專題發(fā)酵液預(yù)處理和固液分離工藝

1、專題 發(fā)酵液預(yù)處理和固液分離工藝從微生物發(fā)酵液或細(xì)胞培養(yǎng)液中提取生化物質(zhì)的第一個重要步驟，就是預(yù)處理和固液分離。其目的不僅在于分離細(xì)胞、菌體和其他懸浮顆粒，還希望除去部分可溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液的性質(zhì)，以利于后續(xù)的各步操作。一、發(fā)酵液預(yù)處理工藝各種發(fā)酵產(chǎn)品，由于菌種不同和發(fā)酵液特性不同，其預(yù)處理方法的選擇也有所不同。大多數(shù)發(fā)酵產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中，但也有少數(shù)產(chǎn)物存在于菌體中，或發(fā)酵液和菌體中都含有，但無論產(chǎn)物是在胞內(nèi)，還是在胞外或者是菌體本身，首先都要對發(fā)酵液進(jìn)行過濾和預(yù)處理，將固、液分開，然后才能從澄清的濾液中采用物理、化學(xué)的方法提取代謝產(chǎn)物，或從細(xì)胞出發(fā)進(jìn)行細(xì)胞破碎、碎片的分離和提取胞內(nèi)產(chǎn)物。預(yù)

2、處理的方法完全取決于可分離物質(zhì)的性質(zhì)，如對PH和熱的穩(wěn)定性、是蛋白質(zhì)還是非蛋白質(zhì)、分子的質(zhì)量和大小等等。具體方法主要有以下幾種：1、加熱法加熱法是最簡單和價廉的預(yù)處理方法，即把懸浮液加熱到所需溫度并保溫適當(dāng)時間。加熱可降低液體的黏度，根據(jù)流體力學(xué)的原理，濾液通過濾餅的速率與液體的黏度成反比，可見降低液體黏度可有效提高過濾速率；同時，在適當(dāng)溫度和受熱時間下可使蛋白質(zhì)凝聚，形成較大顆粒的凝聚物，進(jìn)一步改善了發(fā)酵液的過濾特性。例如，鏈霉素發(fā)酵液，調(diào)酸至PH3.0后，加熱至70，維持半小時，其黏度下降至原來的1/6，過濾速率可增大10100倍。使用加熱法時必須嚴(yán)格控制加熱溫度和時間。首先，加熱的溫度必

3、須控制在不影響目的產(chǎn)物活性的范圍內(nèi)；其次，溫度過高或時間過長，會使細(xì)胞溶解，胞內(nèi)物質(zhì)外溢，增加發(fā)酵液的復(fù)雜性，影響產(chǎn)物后續(xù)的分離與純化。因此，加熱法的關(guān)鍵取決于產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性。2、調(diào)節(jié)懸浮液的PH值PH值直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)，因此適當(dāng)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的PH值可改善其過濾特性。此法是發(fā)酵工業(yè)中發(fā)酵液預(yù)處理較常用的方法之一。對于Aa、Pro等兩性物質(zhì)，在等電點時，其溶解度最小，這就是等電沉淀法。例如，在味精生產(chǎn)中，利用等電點（PH3.22）沉淀法提取谷氨酸；在膜過濾中，發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)容易與膜發(fā)生吸附，通過調(diào)整PH值改變易吸附分子的電荷性質(zhì)，即可減少堵塞和污染。3、凝聚和絮凝凝

4、聚和絮凝都是懸浮液預(yù)處理的重要方法，其處理過程就是將化學(xué)藥劑預(yù)先加入到懸浮液中，改變細(xì)胞、細(xì)胞碎片、菌體和Pro等膠體粒子的分散狀態(tài)，破壞其穩(wěn)定性，使其凝結(jié)成較大的顆粒，便于提高過濾速率，而且能有效地除去雜蛋白和固體雜質(zhì)，提高濾液質(zhì)量。但凝聚和絮凝是兩種不同方法，其具體處理過程還是有差別的，應(yīng)該明確區(qū)分開來，不可混淆。（1）凝聚凝聚是指向膠體懸浮液中加入某種電解質(zhì)，在電解質(zhì)異電離子作用下，膠體粒子的雙電層電位降低，從而使膠體失去穩(wěn)定性并使粒子相互凝聚成1mm左右大小的塊狀凝聚體的過程。發(fā)酵液中的細(xì)胞、菌體或Pro等膠體粒子的表面，一般都帶有電荷，由于靜電引力的作用，使溶液中帶相反電荷的離子被吸

5、附在其周圍，這樣在界面上就形成雙電層。這種雙電層的結(jié)構(gòu)使膠體粒子之間不易凝聚而保持穩(wěn)定的分散狀態(tài)，其電位越高，電排斥作用越強(qiáng)，膠體粒子的分散程度也就越大，發(fā)酵液過濾就越困難。電解質(zhì)的凝聚能力可用凝聚值來表示，使膠體粒子發(fā)生凝聚作用的最小電解質(zhì)濃度（mmol / L）稱為凝聚值。根據(jù)SchuzeHardy法則，反離子的價數(shù)越高，其凝聚值就越小，即凝聚能力越強(qiáng)。所以，陽離子對帶負(fù)電荷的發(fā)酵液膠體粒子的凝聚能力依次為：Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+。常用的凝聚劑有Al2(SO4)3·18H2O、 AlCl3

6、83;6H2O、 ZnSO4 、FeCl3 、FeSO4·7H2O、 H2SO4、HCl、 NaOH 、Na2CO3、 Al(OH)3等。（2）絮凝絮凝是指使用絮凝劑將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)，形成10mm左右大小的絮凝團(tuán)的過程。其中絮凝劑主要起架橋作用。采用凝聚方法得到的凝聚體，其顆粒常常只有1mm左右，比較細(xì)小，有時還不能有效地進(jìn)行分離。而采用絮凝方法則?？尚纬纱执蟮男跄w（10mm左右），使發(fā)酵液較容易分離。絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，具有長鏈狀結(jié)構(gòu)，其鏈節(jié)上帶有許多活性官能團(tuán)，包括帶電荷的陽離子或陰離子基團(tuán)以及不帶電荷的非離子型基團(tuán)，這些基團(tuán)能強(qiáng)烈地吸附在膠體粒子的表面，使其

7、形成較大的絮凝團(tuán)。根據(jù)其來源不同，工業(yè)上使用的絮凝劑可分為如下3類： 有機(jī)高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物和聚苯乙烯類衍生物等； 無機(jī)高分子聚合物，如聚合鋁鹽和聚合鐵鹽等； 天然有機(jī)高分子絮凝劑，如海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼聚糖等。目前最常用的絮凝劑是有機(jī)合成的聚丙烯酰胺類衍生物，其優(yōu)點是用量少（一般以mg/L計），絮凝速度快，分離效果好，應(yīng)用廣泛；缺點是具有一定毒性。4、添加助濾劑助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒，它能使濾餅疏松，濾速增大。這是因為使用助濾劑后，懸浮液中大量的細(xì)微粒子被吸附到助濾劑的表面上，從而改變了濾餅結(jié)構(gòu)，使濾餅的可壓縮性下降，過濾阻力降低。常用的助濾劑有硅藻土、纖維素、石

8、棉粉、珍珠巖、白土、炭粒和淀粉等。其中最常用的是硅藻土，它具有極大的吸附和滲透能力，能濾除0.11.0m的粒子，而且化學(xué)性能穩(wěn)定，既是優(yōu)良的過濾介質(zhì)，同時也是優(yōu)良的助濾劑。5、添加反應(yīng)劑在某些情況下，通過添加一些不影響目的產(chǎn)物的反應(yīng)劑，可消除發(fā)酵液中某些雜質(zhì)對過濾的影響，從而提高過濾速率。加入的反應(yīng)劑與某些可溶性鹽類發(fā)生反應(yīng)，生成不溶性沉淀，如CaSO4、 AlPO4等。生成的沉淀物能防止菌體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，另外沉淀物本身可作為助濾劑，并且能使膠狀物和懸浮物凝固，從而改善過濾性能。若能正確選擇反應(yīng)劑和反應(yīng)條件，則可使過濾速率提高310倍。如果發(fā)酵液中含有不溶性的多糖物質(zhì)，則最好先用酶

9、將它轉(zhuǎn)化為單糖，以提高過濾速率。例如，萬古霉素用淀粉作培養(yǎng)基，發(fā)酵液過濾前加入0.025%的淀粉酶，攪拌30min后，再加2.5%硅藻土作助濾劑，可使過濾速率提高5倍。6、其他方法發(fā)酵液中雜質(zhì)很多，其中有些雜質(zhì)不僅直接影響產(chǎn)品質(zhì)量和得率，同時對后續(xù)的提取和精制有很大影響，因此，在預(yù)處理時，必須采用適當(dāng)方法使這些雜質(zhì)沉淀，在固液分離時除去，以利于后面的提取和精制過程能順利進(jìn)行。(1) 添加草酸鹽除去高價無機(jī)離子（主要是Ca2+、Mg2+和Fe2+等）(2) 去除雜蛋白的主要方法 沉淀法：Pro是兩性物質(zhì)，在酸性溶液中，能與一些陰離子如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、苦味酸鹽等形成沉淀，在堿性溶液中，能與一

10、些陽離子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀； 變性法：其中最常用的是加熱法，還有大幅度調(diào)節(jié)PH，加酒精、丙酮等有機(jī)溶劑或一些表面活性劑等方法； 吸附法：加入某些吸附劑吸附雜蛋白而將其除去。二、固液分離工藝固液分離是生物產(chǎn)品生產(chǎn)中經(jīng)常遇到的重要單元操作。培養(yǎng)基、發(fā)酵液、某些中間產(chǎn)品和半成品等都需要進(jìn)行固液分離，其方法很多，生物工業(yè)中常規(guī)的方法有分離篩、重力沉降，浮選分離、離心分離和過濾等，其中用于發(fā)酵液固液分離的主要是離心分離和過濾。1、發(fā)酵液的粗過濾過濾是發(fā)酵液處理中常用的單元操作，通過過濾可獲得20%30%（W/V）細(xì)胞濃度的淤漿，或40%（W/V）以上濃度的細(xì)胞固體

11、。（1）澄清過濾在澄清過濾中，所用的過濾介質(zhì)為硅藻土、砂、顆?；钚蕴?、玻璃珠和塑料顆粒等，填充于過濾器內(nèi)部即構(gòu)成過濾層；也有用燒結(jié)陶瓷、燒結(jié)金屬、粘合塑料及用金屬絲繞成的管子等組成的成型顆粒濾層。當(dāng)懸浮液通過過濾層時，固體顆粒被阻攔或吸附在濾層的顆粒上，使濾液得以澄清，所以這種方法叫澄清過濾。該法適合于固體含量少于0.1g/100mL、顆粒直徑在5100m的懸浮液的過濾分離，如麥芽汁、酒類和飲料等的澄清。（2）濾餅過濾 在濾餅過濾中，過濾介質(zhì)為濾布，包括天然或合成纖維布、金屬織布、石棉板、玻璃纖維紙等。當(dāng)懸浮液通過濾布時，固體顆粒被濾布阻攔而逐漸形成濾餅（或稱濾渣）。當(dāng)濾餅達(dá)到一定厚度時即起過濾作用，此時即可獲得澄清的濾液，故這種方法叫做濾餅過濾或濾渣過濾。該法適合于固體含量大于0.1g/100mL的懸浮液的分離。濾餅過濾按推動力的不同可分為4種：重力過濾、加壓過濾、真空過濾和離心過濾。（3）錯流過濾在一般過濾中，濾液的流動方向與濾餅基本垂直，采用這種方法時，隨著過濾過程的進(jìn)行，所積累形成的濾渣阻力很大，過濾速率迅速下降。為了維持較高的過濾速率，有效的方法是設(shè)法阻止濾渣的加厚，或者當(dāng)濾渣達(dá)到一定厚度時采用