電針對(duì)大鼠脊髓損傷后Nestin表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

1、電針對(duì)大鼠脊髓損傷后Nestin表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究摘要：目的探討電針治療對(duì)大鼠脊髓損傷后Nestin 表達(dá)的影響。方法分別于術(shù)后1d、7d取損傷局部脊髓組織，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)測(cè)定損傷后脊髓組織內(nèi)Nestin 的表達(dá)。結(jié)果脊髓損傷后第1d、7d,在電針組、藥物組和模型組的損傷脊髓灰質(zhì)中都可見到Nestin 的表達(dá)。電針組和藥物組均能顯著升高脊髓損傷1d、7d 后脊髓組織中Nestin 的表達(dá)。與模型組相比較，藥物組和電針組Nestin 表達(dá)均增高，并都有顯著性差異（P0.05）。結(jié)論Nestin 是神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，電針治療對(duì)大鼠脊髓損傷后Nestin 表達(dá)具有明顯的增殖作用。關(guān)鍵詞： Ne

2、stin；脊髓損傷；免疫組織化學(xué)；電針Study of Electroacupuncture on the Expression of Nestin inRats with Spinal Cord InjurySong Meng, Li Zhigang, Shi Suhua, Zheng Guanghua(Acupuncture and Massage School, Beijing University of TCM, Beijing 100029)Abstract: Objective： To discuss the protective mechanism of electroacupu

3、ncture (EA) in the spinalcord injury(SCI). Methods：We will take the spinal cord tissues on the first day and the seven dayafter injury. The injured tissues of Model Group，Blank Group，Drug Group and EA Group wereremoved to determine the content of Nestin. was extracted，through RT-PCR. Results： After

4、the SCIrat model be made suceessfully，the Nestin content of injury local tissues were increased significantlyin EA Group and Drug Group on the 1 day and the 7 day after SCI. Compared with the model Group，statistical significance were found in the EA Group and Drug Group（P0.05）. Conclusion：Nestin is

5、the Proteinmarkers of Neural Stem Cells. The EA can obviously increase the expression of Nestin of the SCIrat.Key words: Nestin;spinal cord injury;Immunohistochemistry;electroacupuncture0 引言脊髓損傷(spinal cord injury)是指由于外界直接或間接因素導(dǎo)致脊髓在損害的相應(yīng)節(jié)段出現(xiàn)各種運(yùn)動(dòng)、感覺和括約肌功能障礙。它所造成的外傷性截癱是最嚴(yán)重的外傷之一。近年來，隨著對(duì)SCI 的病理改變和繼發(fā)損傷研究

6、的深入，SCI 的治療取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，盡管如此，SCI 的治療一直是有待于攻克的一大難題。電針治療SCI 已得到醫(yī)學(xué)界廣泛的認(rèn)可，但其具體作用機(jī)制尚不完全清楚。督脈電針是電針中最常用的一種，治癱首取督脈1-2。本研究通過觀察SCI 后Nestin 的表達(dá)，探討針刺治療SCI 作用機(jī)制，為臨床針灸治療脊髓損傷后提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組雄性SD 大鼠64 只，體重24020g，由北京維通利華動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為空白組、模型組、電針組和藥物組4 組，每組16 只，每組再隨機(jī)分為兩個(gè)時(shí)間組，1d 和7d 組。1.2 針具針灸針使用華佗牌無菌針灸針，規(guī)格：0.30*13mm

7、。電針使用韓氏（HANS）電針儀，型號(hào)LH-202H。1.3 脊髓損傷動(dòng)物模型制作用10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔麻醉，固定于自制的弓形手術(shù)臺(tái)上。按肋骨確定椎體序列，大鼠背部最下端肋骨緣橫對(duì)T13 為標(biāo)志，向上依次定位T9 - T11。背部脫毛劑脫毛；分離背部肌肉，沿深筋膜肌肉附著點(diǎn)剪開深筋膜，暴露棘突和椎旁肌肉；用刀片自棘突向兩側(cè)順次剝離椎旁軟組織，暴露T9-T11 段棘突和椎板；用組織鉗咬住T10 棘突輕輕上提，顯露Tl0T11 椎間隙，彎眼科剪剪除T10 椎板及其上關(guān)節(jié)突和下關(guān)節(jié)突，暴露脊髓；參照經(jīng)典的改良式的Allens 打擊方法，用自制的打擊器打擊T10 段脊髓5cmx10g

8、，立即移去打擊器，模型成功標(biāo)準(zhǔn)是：鼠尾持續(xù)劇烈擺動(dòng)數(shù)秒，雙下肢及背部肌肉瞬時(shí)收縮，硬脊膜下出血，麻醉醒后雙下肢表現(xiàn)為不完全癱瘓。1.4 治療電針組于造模后大約半小時(shí)即大鼠蘇醒后先行CBS 評(píng)分，再選取“大椎”(DU14；第7頸椎棘突下，向下斜刺）、“命門”(DU4；第2 腰椎棘突下，向上斜刺）進(jìn)行針刺治療，進(jìn)針約0.5-0.7cm。使用韓氏LH-202H 型穴位神經(jīng)刺激儀，大椎穴接陰極，命門穴接陽極，持續(xù)脈沖電流，頻率2Hz，治療時(shí)間20min，輸出強(qiáng)度在剛開始時(shí)以背部肌肉出現(xiàn)輕微抽動(dòng)為度，待其適應(yīng)后則以雙下肢癱瘓肌肉出現(xiàn)有節(jié)律的收縮為度。電針組每天同一時(shí)間重復(fù)治療一次。藥物組于造模后以30m

9、g/kg 體重的甲基強(qiáng)的松龍尾靜脈注射。藥物組于第二天同一時(shí)間以5.4 mg/kg 體重的甲基強(qiáng)的松龍尾靜脈重復(fù)注射一次，之后再不給藥?？瞻捉M和病理組不做任何治療，但要在同一時(shí)間均抓取一次，以保證應(yīng)激條件相同。1.5 動(dòng)物取材造模后1d、7d 將大鼠麻醉，進(jìn)行心臟灌注術(shù)：開胸暴露心臟，行左心室、主動(dòng)脈插管，剪開右心耳，灌注生理鹽水 200 mL，然后灌注8%多聚甲醛的磷酸緩沖液300ml 固定，至動(dòng)物肢體僵硬后，以撞擊點(diǎn)為中心，取出損傷部位(節(jié)段T9T11)及其近、遠(yuǎn)端各2 個(gè)節(jié)段的脊髓，約1cm 長(zhǎng)后浸入同樣固定液固定。1.6 指標(biāo)的檢測(cè)將取出的脊髓經(jīng)固定液固定、沖洗、梯度脫水、浸蠟、制成石

10、蠟切片，厚度6 后，進(jìn)行Nestin 表達(dá)的檢測(cè)：下行脫水，雙蒸水洗滌；加入配好的0.3%的過氧化氫甲醇溶液30min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的影響，雙蒸水清洗5min2 ；枸櫞酸鈉緩沖液，PBS 洗10min3 ；加入正常羊血清1-2 滴，37溫箱存放30min；吸干羊血清，加入稀釋的第一抗體，保濕盒中4，36h； 將濕盒移入溫箱（37）放置一小時(shí)，PBS 洗5min3；加入二抗，室溫孵育2h，PBS 洗10min3；加入三抗，室溫孵育2h，PBS 洗10min3； DAB 顯色：加入顯色液，進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色，時(shí)間一般不超過30min，可不時(shí)在顯微鏡下進(jìn)行觀察，待細(xì)胞著色而背底顏色較淡時(shí)

11、馬上吸去顯色液，PBS 洗10min3 ；梯度酒精脫水之后，中性樹膠封片。1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)分析采用軟件進(jìn)行。所得數(shù)據(jù)以均值標(biāo)準(zhǔn)差（ X s）表示。組間比較采用方差分析。以P 0.05 作為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)，P0.01 為差異極顯著標(biāo)準(zhǔn)。2 結(jié)果圖像中Nestin 在細(xì)胞胞漿中表達(dá)為棕褐色顆粒（見圖5.4.2-6、-7 ），主要集中于脊髓中央管室管膜、脊髓背側(cè)出血壞死區(qū)?？瞻捉M僅見少量巢蛋白陽性細(xì)胞（見圖5.4.2-3、-4）；模型組、電針組與藥物組在脊髓損傷后1d 巢蛋白陽性細(xì)胞數(shù)增加，7d 時(shí)明顯增多。2.1 圖像分析比較顯示：（1）造模后1d：與空白組比較，模型組大鼠脊髓組織中

12、Nestin 表達(dá)增多，有極顯著差異（P0.01）；與模型組比較，藥物組和電針組的Nestin 表達(dá)增多，有極顯著性差異（P0.05）。（2）造模后7d：與空白組比較，模型組的表達(dá)增多，有極顯著差異（P0.01）；與模型組比較，藥物組和電針組的表達(dá)顯著增多，有極顯著性差異（P0.05）。各組不同時(shí)間測(cè)得的nestin 含量及表達(dá)陽性區(qū)域面積詳見圖5.4.2-1，表5.4.2-1。05001000150020002500空白組模型組藥物組電針組Nestin的表達(dá)1d7d圖5.4.2-1 各組SCI后1d和7d Nestin的表達(dá)（ X SD）表5.4.2-1 Nestin 陽性細(xì)胞表達(dá)陽性區(qū)域面

13、積（ X s u m 2）組別 例數(shù)(n) SCI后1d 例數(shù)(n) SCI后7d空白組 8 31.28020.678 8 31.28020.678模型組 6 332.945127.982* 5 644.120263.858*藥物組 7 796.039273.899* 5 1544.416678.604*電針組 8 885.842287.577* 6 1818.855447.259*注：與空白組比* P 0.05，* P 0.01；與模型組比 P0.05， P0.01。2.2 免疫組織化學(xué)切片觀察圖：圖5.4.2-2：空白組（100 u m） 圖5.4.2-3：空白組（50 u m）正常成年大

14、鼠脊髓室管膜細(xì)胞周圍可見極少數(shù)nestin 陽性細(xì)胞表達(dá)。圖5.4.2-4：1d 模型組（100 u m） 圖5.4.2-5：1d 模型組（50 u m）SCI 后1d,室管膜細(xì)胞部分胞漿Nestin 染色陽性,量較少。圖5.4.2-6：1d 電針組（100 u m） 圖5.4.2-7：1d 電針組（50 u m）1d 電針組脊髓Nestin 陽性細(xì)胞表達(dá)增多,主要集中于室管膜細(xì)胞及灰質(zhì)中，神經(jīng)元染色深,數(shù)量較多。圖5.4.2-8：1d 藥物組（100 u m） 圖5.4.2-9：1d 藥物組（50 u m）1d 藥物組脊髓灰質(zhì)Nestin 陽性細(xì)胞表達(dá)較多，神經(jīng)元染色深。圖5.4.2-10：

15、7d 模型組（100 u m） 圖5.4.2-11：7d 模型組（50 u m）SCI 后7d,Nestin 陽性細(xì)胞表達(dá)明顯增多,室管膜細(xì)胞及灰質(zhì)中均可見到。圖5.4.2-12：7d 電針組（100 u m） 圖5.4.2-13：7d 電針組（50 u m）7d 電針組脊髓灰質(zhì)Nestin 陽性細(xì)胞表達(dá)明顯增多,神經(jīng)元染色深,數(shù)量多。圖5.4.2-14：7d 藥物組（100 u m） 圖5.4.2-15：7d 藥物組（50 u m）7d 藥物組脊髓灰質(zhì)Nestin 陽性細(xì)胞表達(dá)也增多,神經(jīng)元染色深。3 討論祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為脊髓損傷主要傷及督脈。督脈總督一身之陽經(jīng)，在全身經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)中處于主導(dǎo)地位。因

16、此一旦損傷，則氣血瘀滯，導(dǎo)致經(jīng)氣不利、經(jīng)絡(luò)不通，出現(xiàn)肢麻甚至不能活動(dòng)。因此，在治療上應(yīng)以疏通督脈來壯一身之陽氣，使氣血調(diào)達(dá)、氣機(jī)調(diào)暢。針刺能夠明顯減輕、延緩脊髓損傷后早期病理損害。而督脈電針不但可以調(diào)節(jié)督脈經(jīng)氣、疏通氣血，而且還是一種脈沖電場(chǎng)，具有針刺和電場(chǎng)雙重作用。而它旨在疏通督脈，溫腎壯陽，活血化瘀，使陽氣通達(dá)全身，使精血養(yǎng)四末而恢復(fù)機(jī)體的各項(xiàng)功能。實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)督脈電針可以起到對(duì)脊髓神經(jīng)的保護(hù)作用和促進(jìn)脊髓神經(jīng)的再生3。本實(shí)驗(yàn)觀察到督脈電針能促進(jìn)脊髓損傷后Nestin 大量表達(dá)。而Nestin 是神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，往往與細(xì)胞的分化狀態(tài)有關(guān)，這就表明督脈電針對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞有很強(qiáng)的增殖作用。

17、有實(shí)驗(yàn)曾經(jīng)證實(shí)4，在正常成年哺乳動(dòng)物脊髓只有少量nestin 表達(dá)，而SCI 后24 h 在損傷區(qū)附近中央管周圍出現(xiàn)nestin 表達(dá)陽性的細(xì)胞，同時(shí)在白質(zhì)和灰質(zhì)中也出現(xiàn)少量陽性的樹突狀結(jié)構(gòu)。1 周達(dá)高峰，4 周開始下降，8 周幾乎無表達(dá)。4 周時(shí)在脊髓前角內(nèi)也出現(xiàn)一些nestin染色陽性的細(xì)胞，有的類似星形膠質(zhì)細(xì)胞，有的類似神經(jīng)元，但數(shù)量較少。這可能是內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞分化而來的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元。說明脊髓損傷后室管膜及脊髓的其它部位存在具有潛在分化和更新能力的內(nèi)源性干細(xì)胞，它們?cè)赟CI 后進(jìn)行增殖、分化和遷移，在分化過程中可能會(huì)形成新的神經(jīng)元，對(duì)脊髓損傷后功能恢復(fù)發(fā)揮著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)

18、現(xiàn)，與模型組比較，1d、7d 電針組和藥物組的傷段脊髓組織Nestin 含量都升高，有顯著性差異（P0.05），電針組和藥物組之間Nestin 含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但7d 電針組和藥物組Nestin 含量顯著多于1d 組，差異顯著，表明電針組大鼠患肢功能的恢復(fù)，與Nestin 升高同步，提示督脈電針促進(jìn)Nestin 表達(dá)升高，即促進(jìn)內(nèi)源性的神經(jīng)干細(xì)胞增多，有助于脊髓損傷后神經(jīng)組織的重建。模型組Nestin 陽性細(xì)胞少，這可能是神經(jīng)干細(xì)胞在SCI病理情況下的反應(yīng)性增殖，以彌補(bǔ)神經(jīng)系統(tǒng)組織學(xué)缺失。因此，成年哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在的神經(jīng)干細(xì)胞可能參與損傷過程的神經(jīng)元再生和組織修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)Nestin 的數(shù)據(jù)結(jié)果提示電針對(duì)大鼠SCI 后神經(jīng)功能有保護(hù)作用，電針提高了Nestin 含量即促進(jìn)了神經(jīng)干細(xì)胞增多來起到促進(jìn)SCI 再生修復(fù)和功能恢復(fù)的作用。其參與的可能機(jī)制有以下幾點(diǎn)：督脈電針可能通過促進(jìn)受損傷脊髓組織細(xì)胞的代謝過程，引起細(xì)胞膜的腺苷酸環(huán)化酶活性升高，使ATP 生成cAMP 增加，從而激活了神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶A 的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，啟動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子等蛋白質(zhì)的合成和分泌過程，從而促進(jìn)脊髓內(nèi)移植的神經(jīng)干細(xì)胞存活和分化，以及促進(jìn)