靈敏度（高達Fmole），并可直接與微孔HPLC聯(lián)用

5、。3、質量分析器：雙聚焦扇形磁場-電場串聯(lián)儀器(sector)、四極質譜儀(Q)、飛行時間質譜儀(TOF)、離子阱質譜儀（TRAP）、傅利葉變換-離子回旋共振質譜儀(FT-ICRMS)、三重四極（QqQ）、四極+TOF（Q-TOF）。離子源第一分析器MS1碰撞室第二分析器MS2接收器碰撞誘導解離(collision-induceddissociation，CID)質譜：選擇一定質量的離子作為母體離子，進入碰撞室，室內充有靶子反應氣體(碰撞氣體：N2、He、Ar、Xe、CH4等)，發(fā)生離子-分子碰撞反應，從而產生子離子，再經MS2的分析器及接受器得到子離子質譜，一般稱做CID譜。4、正、負離子模

6、式的選擇： 正離子模式：適合于堿性樣品，可用乙酸或甲酸對樣品加以酸化。樣品中含有仲氨或叔氨時可優(yōu)先考慮使用正離子模式。負離子模式：適合于酸性樣品，可用氨水或三乙胺對樣品進行堿化。樣品中含有較多的強伏電性基團，如含氯、含溴和多個羥基時可嘗試使用負離子模式。5、流動相的選擇常用的流動相為甲醇、乙腈、水和它們不同比例的混合物以及一些易揮發(fā)鹽的緩沖液，如甲酸銨、乙酸銨等，還可以加入易揮發(fā)酸堿如甲酸、乙酸和氨水等調節(jié)pH值。LCMS接口避免進入不揮發(fā)的緩沖液，避免含磷和氯的緩沖液，含鈉和鉀的成分必須1mmol/ L。（鹽分太高會抑制離子源的信號和堵塞噴霧針及污染儀器）含甲酸（或乙酸）2。含三氟乙酸0.5

7、。含三乙胺l。含醋酸銨10一5mmol/L。送樣前一定要摸好LC條件，能夠基本分離，緩沖體系符合MS要求。6、流量和色譜柱的選擇不加熱ESI的最佳流速是1-50uLmin，應用4.6mm內徑LC柱時要求柱后分流，目前大多采用1-2.1mm內徑的微柱，TIS源最高允許1mLmin，建議使用200-400uLmin，APCI的最佳流速1mLmin，常規(guī)的直徑4.6mm柱最合適。為了提高分析效率，常采用100mm的短柱（此時UV圖上并不能獲得完全分離，由于質譜定量分析時使用MRM的功能，所以不要求各組分沒有完全分離）。這對于大批量定量分析可以節(jié)省大量的時間。7、輔助氣體流量和溫度的選擇霧化氣對流出液

8、形成噴霧有影響，干燥氣影響噴霧去溶劑效果，碰撞氣影響二級質譜的產生。操作中溫度的選擇和優(yōu)化主要是指接口的干燥氣體而言，一般情況下選擇干燥氣溫度高于分析物的沸點20左右即可。對熱不穩(wěn)定性化合物，要選用更低的溫度以避免顯著的分解。選用干燥氣溫度和流量大小時還要考慮流動相的組成，有機溶劑比例高時可采用適當低的溫度和流量小一點的。8、樣品的預處理常用方法超濾；溶劑萃取去鹽；固相萃取；灌注（Perfusion）凈化去鹽；色譜分離（反相色譜分離、親和技術分離）；甲醇或乙腈沉淀蛋白（盡量高轉速12000rpm以上，低溫離心2次）；酸水解和酶解；衍生化9、化合物鑒別全掃描方式（Q1掃描）：可以得到化合物的準分

9、子離子，從而可判斷出化合物的分子量，用于鑒別是否有未知物，并確認一些判斷不清的化合物，如合成化合物的質量及結構。選擇離子監(jiān)測（SIM）：用于檢測已知或目標化合物，比全掃描方式能得到更高的靈敏度。這種數據采集的方式一般用在定量目標化合物之前，而且往往需要已知化合物的性質。若幾種目標化合物用同樣的數據采集方式監(jiān)測，那么可以同時測定幾種離子。母離子掃描：母離子分析可用來鑒定和確認類型已知的化合物，盡管它們的母離子的質量可以不同，但在分裂過程中會生成共同的子離子，這種掃描功能在藥物代謝研究中十分重要。子離子分析（MS/MS）：用于結構判斷(得到化合物的二級譜圖即碎片離子)和選擇離子對作多種反應監(jiān)測（M

10、RM）。子離子譜圖與錐體電壓斷裂譜圖（源內CID）可能十分相似，所不同的是子離子質譜圖已知只有一種質量通過MS1，因此也已知所有碎片離子都是由我們所選定的母離子所產生的，所以我們更相信由MS/MS產生的譜圖的純度。中性丟失掃描：中性丟失掃描分析可用來鑒定和確認類型已知的化合物，例如新生兒遺傳疾病篩查中某些檢測項目。也可以幫助進行未知物結構判斷，例如有中性丟失18Da的意味著-H2O，28-CO，30-HCOH，32-CH3OH，44-CO2等等。10、用大氣壓電離質譜儀可以得到分子量信息-Na 22Da. Higher than M+H -K 38Da. Higher than M+H-Li

11、6Da. Higher than M+H-NH4 17Da. Higher than M+H-CAN 40Da. Higher than M+H2M+H,2M+Na等-TFA 114Da. Higher than M-H(113 and 227 background)-Acetate 60Da. Higher than M-H-Formic 46Da. Higher than M-H-Cl 36Da. Higher than M-H11、LC-MS中常見的本底離子m/z 50-150，溶劑離子，(H2O)nH+，n=3-112m/z102，H+乙腈+乙酸，C4H7NO2H+，102.0549

12、m/z149，管路中鄰苯二甲酸酯的酸酐，C8H4O3H+，149.0233m/z288，2mm離心管的產生的特征離子 m/z279，管路中鄰苯二甲酸二丁酯C16H22O4H+，279.1591m/z316，2mm離心管的產生的特征離子m/z384，瓶的光穩(wěn)定劑產生的離子m/z391，管路中鄰苯二甲酸二辛酯，C24H38O4H+，391.2843m/z413，鄰苯二甲酸二辛酯+鈉，C24H38O4Na+，413.2668m/z538，乙酸+氧+鐵（噴霧管），F(xiàn)e3O(O2CCH3)6,537.879312、影響分子量測定的因素 1）pH的影響：正離子方式pH要低些，負離子方式pH要高些，除對離子

13、化有影響外，還影響LC的峰形。 2）氣流和溫度：當水含量高及流量大時要相應增加。 3）溶劑和緩沖液流量：流速適當高可以提高出峰的靈敏度。 4）溶劑和緩沖液的類型：通常正離子用甲醇好，負離子乙腈好些5）選擇合適的液相色譜類型：正相、反相、選擇合適的色譜柱 6）合適的電壓：DP電壓高時，樣品在源內分解或碎裂；高DP電壓時回使多電荷離子比例低，多聚體也減少7）樣品結構和性質 8）雜質的影響：溶劑的純度、水的純凈程度等。當成分復雜，雜質太多時，競爭使被測物離子化不好，同時使LC分離不好。去污劑、表面活性劑會有離子抑制現(xiàn)象發(fā)生， 表面活性劑產生的加合物和離子簇會干擾質譜數據，因此不要使用洗滌劑清洗玻璃器皿等容器，如果一定要用，建議超聲清洗多次。如果遇到離子抑制，可以試試把你的樣品峰往后推推或者改變提取方法，也可以試試用APCI源。9）樣品濃度不夠，有時需要濃縮；但也不能太高，12ug/mL即可，否則容易殘留。13、注意事項樣品必須過0.22um濾膜過濾；反相體系不允許用正己烷之類極性弱的溶劑溶解樣品并上