張亞平,蛋白質(zhì)組技術(shù).

1、有文.張亞萍什么是蛋白質(zhì)組?蛋白質(zhì)組 邙廠0匕00）由澳大利亞學(xué)者Wilkins 和Williams等于1994年提出，指的是由基因組編碼的 全部蛋白質(zhì)，即某一物種、個體、器官、組織乃至細(xì) 胞的全部蛋白質(zhì)。與以往的蛋白質(zhì)化學(xué)的研究不同， 蛋白質(zhì)組研究的對象不是單一或少數(shù)的蛋白質(zhì)，它著 重的是，需要獲得體系內(nèi)所有蛋白質(zhì)組分的物理、化學(xué)及生物學(xué)參數(shù)，如分子量、等電點、 表達量等。它是動態(tài)的,有它的肘間性、可調(diào)節(jié)性； 進而能夠在細(xì)胞和生命有機體的整體水平上闡明生命 現(xiàn)象的本質(zhì)和活動規(guī)律。主要方法-蛋白質(zhì)分離技術(shù)凝膠雙向電泳、HPLC；蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)Edman測序、質(zhì)譜技術(shù)；圖像分析與生物信息圖像分析

2、軟件，數(shù)據(jù)庫；相互作用研究技術(shù)酵母雙雜交技術(shù)、免疫共沉淀、蛋白質(zhì)芯片等。常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)雙向電泳技術(shù)、計算機圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及 質(zhì)譜技術(shù)被稱為蛋白質(zhì)組研究的三大基本支撐技術(shù).蛋白質(zhì)組研 究的技術(shù)路線如下圖：XL俎飯.律波EdmanM:1|ESI/MS/MSPSDA1ALDI/ TOF/MS111MALDI/TOFAfS N*序列送白活力長白定伎雙向凝膠電泳一、雙向凝膠電泳的原理二、雙向凝膠電泳技術(shù)操作的基本過程三、雙向凝膠電泳過程中需要注意的問題（一）、雙向凝膠電泳的原理等電聚焦（Isoelectric focusing, IEF） 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì) 在等電聚焦中蛋白質(zhì)總

3、是向與英等電點和 同的pH位置移動并停留在此位置上 等電點相同的蛋門質(zhì)都聚焦在與等電點相 同的pH位置上+ / 一夕/ -SDS-PAGE十二烷基硫酸鈉（SDS）是一種陰離了去 污劑，帶大量的負(fù)電荷SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合，其所帶負(fù)電荷大 人超過蛋白質(zhì)所帶電荷量，消除了不同蛋 白之間所帶電荷的差異SDS-PAGE中，蛋口質(zhì)遷移率只與蛋口 質(zhì)的分子量有關(guān)先根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點不同，利用等電 聚焦進行第一向分離，將等電點相同的蛋 白質(zhì)集中在與等電點相同的pH區(qū)再以與等電聚焦成90度角的方向進行 SDS-PAGE第二向分離，將等電點相同的 蛋白質(zhì)再按分子量大小彼此分開以此將復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二 維平

4、面上以點的形狀分離。蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳是各種蛋白質(zhì)分 離分析方法中唯一能同時分辨上個蛋白 質(zhì)點的技術(shù)蛋口質(zhì)組學(xué)研究中主耍的分離技術(shù)SOS- W E用碗佞電總pH3D二）、雙向凝膠電泳技術(shù)操作的棊本過程提取蛋白樣品，進行樣品的預(yù)處理進行第一向等電聚焦電泳等電聚焦后的膠條經(jīng)過平衡轉(zhuǎn)移到第二向凝膠上，與等電聚焦呈垂直 方向進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳用銀或考馬斯亮藍染色，經(jīng)雙向凝膠電泳 圖像分析軟件進行凝膠圖像分析找出差異表達的蛋白質(zhì)點樣品制備solubilization of the proteins樣品制備中遵循以下原則:樣本制備步驟盡可能簡單，以避免不必要的蛋白質(zhì)損失；裂解細(xì)胞或組織的方法應(yīng)盡

5、可能減少蛋白酶解(proteolysis) 或降解(degradation)；;避免反復(fù)凍融樣本。樣本于雙向電泳前新鮮制備及溶解； 去除樣本中的脫氧核糖核酸(DNA ),核糖核酸(RNA ),脂 質(zhì)等；在樣本加入尿素后避免加熱；蛋白質(zhì)提取一般使用含有變性劑、表面活性劑、還原劑、定pH梯度緩沖液(IPG buffer)o提取的主要方法是對細(xì)胞、組織等樣品進行破碎、溶解. 失活或還原，盡可能斷開蛋白質(zhì)間的連接鍵,再采用三氯乙 酸與冷丙酮聯(lián)用來沉淀提取全部蛋白質(zhì)。第 向：變性的等電聚焦電泳，根掀蛋 門質(zhì)的等電點進行分離二向：SDS衆(zhòng)內(nèi)烯酰胺電泳.根 據(jù)蛋n質(zhì)分片尿進行分離(三)、雙向凝膠電泳過程中需

6、要注意的問題1 雙向凝膠電泳結(jié)果的可重復(fù)性蛋門質(zhì)樣品制備是關(guān)鍵1) 盡可能地使蛋白質(zhì)組中的各種蛋白質(zhì)成分都溶解在裂解液中2) 防止制備過程中蛋口成分的降解與修飾3) 要保證蛋白質(zhì)徹底變性4) 取材要有重現(xiàn)性：用細(xì)胞不用組織5)裂解液中需加：尿素斷裂蛋口質(zhì)的氫鍵和疏水鍵還原劑破壞蛋白質(zhì)中的二硫鍵兼性離了去垢劑增加疏水性氨基酸殘基的 溶解性6)整個制備過程需在低溫環(huán)境中進行，在 裂解液中加入蛋白酶抑制劑用固相pH梯度等電聚焦(IPG)防止陰極飄移，pH梯度不穩(wěn)定載體兩性電解質(zhì)在電場中依據(jù)其等電 點形成pH梯度，這種pH梯度因陰極飄移而 不穩(wěn)定，缺少重現(xiàn)性。IPG中的pH梯度是凝膠聚合過程中通 過酸

7、性和堿性丙烯酰胺緩沖液形成的，是 穩(wěn)定的雙向電泳屮的等電聚焦選用IPG2.凝膠中蛋白質(zhì)的染色同位素；"同位素是目前己知最靈敏的蛋白質(zhì)染 色方法同位素是在細(xì)胞代謝過程中摻入蛋白質(zhì) 的，不同蛋白質(zhì)摻入的同位素量不同，因 此同位素強度不能代表蛋白質(zhì)的實際豐度同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)不能直接用丁后續(xù) 的鑒定實驗銀染色.；T銀染色是除同位素外最靈敏的染色方法 只需110ng蛋白質(zhì)即可顯示岀條帶。酸性的硝酸銀染色法更適合酸性蛋口的 染色，堿性的銀氨染色法對堿性蛋白質(zhì)的靈敏 度稍高雙向電泳的染色（銀染）考馬斯亮藍染色考馬斯亮藍R-250為三苯基甲烷，考馬 斯亮藍G-250為二甲花青亮藍R-250LLG-

8、250的靈敏度稍高，lOOng左右蛋 白質(zhì)即町顯示出條帶，G-250更適合染色小 分子多肽方法簡便，是最常用的染色方法脫色后的蛋白質(zhì)樣品可用于質(zhì)譜分析等 后續(xù)研究雙向電泳的染色（考馬斯亮藍染色）非共價修飾的熒光染料女口 Sypro red 利 I Sy pro orange 靈敏度可與銀染媲美 方法簡單，一步染色，無需脫色樣品可直接用于序列測定和質(zhì)譜分析鋅“銅負(fù)染 I I I I I I 、 I凝膠背景為不透明的乳白色或青綠色， 蛋白斑點則是透明的靈敏度介于銀染和考馬斯亮藍染色之間染色對后續(xù)分析的干擾較小冃前在蛋白質(zhì)組研究屮經(jīng)常將兩種染色方法結(jié)合使用；先經(jīng)銀染分析確定有意義的蛋白斑點， 再加大

9、上樣量，重作電泳，用考馬斯亮藍 染色純化的樣品經(jīng)脫色后進一步進行質(zhì)譜鑒 定聲異凝膠電泳(Differential gel electrophoresis )備a柚按物i 用站一種熒粉記Min世期由電肚2、質(zhì)譜儀的基本組成1. 氣體擴散2. 直接進樣3. 氣相色譜1電子轟擊2化學(xué)電離3場致電離4激光 1單聚焦2雙聚焦 3. E行時間4 四極桿質(zhì)譜圖意義g8070eo1QO2 a 10* CUM rtUTWT2001667 7I600 aoo iOOO 4200 1400 1600 f BOO 2000 2200竹任|B |A:離子的相對強度(Y axis)B:離子的質(zhì)量與電荷比(m/z, X a

10、xis)C：質(zhì)譜圖中最強的峰稱為基峰(base peak)D:相對于特定的檢測器時稱為峰的絕對強度E:所有質(zhì)譜峰對應(yīng)的是離子電信號強度和離子應(yīng)在m伍位賈而非真實的離子強度和離子.F:樣狀譜(centroidal peak)G:離斯峰(gauss peak)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)(1 )主要技術(shù)基質(zhì)輔助激光解吸電離(Matrix-assistedlaser desorption/ionization, MALDI)技術(shù)線性飛行時間質(zhì)量檢測器(time of flight, TOF)MALDI原理:m之吸少質(zhì) 7n品罷了 33樣基吸當(dāng) 也一，只充 影鍵$ 刖基關(guān)分程

11、 “ 9 誓的品過 -F 陸吸技形 二 鬻電氣幕 郵這霍負(fù) 監(jiān)用分醤 系Q聲正 鳳質(zhì)將呈 轟基時聖 敦同譚電化書朋 島子氣庠 尼母分并盤 黠使分賽 骼移部顯 證轉(zhuǎn)大¥ ti 擴荷：gim事3 嬴 II 刎浣4wla» 鱉發(fā) 嚮間>» «*«TOF原理離子源中每一脈沖激光產(chǎn) 生的離子先經(jīng)過一不加速 電場，獲得動能，再進入 一個高真空無電場飛行管 道.離子在此無電場飛行 管道內(nèi)以在加速電場獲得 屆速度飛行。斎量較整場 離子飛行 擺檢測器廠崔重的離子飛 行速度慢，莪晚到払檢測快，較早到心/夬慢，較晚到達檢測 器.離子的飛存時間與其 測定咖創(chuàng)比,

12、I酵母雙雜交扌支術(shù)一、酵母雙雜交系統(tǒng)的原理二、酵母雙雜交系統(tǒng)的操作程序三、酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast two-hybrid system) 也叫相互作用陷阱(Interaction trap)由Fields和Song于1989年建立 用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用。(一) 、酵母雙雜交技術(shù)原理酵母雙雜交系統(tǒng)的建立基于對真核牛物轉(zhuǎn)錄 激活因子結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域BDAI)J1«組件式：結(jié)構(gòu)可互相分開功能互相獨立空間較近時表現(xiàn)活性 中間序列對活性無影響147AABDC端213AA酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4LexA蛋白單

13、純皰疹病毒的VP編碼區(qū)BDAD大腸桿茵的LexA蛋白AD選擇酵母細(xì)胞作為雙雜交系統(tǒng)的 宿主菌株：1 酵母細(xì)胞具有翻譯后加工功能2酵母細(xì)胞令很多的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，篩選 陽性克隆比較方便、容易。3酵母細(xì)胞有性生殖形成二倍體細(xì)胞，轉(zhuǎn)化 容易，轉(zhuǎn)化率高構(gòu)建兩種可力人腸桿菌和酵母細(xì)胞中復(fù)制的 穿梭質(zhì)粒載體1. zmpr基因大腸桿曲篩 選標(biāo)記2Trp、Leu-酵母篩選標(biāo) 記3. X與BD以融合妥白形 式表達，Y與AD以舷合 妥白表達報告基因在GAL4結(jié)合的順式作用元件下游需連接報告 基因。目詢應(yīng)用最多的報告基因是LacZ基因，表達 后能在XG“1培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍色菌落。其次是His基因，表達后能使酵母菌金缺

14、少組 氨酸的培養(yǎng)基中生長?，F(xiàn)在多提倡兩種報告基因同時應(yīng)用，顏色篩 選和營養(yǎng)缺陷篩選同II寸進行，以降低假陽性的出 現(xiàn)XBD啟動子報告基因酵母雙雜交原理示意圖（二）、酵母雙雜交系統(tǒng)的操作程序 1 構(gòu)建X蛋白表達質(zhì)粒將X蛋白基因與BD質(zhì)粒重組，轉(zhuǎn)化 大腸桿菌，用Amp抗性標(biāo)記篩選陽性克隆, 測序驗證，并通過SDS-PAGE和Western Blotting檢測融合蛋白。 2構(gòu)建Y蛋白表達質(zhì)?；蝾A(yù)轉(zhuǎn)文庫 如丫蛋白是已知蛋白，則將丫蛋白基因 與AD質(zhì)粒重組。如丫蛋白是未知蛋白，則 需用AD質(zhì)粒構(gòu)建cDNA文庫。要求文庫含 有足夠的轉(zhuǎn)化子，數(shù)量在107以上，保證文 庫內(nèi)含有研究者所感興趣的蛋白。 3.從

15、大腸桿菌屮提取兩種重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn) 化酵母細(xì)胞 在缺少Trp、Leu和His,含有X-gal 的培養(yǎng)基上篩選在此培養(yǎng)基上生長的藍色菌落證 明X蛋白和丫蛋白能互相作用。酵母的接合型a接合型a接合型-單倍體 二倍體 單倍體DNA-BD載體 DNAAD載體|轉(zhuǎn)化1轉(zhuǎn)化X和Y蛋白相互作用X基因與DNz-BD質(zhì)粒重紐Y基因與DNA-AD質(zhì)粒重俎I分別轉(zhuǎn)化大腸桿苗Amp培養(yǎng)基XBD重組質(zhì)粒亠'YAD重組質(zhì)粒J7轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞Trp和I疋u營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基ITrp、Leu. His營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基X-gal藍色前落無菌曹生長! 1X和Y妥白相互作用X和Y妥白間無作用（三）、酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用 1檢測兩種己知蛋白質(zhì)Z間/E體內(nèi)是否存 在相互作用.這是酵母雙雜交系統(tǒng)最基木用 途 將兩種已知蛋白質(zhì)的編碼基因分別 克隆到BD載體和AD載體上，共同轉(zhuǎn)染酵 母細(xì)胞。若報告基因得到表達，則證明兩 種蛋白質(zhì)之間在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用。 2.篩選與己知蛋白質(zhì)相互作用的新的蛋 白質(zhì)。 這是酵母雙