牛血液中SOD的提取分離純化及鑒定

1、 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)綜合性設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)報(bào)告牛血中SOD分離純化及含量、活性、相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定The separation, collection, purification andidentification of SOD from the cow blood姓名:唐勝華學(xué)號(hào):0941063 年級(jí):09生科專業(yè):生物科學(xué)小組成員:韓旭思關(guān)晴月指導(dǎo)教師:劉立亞2011年12月17日牛血中SOD分離純化及含量、活性、相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定唐勝華韓旭思關(guān)晴月(中央民族大學(xué)北京市100081摘要:目的熟練掌握從動(dòng)物血液中提取SOD及分離鑒定和活力測(cè)定。方法破碎細(xì)胞釋放其中的內(nèi)涵物,有機(jī)溶劑去除血紅蛋白,再用透析法

2、純化所得SOD,然后根據(jù)SOD的物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。結(jié)果實(shí)驗(yàn)中SOD在限制鄰苯三酚自氧化的用量時(shí)隨著提取純化次數(shù)的增加而增加,PAGE電泳膠塊染色和脫色后可以明顯的發(fā)現(xiàn)膠塊正中央有透明區(qū)域。結(jié)論動(dòng)物血液中含有SOD,它具有抑制氧化作用的功能。關(guān)鍵詞:SOD,鄰苯三酚自氧化,PAGE電泳,抑制氧化。The separation,collection, purification and identification of SOD from the cow bloodTANG Sheng-hua,HAN Xu-si, GUAN Qing-yue(MinZu University of Ch

3、ina, City of Beijing,100081Abstract: Objective From the experiment, we can know exactly how to get SOD from cow blood, then separate, collect, purify and identify it. Methods we start on determining the feature of SOD after extracting, separating, and collecting it, then we will get what we want fro

4、m the experiment. Results through the experiment, obviously that the amount of Pyrogallol used to suppress the Oxidation rate is increased with the steps to separate, collect, purify the SOD increasing. Also we can find that there is a Transparency in the middle of the Rubber block after the Electro

5、phoresis finished. Conclusions Through the experiment, we deeply know that there is always some SOD in the animal blood which itself can suppress the Oxidation rate in the body.Keywords:SOD, self-Oxidation of Pyrogallol, PAGE Electrophoresis, Oxidation-supression前言近年來,隨著生物科學(xué)領(lǐng)域中分子生物學(xué)的迅速發(fā)展,使得之前只能從細(xì)胞層面

6、研究血液組成及功能的瓶頸得以突破,進(jìn)入研究血紅細(xì)胞中分子組成的層次。由此,在大量實(shí)驗(yàn)中都存在著這么一種現(xiàn)象,紅細(xì)胞中有某種組成成分能夠抑制生物自氧化的速率,延緩細(xì)胞衰老和凋亡的時(shí)間。通過大量的實(shí)驗(yàn)證明,這種物質(zhì)就是超氧化物歧化酶(又稱SOD,是一種能專一地清除超氧陰離子自由基(O2的金屬酶。按所含金屬離子不同可分為CuZnSOD、MnSOD 和FeSOD。SOD催化反應(yīng):2H+2O22H2O2+O2。SOD對(duì)過量的O的及時(shí)清除保證了機(jī)體內(nèi)O2的含量相對(duì)平衡,對(duì)機(jī)體起防護(hù)作用。國(guó)內(nèi)外研究表明SOD 2具有抗炎、抗衰老抗輻射等重要作用。我國(guó)近年來在植物SOD的研究領(lǐng)域有大量相關(guān)進(jìn)展報(bào)道。許平、袁藝

7、、趙文芝、余旭亞等分別從大蒜、桑葉、沙棘、仙人掌中提取出SOD并進(jìn)行相關(guān)研究。其提取方法因原材料的不同而不同,本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)牛血紅細(xì)胞中SOD的研究,證明SOD 的生理作用以及影響其活性的因素,從而從更深層面上認(rèn)知SOD的生理生化作用。1.材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑新鮮牛血液(含有檸檬酸鈉抗凝劑1.1.1實(shí)驗(yàn)試劑0.6%的TritonX-100溶液,0.9%的生理鹽水,4下預(yù)冷的95%乙醇,4下預(yù)冷的氯仿,丙酮,蒸餾水,2.5mmol/LpH7.6磷酸鉀緩沖液,0.05mol/L鄰苯三酚,10mmol/L的HCl溶液,考馬斯亮藍(lán)R-250試劑,100mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。1.1.2電泳試

8、劑PAGE電泳試劑:2.45*10-3mol/L NBT溶液,3.60*10-2mol/LpH7.8的磷酸緩沖液,5*10-2 mol/LpH7.8的磷酸鈉緩沖液,40%蔗糖,0.14%過硫酸銨(AP,20%的乙醇,7%的冰乙酸的水溶液,0.5mol/LNaCl水溶液,0.25%的考馬斯亮藍(lán)R-250染色液,含有50%乙醇和10%的冰乙酸的水溶液,濃縮膠緩沖液,分離膠緩沖液,樣品溶解液,1*電極緩沖液,10%的(m/V SDS貯液。1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器10mL、25mL量筒各兩個(gè),燒杯,10mL的小試管10支,玻璃棒,冰箱,恒溫水浴箱,10000道爾頓的透析袋,離心機(jī)(10、50mL的離心管,移

9、液槍(10uL、50uL、200uL、1000uL和對(duì)應(yīng)槍頭各一套,25mL、50mL、100mL容量瓶各一個(gè),721分管光度計(jì)一臺(tái),垂直板電泳槽。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1牛血液中SOD的提取與分離純化沉淀紅血球:取配好的牛血液200mL(7份血液:1份檸檬酸三鈉,裝入4個(gè)50mL的離心管中,以4000r/min離心處理10min,吸除上清液( 血漿,收集下層紅血球沉淀約100mL。低滲漲破細(xì)胞:把收集的血球加等體積0.9%的氯化鈉溶液, 以4000r/min離心處理10min,重復(fù)3 次,得洗滌紅血球。然后在洗凈的紅血球中加入等體積0.6%的tritonX-100溶液,在40C條件下,攪拌溶

10、血30min,在040C下放置30min以上,使紅血球充分破裂。沉淀血紅蛋白:按溶血體積的0.25倍緩慢加入預(yù)冷至40C的95%乙醇, 再按溶血體積的0. 15倍加入預(yù)冷至40C的氯仿, 攪拌15min,靜置30min,4000r/min離心處理10min,收集上清液,棄去沉淀物(留樣3.0mL測(cè)酶活,蛋白質(zhì)濃度及電泳鑒定。SOD的再提純:在上清液中加入K2HPO4.3H2O(43gK2HPO4.3H2O:100mL上清液,充分?jǐn)嚢?轉(zhuǎn)移至分液漏斗,振搖后靜置15min,室溫下4000r/min離心10min,見明顯的分層,收集含有SOD的上層乙醇-氯仿相(微顯渾濁,室溫下4000r/min離

11、心20min,棄去沉淀,收集上清液約60mL(留樣3.0mL測(cè)酶活,蛋白質(zhì)濃度及電泳鑒定。沉淀SOD:像上一步得到的上清液中加入0.75倍體積40C預(yù)冷過的丙酮,出現(xiàn)SOD沉淀,室溫下4000r/min離心20min收集灰白色的沉淀物。溶解沉淀:把沉淀物用 2 倍蒸餾水溶解,在65 0C的水浴中保溫15min,迅速冷卻至室溫,4000r/min離心10min收集上清液,棄去沉淀物(留樣1.5mL進(jìn)行酶活和蛋白質(zhì)濃度測(cè)定及電泳鑒定。透析純化:將剩下的溶解液,裝入截留量為10000道爾頓的透析袋中,40C條件下于200mL 濃度為2.5mmol/L pH值為7.6的磷酸緩沖液中透析,每隔0.5h換

12、透析液一次,總共進(jìn)行4次,若有沉淀,則4000r/min離心30min,棄去沉淀物,收集上清液(留樣0.5mL測(cè)定酶活,蛋白質(zhì)濃度及電泳鑒定。1.2.2鄰苯三酚法測(cè)定SOD活性,用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為325nm下測(cè)其OD值鄰苯三酚的自氧化率測(cè)定:取兩支試管按下表1加入緩沖液(50mmol/LpH為8.2的Tris-HCl,于25o C保溫20min,然后加入25o C預(yù)熱過的鄰苯三酚液,迅速搖勻,倒入光徑1cm的比色杯內(nèi),在325nm波長(zhǎng)下測(cè)定A值,于恒溫池中每隔30s側(cè)吸光值一次。計(jì)算線性范圍內(nèi)每1min吸光的增值,此即為鄰苯三酚的自氧化速率,要求自氧化速率控制在正好0.070 A/min 左

13、右。注意,空白對(duì)照用10mmol/L的鹽酸代替鄰苯三酚。表1.鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定加樣表Table 1 The table of how to add the Sample試劑空白管自氧化管pH8.2的Tris-HCl緩沖液(mL 4.5 4.510mmol/L的HCl(uL 170 45mmol/L的鄰苯三酚(uL 170酶活性測(cè)定:按照下表2要求加樣,測(cè)定操作同鄰苯三酚自氧化速率相同,根據(jù)酶活性情況可以適當(dāng)調(diào)整樣品液加入量。表2.酶活性測(cè)定加樣表Table 2 The table for how to add Enzyme試劑對(duì)照管實(shí)驗(yàn)管pH8.2的Tris-HCl緩沖液(mL 4.5

14、4.5 酶溶液(uL - 4045mmol/L的鄰苯三酚(uL - 17010mmol/L的HCl(uL 170 -酶活力計(jì)算:在規(guī)定條件下,1mL反應(yīng)液中,每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%時(shí)的酶量定義為一個(gè)酶活力單位,計(jì)算公式如下: SOD活力(U/mL325/0.070*100%*V總*稀釋倍數(shù)50%*V樣V總反應(yīng)總體積;V樣加入樣品液的體積。總活力(U=單位體積活力*原液總體積1.2.3考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:取六支試管編號(hào),按照下表3要求加入試劑,蓋上蓋子搖勻,注意各管震蕩程度盡量一致。放置10min。在595nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定光吸收值,比色應(yīng)在1h內(nèi)完成。以牛血清

15、蛋白含量為橫坐標(biāo),光吸收值為縱坐標(biāo)繪制曲線。表3.標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線測(cè)定加樣表Table 3 The table of how to add the sample when getting the Curve of standard protein試劑 1 2 3 4 5 6蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.9%的NaCl溶液/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考馬斯亮藍(lán)G-250/mL 5 5 5 5 5 5 蛋白質(zhì)含量/ug 0 20 40 60 80 100 樣品中蛋白濃度的測(cè)定:樣品中蛋白濃度的測(cè)定。將待測(cè)的SOD溶解并稀釋至一定的濃度,取1

16、支試管,準(zhǔn)確加入0.1 ml樣品提取液,加入0.9 ml蒸餾水和5 ml考馬斯亮藍(lán)R- 250試劑,其余操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作相同。注意,也可以直接取用提取液,不進(jìn)行稀釋操作。結(jié)果計(jì)算:根據(jù)所測(cè)樣品提取液的光吸收值,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量(ug;樣品(SOD蛋白質(zhì)含量=查到的蛋白質(zhì)濃度(mg/mL*提取液的體積(mL/樣品質(zhì)量(g*測(cè)定時(shí)提取液的體積(mL酶比活力的測(cè)定=樣品液中酶總活力/樣液中蛋白質(zhì)的含量1.2.3 SDS-PAGE不連續(xù)電泳測(cè)定SOD的相對(duì)分子質(zhì)量上樣:安裝垂直板電泳槽,用1%的瓊脂糖封底,配制濃縮膠和分離膠,上樣電泳,上樣時(shí)取各步樣液加入等體積的40%的蔗糖(含有少

17、量的溴酚藍(lán)。每孔加入上述各步提取的SOD 初提液及最終提取液15uL,以對(duì)稱方式加樣。電泳:連接電源,上槽接負(fù)極,下槽接正極,接通冷卻水及電源開關(guān),調(diào)節(jié)電流至15mA,待樣品由濃縮膠進(jìn)入分離膠時(shí),再將電流調(diào)節(jié)至2030mA,當(dāng)染料前沿距離硅橡膠框下緣12cm時(shí),關(guān)閉電源,電泳結(jié)束,取出膠塊,一分為二。染色和脫色:用0.05%考馬斯亮藍(lán)R-250(內(nèi)含20%的磺基水楊酸染色液染色,染色與固定同時(shí)進(jìn)行,使染色液沒過膠版,染色30min左右。脫色時(shí)用脫色液浸泡數(shù)次,直至背景色退去。1.2.4 PAGE電泳鑒定SOD配膠方法同1.2.3所述,唯一的差別就是此處不加入SDS,其他操作也同SDS-PAGE

18、。當(dāng)電泳結(jié)束后,將膠塊取出,進(jìn)行活性染色觀察。2.結(jié)果2.1鄰苯三酚自氧化法測(cè)SOD酶活2.1.1鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定數(shù)據(jù)如下表4所示,為使得鄰苯三酚的自氧化速率在0.070/min左右變化,通過改變鄰苯三酚的用量來調(diào)整其自氧化速率,隨著鄰苯三酚加入量的增加,其自氧化速率增值也變快。表4.鄰苯三酚自氧化速率數(shù)據(jù)Table 4 The date of Pyrogallols self-Oxidation-rate時(shí)間/s 0 30 60 90 120 150 1801 0.151 0.187 0.220 0.254 0.290 0.326 0.3612 0.233 0.268 0.303 0.

19、338 0.373 0.408 0.4433 0.121 0.154 0.222 0.254 0.286 0.328 0.348平均值 0.168 0.203 0.248 0.282 0.316 0.354 0.384在測(cè)定自氧化速率時(shí),所用的的鄰苯三酚用量為170uL,自氧化速率為0.072/min。2.1.2四種各步提取液的活性測(cè)定數(shù)據(jù)2.1.2.1初提液1的活性測(cè)定結(jié)果如下表5所示,在用超氧化物歧化酶抑制鄰苯三酚自氧化時(shí),其抑制作用與SOD的加入量成正比,為使得最終變化率在0.035/min左右,適當(dāng)?shù)脑黾踊蛘邷p少酶液用量來達(dá)到此目的。表5.提取液1的活性測(cè)定結(jié)果Table 5 The

20、result of the Vitality determined of the first steps e xtract時(shí)間/s 0 30 60 90 120 150 1801 0.036 0.053 0.067 0.080 0.094 0.109 0.1242 0.042 0.056 0.071 0.086 0.101 0.116 0.1313 0.034 0.049 0.064 0.078 0.094 0.105 0.121 平均值0.0373 0.0527 0.0673 0.0813 0.0963 0.1067 0.1220 為0.028/min,最后的總體積為4.5mL。單位酶活(U

21、/mL=(0.070-0.028/0.070*100%*4.5mL*2/0.040mL=137.5U/mL總酶活力(U= 137.5U/mL*66mL=9065.76U2.1.2.2初提液2的活性測(cè)定結(jié)果如下表6所示,在測(cè)定酶液2的活性時(shí),同樣也是通過改變酶提取液2的用量來控制其抑制作用的強(qiáng)弱。表6.提取液2的活性測(cè)定結(jié)果Table 6 The result of the Vitality determined of the second steps e xtract時(shí)間/s 0 30 60 90 120 150 180 2 0.111 0.126 0.142 0.158 0.174 0.18

22、7 0.2033 0.101 0.119 0.134 0.149 0.166 0.182 0.198 平均值0.106 0.123 0.140 0.157 0.174 0.189 0.206 速率為0.033/min,最后的總體積為4.5mL。單位酶活(U/mL=(0.070-0.033/0.070*100%*4.5mL*2/0.030mL=158.57U/mL總酶活力(U=158.57U/mL*27mL=4599.99U2.1.2.3初提液3的活性測(cè)定結(jié)果在測(cè)定初提液3的活性時(shí),經(jīng)過多次反復(fù)測(cè)定和調(diào)整初提液3的用量,仍然無法達(dá)到預(yù)期的效果,即無法抑制鄰苯三酚的自氧化率在0.035/min左右

23、。最終,由于留置的初酶提取液有限,故此處不再要求其速率必須在固定的范圍內(nèi)。表7.提取液3的活性測(cè)定Table 6 The result of the Vitality determined of the third steps e xtract 1 0.036 0.069 0.103 0.135 0.163 0.193 0.2232 0.030 0.064 0.097 0.128 0.156 0.186 0.2163 0.046 0.079 0.113 0.145 0.173 0.203 0.233 平均值0.037 0.070 0.104 0.129 0.157 0.187 0.217 化速

24、率為0.060/min,最后的總體積為4.5mL。單位酶活(U/mL=(0.070-0.060/0.070*100%*4.5mL*2/0.1mL=2.714U/mL總酶活力(U=2.714U/mL*6.6mL=17.914U2.1.2.4最終提取液的活性測(cè)定結(jié)果本次實(shí)驗(yàn)中,因?yàn)閷?shí)驗(yàn)中途Tris-HCl更換,導(dǎo)致前后鄰苯三酚在自氧化速率達(dá)要求值時(shí)(0.070/min用量不一致,重新得出的鄰苯三酚自氧化速率為0.070/min時(shí)的用量為110uL。本組在實(shí)驗(yàn)中測(cè)定最終提取液的酶活時(shí),發(fā)現(xiàn)SOD已經(jīng)完全失去活力,無論加入多少的最終提取液,鄰苯三酚的自氧化速率不受影響。2.2蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定2.2.1

25、標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的制定標(biāo)準(zhǔn)蛋白經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后,測(cè)定其595nm波長(zhǎng)下吸光值,結(jié)果如下表7所示:表7 標(biāo)準(zhǔn)蛋白吸光值Table 7 The absorption value of standard protein標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度mg/mL 0 10 30 50 70 901 0 0.101 0.277 0.325 0.485 0.5742 0 0.102 0.281 0.326 0.487 0.5733 0 0.108 0.282 0.327 0.489 0.574平均值0 0.104 0.280 0.326 0.487 0.574根據(jù)上表數(shù)據(jù),以吸光度為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo),得到標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲

26、線。 圖1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線2.2.2各步提取液的蛋白濃度測(cè)定實(shí)驗(yàn)中,對(duì)于各步SOD提取液,測(cè)得的OD值結(jié)果如下表8所示。表8.各步酶初提液的蛋白質(zhì)吸光值Table 8 aThe bsorption value of each steps primary extract酶提取液初酶液1 初酶液2 初酶液3 初酶液41 0.112 0.284 0.102 0.0342 0.112 0.287 0.106 0.0443 0.113 0.284 0.104 0.045 平均值0.112 0.285 0.104 0.041將表中的提取液OD值的平均值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算求得各提取液中的蛋白質(zhì)濃度為:C提取液

27、1(mg/mL=(0.112-0.038/(6.065*0.1=0.122mg/mLC提取液2(mg/mL=(0.285-0.038/(6.065*0.1=0.407mg/mLC提取液3(mg/mL=(0.104-0.038/(6.065*0.1=0.109mg/mLC提取液4(mg/mL=(0.041-0.038/(6.065*0.1=0.005mg/mL由提取液的濃度,可以計(jì)算求得各步提取液中所含有的蛋白質(zhì)含量為:M提取液1=0.122ug.mL*66mL=8.052mgM提取液2=0.407mg/mL*27mL=10.989mgM提取液3=0.109mg/mL*6.6mL=0.7192m

28、gM提取液4=0.005mg/mL*10.6mL=0.053mg綜上所述,蛋白質(zhì)的濃度和含量結(jié)果如下表9:表9.酶提取液中蛋白質(zhì)濃度與含量 酶提取液初酶液1 初酶液2 初酶液3 初酶液4 蛋白質(zhì)濃度/mg/mL 0.122 0.407 0.109 0.005 蛋白質(zhì)含量mg 8.052 10.989 0.719 0.0532.2.3 酶比活力測(cè)定結(jié)果根據(jù)上面計(jì)算得到的總酶活力和蛋白質(zhì)的含量,可以計(jì)算出酶的比活力,計(jì)算過程如下: Y(提取液1的酶比活力=9065.76U/8.052mg=1123.902U/mgY(提取液2的酶比活力=4599.99U/10.989mg=418.600U/mgY(

29、提取液3的酶比活力=17.914U/0.719mg=24.915U/mg最終提取液因用鄰苯三酚自氧化法測(cè)得的酶活力為0,故此處得到的結(jié)果Y=0。2.3 SOD的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定和電泳鑒定2.3.1 SDS- PAGE測(cè)定SOD相對(duì)分子質(zhì)量質(zhì)量電泳結(jié)束后,取下膠塊經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)染色和脫色后,所得到的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的濃度比較小,上樣液中的蛋白質(zhì)含量也較少,故染色后著色較淺。Mark因上樣量少著色也很淺,所以無法準(zhǔn)確確定SOD以及其他雜質(zhì)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量,故所以本實(shí)驗(yàn)的SOD 相對(duì)分子質(zhì)量只能在某一個(gè)范圍內(nèi)。 圖2.SDS-PAGE電泳測(cè)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量結(jié)果Feature 2 The

30、 result of electrophoresis to determined relative molecular mass由于染色著色不明顯,所以SOD的估計(jì)相對(duì)分子質(zhì)量范圍為31000-33000之間。2.3.2 PAGE電泳鑒定SOD電泳結(jié)束后,經(jīng)過活性染色,發(fā)現(xiàn)膠塊的中央部分有明顯的透明區(qū),結(jié)果如圖所示。 圖3.活性染色鑒定SOD的結(jié)果Feature 3 The result of identifying SOD活性染色后,SOD能抑制活性染料NBT光化還原而顯無色,形成圖片中的透明區(qū),其他部位因無此作用而顯色,比較之下就驗(yàn)證了超氧化物歧化酶的存在。3.討論3.1鄰苯三酚法測(cè)定酶活

31、力通過比較發(fā)現(xiàn),酶的總活力隨著提取步驟的增加而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),提取液3和提取液4幾乎沒有酶活。而酶的相對(duì)酶活力(比活力卻與正確結(jié)果相反,正確的結(jié)果是隨著提純濃縮,酶的比活力會(huì)隨著濃縮操作的推進(jìn)而變大。其中,酶的總活力反應(yīng)了酶的含量,而酶的比活力反應(yīng)了酶的純度,可見我們組的酶純度是隨著提取操作的推進(jìn)而下降的,酶失活是造成此種情況的主要因素。我們組在本次實(shí)驗(yàn)中,酶的比活力卻是隨著提取操作的推進(jìn)而變小,造成這種酶失活現(xiàn)象出現(xiàn)的原因是多方面的。 圖4.酶比活力走勢(shì)圖Feature 4 The enzyme specific activity chart首先,在進(jìn)行多步提取操作中,都使用了離心沉淀這一純

32、化方法。離心時(shí),隨著離心次數(shù)的增加,由于本組采用的是常溫離心法,離心溫度會(huì)隨著離心機(jī)溫度的變化而變化,在4000r/min離心20min的過程中,有大部分的酶會(huì)變性失活。其次,是在用有機(jī)溶劑純化時(shí)沒起到理想的純化結(jié)果。如丙酮沉淀純化,根據(jù)原理,丙酮沉淀法是利用向蛋白質(zhì)溶液中加入弱極性的有機(jī)溶劑,改變?nèi)芤旱慕殡姵?shù),使不同種類蛋白質(zhì)的溶解度產(chǎn)生不同程度降低的原理使蛋白質(zhì)純化。然而不同的丙酮加入量與攪拌時(shí)間會(huì)影響SOD 的純化結(jié)果,本組使用的條件是加1倍體積、預(yù)冷的丙酮,4000r/min離心20min,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們可得出結(jié)論在1倍體積、預(yù)冷的丙酮,4000r/min離心20min的條件下達(dá)

33、不到分離純化SOD的效果,反而阻礙了SOD的分離純化。還有,就是在使用650C熱變性沉淀雜質(zhì)蛋白的時(shí)候,也沉淀了許多的目標(biāo)蛋白SOD。再次,就是本次試驗(yàn)所使用的鄰苯三酚也存在問題,相同濃度,在正常情況下只需40uL左右就可以使得自氧化速率達(dá)到0.070/min,而我們這次實(shí)驗(yàn)用了170uL才達(dá)到了相同的效果,所以使用這種丙酮測(cè)定的SOD活力也是不科學(xué)的。最后,也與操作的不當(dāng)和儀器的差異而使得結(jié)果出現(xiàn)嚴(yán)重的偏差。綜上所述,本次試驗(yàn)測(cè)得的酶比活力未達(dá)到預(yù)期效果,主要原因是在純化SOD的過程中是酶變性失活率高過了純化濃縮率,使酶比活隨著提取次數(shù)增加而降低。3.2各步提取液中蛋白質(zhì)濃度及含量的測(cè)定理論

34、上,隨著分離純化的延續(xù),蛋白質(zhì)的含量會(huì)呈下降趨勢(shì),在這過程中有部分的非目標(biāo)蛋白質(zhì)會(huì)被分離出去。從蛋白質(zhì)含量走勢(shì)圖中,明顯可以看出,我們組在實(shí)驗(yàn)中,所得到的結(jié)果與理想蛋白質(zhì)含量走勢(shì)圖有差異,本組的初酶提取液2中所含有的蛋白質(zhì)量比酶提取液1還要多,這可能是測(cè)量初酶提取液1時(shí)出錯(cuò)導(dǎo)致總酶含量的計(jì)算值小于其真實(shí)值,同樣,也可能是在測(cè)量酶2時(shí)讀得的吸光值比實(shí)際的吸光值大而使得初酶提取液2中蛋白質(zhì)的計(jì)算含量高于其實(shí)際含量,這可能與。分光光度計(jì)本身的差異有關(guān),又或者使用的比色皿不配對(duì),以至于測(cè)得的結(jié)果有較大的差異。 圖5.各步提取液中蛋白質(zhì)含量Feature 5 The quantity of the pr

35、otein from each step 至于為什么理論蛋白質(zhì)含量會(huì)呈下降趨勢(shì),主要因素是在提取過程中,用有機(jī)溶劑處理和650處理,使蛋白質(zhì)變性沉淀或者改變?nèi)芤旱碾娊閷?dǎo)系數(shù),使得蛋白質(zhì)逐步減少。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),為了得到純度更高的SOD,可以在適當(dāng)增加所用的丙酮的用量和處理時(shí)間,還有就是降低操作的溫度,這有助于提高SOD的純度和酶比活力。3.3 SDS-PAGE電泳測(cè)SOD的相對(duì)分子質(zhì)量本次實(shí)驗(yàn),上樣采取對(duì)稱上樣的方法,順序?yàn)镸ark、酶初提液1、酶初提液2、酶初提液3、酶初提液4、酶初提液4、酶初提液3、酶初提液2、酶初提液1,每孔上樣量為15uL,除了酶初提液4以外,其他各孔所含有的蛋白質(zhì)質(zhì)量

36、均在10ug以上,但沒超過20ug。電泳中,發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)移動(dòng)的速度極其緩慢,為了節(jié)省電泳時(shí)間,本組將電流120mA。發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)的移動(dòng)速度明顯變快,沒多久就接近前沿部位。電泳結(jié)束后,經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)染色和乙酸脫色后,如圖2所示,并沒有明顯的蛋白質(zhì)殘留痕跡,Mark也不明顯,影像模糊難以準(zhǔn)確辨認(rèn)。這種現(xiàn)象出現(xiàn)的主要原因是上樣液中蛋白質(zhì)含量低所致,為了得到更為明顯的電泳結(jié)果,應(yīng)該適當(dāng)?shù)脑黾由蠘恿縼碓黾拥鞍踪|(zhì)的含量,以此彌補(bǔ)酶提取液中蛋白質(zhì)濃度低的缺陷,使實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯可辨。其次,就可能與染料和染色時(shí)間有關(guān),我們組染色時(shí)只染了30min,可能時(shí)間過短,有大部分蛋白質(zhì)還來不及著色或者著色還不穩(wěn)定,在后面的洗

37、脫時(shí)使得部分與蛋白質(zhì)結(jié)合的染料液洗脫下來,使得染色最終結(jié)果不明顯。最后,從圖2中已經(jīng)難以讀出SOD的相對(duì)分子質(zhì)量,而實(shí)際上實(shí)驗(yàn)當(dāng)天的膠塊還是能模糊辨認(rèn)出Mark與各步提取液的著色部位的,只是不清晰,查表估算得到SOD的值大概為31000-33000之間。3.4 PAGE電泳鑒定SOD該電泳與SDS-PAGE電泳的唯一區(qū)別就是PAGE電泳制膠時(shí)不加入SDS這種掩蓋蛋白質(zhì)原來電荷的試劑,SDS可以改變蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)而使其變性失去活力。而這里鑒定SOD 是利用SOD的酶活性為根據(jù)的,所以加入SDS會(huì)使SOD因失活而不能起抑制氧化的作用,亦即不能夠抑制NBT的光化還原,最終活性染色的不到實(shí)驗(yàn)室預(yù)期結(jié)

38、果。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出,本組實(shí)驗(yàn)還是比較成功的,膠塊的中央有明顯的透明區(qū)域,而非透明區(qū)是因?yàn)镹BT光化還原產(chǎn)生有色的物質(zhì)所致,活性染色劑中,核黃素經(jīng)光照所產(chǎn)生的活性氧O2-(氧自由基能使氯化硝基四氮挫藍(lán)(NBT由黃色的氧化型轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的還原型,SOD能夠抑制O2-的作用,因此,電泳分離SOD后凝膠上無SOD處應(yīng)顯示為藍(lán)色,而有SOD處則無色透明。中間的透明區(qū)覆蓋了上樣槽對(duì)應(yīng)的所有區(qū)域,證明了各步提取液均含有一定量的SOD。由此可以看出,在用鄰苯三酚法檢測(cè)時(shí)沒有活力的酶最終提取液4和僅含有微量酶活的提取液3,在此處均有較強(qiáng)的活力。這說明了用鄰苯三酚法測(cè)定SOD的酶活力并不科學(xué),不能夠準(zhǔn)確確認(rèn)S

39、OD是否含有活力或者活力的大小,這是本實(shí)驗(yàn)應(yīng)該改進(jìn)之處。綜上所述,在PAGE電泳和SDS-PAGE電泳中,應(yīng)該注意以下幾點(diǎn):a、在制備膠塊時(shí),盡量拌勻凝膠緩沖液,使其凝結(jié)時(shí)各處密度保持均一,避免電泳時(shí)蛋白質(zhì)條帶發(fā)生歪斜。b、在注膠前,應(yīng)該檢查封底的膠條是否水平呈一直線,這和膠上表面是否平直密切相關(guān),也和樣品電泳起跑線有關(guān)。C、上樣時(shí),應(yīng)該要熟練規(guī)范,準(zhǔn)確地將樣品加入到樣品槽中,槍移出時(shí)注意別將樣品液帶出而漂浮于電解液中,影響電泳效果。4.0 結(jié)論4.1 SOD活力測(cè)定及蛋白質(zhì)含量測(cè)定通過實(shí)驗(yàn),結(jié)合理論知識(shí)發(fā)現(xiàn),SOD可以抑制鄰苯三酚的自氧化速率,抑制效果隨著SOD的純化更加明顯。在對(duì)SOD的分

40、離純化中,采用先進(jìn)的分離純化方法,可以有效的降低SOD酶的失活率,從而提高酶的比活力。在蛋白質(zhì)濃度及含量的測(cè)定中,經(jīng)考馬斯亮藍(lán)結(jié)合后,蛋白質(zhì)可以強(qiáng)烈吸收595nm處的波,通過測(cè)量其吸光度可以準(zhǔn)確的計(jì)算出蛋白質(zhì)的濃度和含量。本組在對(duì)SOD進(jìn)行提純操作時(shí),操作本身對(duì)SOD的破壞速率超過純化的速率,致使酶的比活力隨著提取純化操作的推進(jìn)而減小。4.2 SDS-PAGE電泳測(cè)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量和PAGE法電泳鑒定SOD通過SDS-PAGE電泳,我們測(cè)得的SOD值在31000-33000之間。通過PAGE電泳和活性染色,我們確定了各步提取液中均含有一定量的SOD。致謝衷心感謝中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院為我們提供實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地和實(shí)驗(yàn)器材,劉立亞老師對(duì)我們大組的悉心指導(dǎo)和后援支持,也感謝本組全部組員的積極配合和默默無聞的奉獻(xiàn)精神。參考文獻(xiàn)1余瑞元,袁明秀,陳麗蓉,等.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法M.北京:北京大學(xué)出版社,2011,2:345-3532 杜秀敏,殷文璇,張慧,等.超氧化物歧化酶( SOD 的研究進(jìn)展.中國(guó)生物工程雜志,2003,23( 1:48-50.3 華紹峰,陳吉祥,徐廣峰.牦牛血提取Cu