分子生物學(xué)技術(shù)和食源性致病菌的快速檢測(cè)ppt課件

1、分子生物學(xué)技術(shù)和食源性分子生物學(xué)技術(shù)和食源性致病菌的快速檢測(cè)致病菌的快速檢測(cè) 與細(xì)菌有關(guān)的一些分子生物學(xué)和與細(xì)菌有關(guān)的一些分子生物學(xué)和 細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)細(xì)胞生物學(xué)技術(shù);PCR技術(shù)技術(shù);熒光熒光PCR技術(shù)技術(shù);相關(guān)的一些分子生物學(xué)技術(shù)在食源性致病菌相關(guān)的一些分子生物學(xué)技術(shù)在食源性致病菌 的快速檢測(cè)技術(shù)中的應(yīng)用的快速檢測(cè)技術(shù)中的應(yīng)用;5. 一實(shí)例分析個(gè)案一實(shí)例分析個(gè)案與細(xì)菌有關(guān)的一些分子生物學(xué)和與細(xì)菌有關(guān)的一些分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)核酸的抽提與純化核酸的抽提與純化(DNA, RNA, 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA等等)相關(guān)核酸的鑒定相關(guān)核酸的鑒定(PCR, 限制性內(nèi)切酶和酶切技術(shù)及限制性內(nèi)切酶和

2、酶切技術(shù)及 產(chǎn)物分析產(chǎn)物分析, 重組技術(shù)重組技術(shù), 探針探針, Southern blotting, Northern blotting, 芯片技術(shù)芯片技術(shù), 序列分析等序列分析等)蛋白質(zhì)的提取與純化蛋白質(zhì)的提取與純化相關(guān)蛋白質(zhì)的鑒定相關(guān)蛋白質(zhì)的鑒定(Western blotting, 抗原抗體復(fù)合物抗原抗體復(fù)合物, 標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記技術(shù),芯片技術(shù)芯片技術(shù), 序列分析等序列分析等)培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù)(用于細(xì)菌毒素測(cè)定的用于細(xì)菌毒素測(cè)定的MTT方法方法)核酸的抽提與純化核酸的抽提與純化DNA-微量法微量法(平衡酚平衡酚, 氯仿氯仿,乙醇乙醇);大量法大量法(堿堿列解列解); 離心法離心法RNA

3、質(zhì)粒質(zhì)粒DNA -堿變性法堿變性法, Kit-Qiagen公司公司PCR產(chǎn)物產(chǎn)物- Kit細(xì)菌細(xì)菌-直接裂解直接裂解:釋放出釋放出DNA PCR- PCR-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCRPolymerase Chain Reaction, PCR）在體外通過(guò)酶促反應(yīng)進(jìn)行一段特定在體外通過(guò)酶促反應(yīng)進(jìn)行一段特定DNADNA或或RNARNA片段擴(kuò)增的片段擴(kuò)增的技術(shù)為獲取目的技術(shù)為獲取目的DNADNA片段的一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)片段的一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)( (診斷和檢測(cè)診斷和檢測(cè)) )原理原理: :PCRPCR一般過(guò)程：一般過(guò)程： 1.1.變性變性denatu

4、rationdenaturation）：）： 加熱使加熱使DNADNA雙螺旋的雙螺旋的氫氫鍵斷裂鍵斷裂, ,雙鏈解離形成雙鏈解離形成單單 鏈鏈DNADNA。 2.2.退火退火anneallingannealling）：）： 溫度降低時(shí)使引物溫度降低時(shí)使引物和其和其互補(bǔ)的模板在局部形成互補(bǔ)的模板在局部形成雜交鏈。雜交鏈。 3.3.延伸延伸extensionextension）：）： 在在DNADNA聚合酶和聚合酶和4 4種種脫脫氧核糖核苷酸及氧核糖核苷酸及Mg2Mg2存在存在的條件下，催化的條件下，催化DNADNA鏈鏈延延伸反應(yīng)。伸反應(yīng)。 模板模板DNA DNA 或或RNARNA 一對(duì)寡核苷酸引

5、物一對(duì)寡核苷酸引物 4 4種脫氧核糖核苷酸種脫氧核糖核苷酸(dNTPs)(dNTPs) 熱穩(wěn)定的聚合酶熱穩(wěn)定的聚合酶(Taq)(Taq)； Mg+Mg+緩沖液。緩沖液。PCR-PCR-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系凝膠電泳：經(jīng)溴化乙錠染色，在紫外照射下可見(jiàn)橙凝膠電泳：經(jīng)溴化乙錠染色，在紫外照射下可見(jiàn)橙紅色的特異紅色的特異DNADNA擴(kuò)增帶并可以在圖象成像儀下成像。擴(kuò)增帶并可以在圖象成像儀下成像。PCR-PCR-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)M 1 2 3 4 5 6 7 8 N P PCR-PCR-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的發(fā)展聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的發(fā)展不對(duì)稱不對(duì)稱PCR反向反

6、向PCR多重多重PCR差別差別PCR熒光熒光PCR錨式錨式PCR重組重組PCRPCR固相分析固相分析免疫免疫PCR反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)原位原位PCR熒光熒光PCR技術(shù)技術(shù)(Real Time PCR)熒光熒光PCR技術(shù)技術(shù)(Real Time PCR) PCR + 熒光標(biāo)記 + 監(jiān)測(cè)系統(tǒng)uNon-specific DNA binding dyesuSYBR Green IuEthidium Bromide uSpecific Hybridization ProbesuTaqManTM umolecular beaconsudual-oligo FRET pairs熒光熒光PCR技

7、術(shù)技術(shù)(Real Time PCR)R5335RRRRSYBR Green I 是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈?zhǔn)且环N結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA染料染料,與雙鏈與雙鏈DNA結(jié)合后結(jié)合后, 其熒光大大增強(qiáng)其熒光大大增強(qiáng).RRR497nm520nm熒光熒光PCR技術(shù)技術(shù)(Real Time PCR)RQ5335R=ReporterQ=Quencherprobe熒光熒光PCR技術(shù)技術(shù)(Real Time PCR)FRET Probes5353l3DR5DetectionExtension Step531. Strand DisplacementSystem Silent2. PolymerizationCom

8、pleteSystem Silent5335Taq3DR1-5 basesDRTaq5R5熒光熒光PCR技術(shù)技術(shù)(Real Time PCR)閾值線閾值線CT值值閾值線閾值線: 熒光閾值的缺省的設(shè)置是熒光閾值的缺省的設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)差的個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)差的10倍倍.CT值值: 各反應(yīng)管內(nèi)的信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)各反應(yīng)管內(nèi)的信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù).熒光熒光PCR技術(shù)技術(shù)(Real Time PCR)閾值線閾值線 CT值值多重?zé)晒舛嘀責(zé)晒釶CR技術(shù)技術(shù)FAMVICHEXTETCy3Texas RedROXCy5LC640Cy5.5LC705490nm6

9、60nmR限制性內(nèi)切酶和酶切技術(shù)及重組限制性內(nèi)切酶和酶切技術(shù)及重組限制性內(nèi)切酶是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶. 例如: EcoRI 可以識(shí)別5.G AATTC.33.CTTAA G.5 粘性末端T4連接酶: 重組 酶切與多態(tài)性分析技術(shù), GFP-MIP重組結(jié)構(gòu)重組結(jié)構(gòu)MIPmip基因是軍團(tuán)菌的巨嗜細(xì)胞感染增強(qiáng)子基因，具高度保守性和嗜肺軍團(tuán)菌種的特異性。表達(dá)的產(chǎn)物mip蛋白是迄今所公認(rèn)的嗜肺軍團(tuán)菌毒力因子之一，是嗜肺軍團(tuán)菌所特有，因此用來(lái)鑒定軍團(tuán)菌具有很強(qiáng)的特異性。GFP-MIP重組結(jié)構(gòu)重組結(jié)構(gòu)Southern blottingSouthern blotting和和No

10、rthern blottingNorthern blotting技術(shù)技術(shù) R6 GFP-ras -Gp +Gp -Gp +Gp -Gp +Gp -Gp +Gp4 10 4 10 days raf(2.5 kb) Actin28S18S主要步驟主要步驟:DNA(RNA)提取提取 和純化和純化;凝膠電泳凝膠電泳;印跡轉(zhuǎn)移印跡轉(zhuǎn)移;探針和雜交探針和雜交顯色顯色芯片技術(shù)芯片技術(shù)主要步驟主要步驟:芯片的制備芯片的制備DNA(RNA)提取提取 和純化和純化;探針的制備探針的制備雜交雜交顯色顯色結(jié)果判讀結(jié)果判讀芯片技術(shù)芯片技術(shù) -Gp +Gp芯片技術(shù)芯片技術(shù)T I II III IV C C登革熱病毒檢測(cè)芯

11、片: 通用探針的設(shè)計(jì), 合成和篩選, 修飾分型探針的設(shè)計(jì), 合成和篩選, 修飾預(yù)試驗(yàn), 樣品的處理;雜交及洗滌, 條件優(yōu)化等數(shù)據(jù)庫(kù)的建立應(yīng)用評(píng)價(jià)與多重PCR技術(shù)的比較DNA序列分析序列分析雙脫氧測(cè)序雙脫氧測(cè)序(Sanger法法)化學(xué)測(cè)序化學(xué)測(cè)序(Maxam-Gilbert法法)同位素標(biāo)記測(cè)序同位素標(biāo)記測(cè)序市售商品或公司運(yùn)作市售商品或公司運(yùn)作DNA序列分析序列分析 Start-ATTAGACGTCCGA” T G CA ATTAGATTA ATTAGACGATTAGA ATTAGACGTCCG AT ATTAGAC ATT ATTAGACGTC ATTAGACGT ATTAGACGTCG A T

12、 G C - ATTAGACGTCCG - ATTAGACGTC - ATTAGACGT - ATTAGACG - ATTAGAC - ATTAGA - ATTAG - ATTA - ATT - AT - A測(cè)序凝膠測(cè)序凝膠DNA序列分析序列分析(I)DNA序列分析序列分析(II)DNA序列分析序列分析(III)Western blottingWestern blotting技術(shù)技術(shù) 0 2 4 8 0 2 4 8 days R6 GFP-ras 76 kD44 kD44 kD42 kDAnti-Raf-1Anti-ErkAnti-p-ErkAnti-ActinGp treatment主要步驟

13、主要步驟:蛋白質(zhì)的提取蛋白質(zhì)的提取 和純化和純化;SDS-聚丙酰胺聚丙酰胺 凝膠電泳凝膠電泳;印跡轉(zhuǎn)移印跡轉(zhuǎn)移;抗體和雜交抗體和雜交顯色顯色膠體金檢驗(yàn)法膠體金檢驗(yàn)法氯化金在還原劑作用下氯化金在還原劑作用下, 可聚合成一定大小的金顆粒可聚合成一定大小的金顆粒, 形成帶負(fù)電的形成帶負(fù)電的疏水膠體溶液疏水膠體溶液(膠體金膠體金). 膠體金標(biāo)記就是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金標(biāo)記就是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包埋過(guò)程膠體金顆粒表面的包埋過(guò)程. 由于金具有高電子密度的特性由于金具有高電子密度的特性, 我們可我們可以在顯微鏡下或是在有相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)以在顯微鏡下或是在有相應(yīng)的配體處大量聚

14、集時(shí), 肉眼可見(jiàn)紫色的肉眼可見(jiàn)紫色的標(biāo)記標(biāo)記.CTCTCTCT霍亂弧菌霍亂弧菌O1群群(O139)快速檢測(cè)卡快速檢測(cè)卡: T-霍亂弧菌霍亂弧菌O1群群(O139)單克隆抗體單克隆抗體 C-羊抗鼠抗體羊抗鼠抗體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)的一般過(guò)程細(xì)胞培養(yǎng)的一般過(guò)程(細(xì)胞細(xì)胞, 培養(yǎng)基培養(yǎng)基, 實(shí)驗(yàn)室要求的條件等實(shí)驗(yàn)室要求的條件等)細(xì)胞的復(fù)蘇細(xì)胞的復(fù)蘇細(xì)胞的傳代細(xì)胞的傳代細(xì)胞的收獲細(xì)胞的收獲細(xì)胞的凍存細(xì)胞的凍存細(xì)胞培養(yǎng)污染的防治細(xì)胞培養(yǎng)污染的防治培養(yǎng)細(xì)胞的觀察等培養(yǎng)細(xì)胞的觀察等MTT Assay原理原理: 黃色的黃色的Tetrazolium Salt (MTT)在活細(xì)胞線粒體在活細(xì)胞線粒體S

15、DH酶的酶的作用下作用下, 生成藍(lán)色產(chǎn)物生成藍(lán)色產(chǎn)物. 根據(jù)顏色的濃度來(lái)判定活細(xì)胞的數(shù)目根據(jù)顏色的濃度來(lái)判定活細(xì)胞的數(shù)目, 從而推斷受試物的毒性大小從而推斷受試物的毒性大小.050100150R6R6-ras% Cell viability0 32 63 125 250 500 1000 2000MTT Assay g有關(guān)的一些分子生物學(xué)技術(shù)在食源性有關(guān)的一些分子生物學(xué)技術(shù)在食源性致病菌的快速檢測(cè)技術(shù)中的應(yīng)用致病菌的快速檢測(cè)技術(shù)中的應(yīng)用PCR技術(shù)技術(shù);引物的設(shè)計(jì)引物的設(shè)計(jì)(kit, 文獻(xiàn)文獻(xiàn), 自行設(shè)計(jì)自行設(shè)計(jì), 原則原則, gene bank); PubMed: /e

16、ntrez/query.fcgi多重多重PCR; 熒光熒光PCR;分子分型及相關(guān)技術(shù)分子分型及相關(guān)技術(shù)(結(jié)合細(xì)菌特征基因結(jié)合細(xì)菌特征基因PCR和限制和限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析PCR-RFLP, 核糖體基因分型核糖體基因分型Ribotyping, 脈沖場(chǎng)電泳脈沖場(chǎng)電泳Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE),同源性分析同源性分析, 溯源和預(yù)警等溯源和預(yù)警等霍亂霍亂CtxA基因的基因的PCR霍亂霍亂CtxA基因的基因的PCR霍亂霍亂CtxA基因的基因的PCR 1 gaattcccgg gttgtgggaa tgctccaaga tcatcg

17、atga gtaatacttg cgatgaaaaa 61 acccaaagtc taggtgtaaa attccttgac gaataccaat ctaaagttaa aagacaatat 121 ttttcaggct atcaatctga tattgataca cataatagaa ttaaggatga attatgatta 181 aattaaaatt tggtgttttt tttacagttt tactatcttc agcatatgca catggaacac 241 ctcaaaatat tactgatttg tgtgcagaat accacaacac acaaatatat acgct

18、aaatg 301 ataagatatt ttcgtataca gaatctctag ctggaaaaag agagatggct atcattactt 361 ttaagaatgg tgcaattttt caagtagaag taccaggtag tcaacatata gattcacaaa 421 aaaaagcgat tgaaaggatg aaggataccc tgaggattgcatatcttact gaagctaaag 481 tcgaaaagtt atgtgtatgg aataataaaa cgcctcatgc gattgccgca attagtatgg 541 caaattaaga

19、tataaaaaaa gcccacctca gtgggctttt ttgtggttcg atgatgagaa 601 gcaaccgttt tgcccaaaca tgtattactg caagtatgat gtttttattc cacatcctta 661 gtgcgtatta tgtatgttat gttaaattaa ggcataaaaa gaggtcgcaa accccaatct 721 gctccctatt cttaatccag cattaaacat aactgtattt accataaaat acctaataat 781 catatttatc atttgacaat gttaagtat

20、g attattatgg acattggcac tgtacttacg 841 tcaattgtgt gcaccaaagt g霍亂霍亂CtxA基因基因PCR擴(kuò)增毒力基因所用引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物分子量擴(kuò)增毒力基因所用引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物分子量毒力相關(guān)基因毒力相關(guān)基因引物序列（引物序列（53）擴(kuò)增產(chǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度物長(zhǎng)度（bp）編碼產(chǎn)物編碼產(chǎn)物aceTAA GGA TGT GCT TAT GAT GGA CAC CC CGT GAT GAA TAA AGA TAC TCA TAG G289AcetcpACAC GAT AAG AAA ACC GGT CAA GAG CGA AAG CAC CTT CTT T

21、CA CAC GTT G453TcpctxACGG GCA GAT TCT AGA CCT CCT GCGA TGA TCT TGG AGC ATT CCC AC564CTZotTCG CTT AAC GAT GGC GCG TTT T AAC CCC GTT TCA CTT CTA CCC A947ZotPCR擴(kuò)增霍亂毒力基因及擴(kuò)增產(chǎn)物分子量擴(kuò)增霍亂毒力基因及擴(kuò)增產(chǎn)物分子量 M 1 2 3 4 ZotctxAtcpAace多重多重PCR最早用于缺少基因片斷的檢測(cè)最早用于缺少基因片斷的檢測(cè); ;用于多基因的同時(shí)檢測(cè)或進(jìn)行細(xì)菌的屬用于多基因的同時(shí)檢測(cè)或進(jìn)行細(xì)菌的屬, , 種種, ,型以及特異型以

22、及特異性基因段的同時(shí)檢測(cè)性基因段的同時(shí)檢測(cè); ;對(duì)豬鏈球菌對(duì)豬鏈球菌2 2型型: : 檢索檢索GenbankGenbank中豬鏈球菌的屬、種及中豬鏈球菌的屬、種及毒力基因的基因序列，利用毒力基因的基因序列，利用Primer 5.0Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)軟件設(shè)計(jì)針對(duì)hemolysin genehemolysin gene溶血素基因）、溶血素基因）、epfepf基因、基因、NADNADP PH-H-dependent glutamate dehydrogenase genedependent glutamate dehydrogenase geneNADNADP PH H依賴性谷氨酸鹽脫

23、氫酶基因）、依賴性谷氨酸鹽脫氫酶基因）、rmlACBDrmlACBD基因進(jìn)行引物基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì), , 以后再按照國(guó)家以后再按照國(guó)家CDCCDC的有關(guān)指引補(bǔ)充了針對(duì)豬鏈球的有關(guān)指引補(bǔ)充了針對(duì)豬鏈球菌種特異性菌種特異性16S rRNA16S rRNA片段和特異性莢膜多糖基因片段片段和特異性莢膜多糖基因片段cps2Jcps2J的特異引物的特異引物. . 多重多重PCR擴(kuò)增霍亂毒力基因擴(kuò)增霍亂毒力基因 M 1 2 3 4 5 ZotctxAtcpAace1000200 M 1 2 3 4多重?zé)晒舛嘀責(zé)晒釶CR技術(shù)及應(yīng)用技術(shù)及應(yīng)用FAMVICHEXTETCy3Texas RedROXCy5LC64

24、0Cy5.5LC705490nm660nmRRQ53probeRQ53RQ53RQ53多重?zé)晒舛嘀責(zé)晒釶CR技術(shù)及應(yīng)用技術(shù)及應(yīng)用沙門氏沙門氏, 志賀氏志賀氏;霍亂弧菌霍亂弧菌;副溶血性弧菌副溶血性弧菌, 病原性大腸埃希菌病原性大腸埃希菌(出血性大腸桿菌出血性大腸桿菌O157：H7，致病性大腸桿菌、產(chǎn)毒性大腸桿菌、侵襲，致病性大腸桿菌、產(chǎn)毒性大腸桿菌、侵襲性大腸桿菌性大腸桿菌)，變形桿菌、溶血性鏈球菌、金黃色葡萄，變形桿菌、溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯菌、蠟樣芽孢桿菌、小腸結(jié)球菌、單核細(xì)胞增生李斯菌、蠟樣芽孢桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌腸炎耶爾森菌;空腸彎曲菌空腸彎曲菌;厭氧菌厭氧

25、菌(空彎空彎, 產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)氣莢膜梭菌, 肉毒梭菌肉毒梭菌);分子分型及相關(guān)技術(shù)分子分型及相關(guān)技術(shù)意義意義:1.歐洲和美國(guó)歐洲和美國(guó) 等已成立了細(xì)菌分子分型國(guó)家電子網(wǎng)絡(luò)等已成立了細(xì)菌分子分型國(guó)家電子網(wǎng)絡(luò)PulseNet),包括沙門菌、志賀菌、彎曲菌、出血性大包括沙門菌、志賀菌、彎曲菌、出血性大 腸桿菌腸桿菌O157：H7、李斯特菌、耶爾森菌和弧菌、李斯特菌、耶爾森菌和弧菌 ）;2.國(guó)內(nèi)尚無(wú)細(xì)菌分子分型的數(shù)據(jù)庫(kù)和網(wǎng)絡(luò)運(yùn)作系統(tǒng)國(guó)內(nèi)尚無(wú)細(xì)菌分子分型的數(shù)據(jù)庫(kù)和網(wǎng)絡(luò)運(yùn)作系統(tǒng) ;3.沒(méi)有在溯源、食源性疾病沒(méi)有在溯源、食源性疾病(食物中毒食物中毒)疫情判斷和確認(rèn)疫情判斷和確認(rèn) 及預(yù)警的實(shí)際工作中應(yīng)用及預(yù)警

26、的實(shí)際工作中應(yīng)用 分子分型及相關(guān)技術(shù)分子分型及相關(guān)技術(shù)近十年來(lái)發(fā)展并應(yīng)用了多種以直接分析基因多態(tài)性為依據(jù)的近十年來(lái)發(fā)展并應(yīng)用了多種以直接分析基因多態(tài)性為依據(jù)的高分辨率的分子分型系統(tǒng)，包括：高分辨率的分子分型系統(tǒng)，包括：用低頻率（用低頻率（30%）的內(nèi)切酶裂解）的內(nèi)切酶裂解DNA，通過(guò)脈沖場(chǎng)凝膠，通過(guò)脈沖場(chǎng)凝膠電泳電泳PFGE將切成的大片段分開(kāi)，根據(jù)條帶的大小及數(shù)量將切成的大片段分開(kāi)，根據(jù)條帶的大小及數(shù)量差異來(lái)分型的差異來(lái)分型的PFGE；限制性酶切與限制性酶切與Southern印跡雜交技術(shù)結(jié)合，采用印跡雜交技術(shù)結(jié)合，采用rRNA或或rDNA序列探針的核糖體基因分型序列探針的核糖體基因分型Ribo

27、typing）；）；以以PCR為基礎(chǔ)的的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析為基礎(chǔ)的的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析PCR-RFLP），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析AFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性態(tài)性DNA分析分析RAPD以及多位點(diǎn)序列分型以及多位點(diǎn)序列分型MLST）DNA測(cè)序。測(cè)序。常用基因分型方法的特點(diǎn)常用基因分型方法的特點(diǎn)分型方法分型方法可分型可分型菌株的菌株的比例比例重復(fù)重復(fù)性性 分辨力分辨力 解釋的解釋的容易程度容易程度 操作的操作的容易程度容易程度 質(zhì)粒限制性消化質(zhì)粒限制性消化 大多數(shù)大多數(shù) 好好 尚可尚可好好優(yōu)秀優(yōu)秀REA 全部全部 好好尚可尚可差差優(yōu)秀優(yōu)秀Riboty

28、ping 全部全部?jī)?yōu)秀優(yōu)秀尚可尚可好好好好PFGE 全部全部?jī)?yōu)秀優(yōu)秀好好優(yōu)秀優(yōu)秀好好PCR產(chǎn)物限制性消產(chǎn)物限制性消化化 全部全部?jī)?yōu)秀優(yōu)秀尚可尚可優(yōu)秀優(yōu)秀好好基于重復(fù)序列的基于重復(fù)序列的PCR 全部全部好好尚可尚可好好好好AP-PCR（RAPD） 全部全部尚可尚可好好尚可尚可好好核酸序列分析核酸序列分析 全部全部?jī)?yōu)秀優(yōu)秀優(yōu)秀優(yōu)秀優(yōu)秀優(yōu)秀尚可尚可注：表中的評(píng)價(jià)會(huì)因菌株的不同和技術(shù)的發(fā)展而變化注：表中的評(píng)價(jià)會(huì)因菌株的不同和技術(shù)的發(fā)展而變化RAPD分析霍亂弧菌的同源性分析霍亂弧菌的同源性M 1 2 3 4 5 6 7利用單一的任意序列的引物，隨機(jī)地?cái)U(kuò)增與靶序列完全或部分配對(duì)，利用單一的任意序列的引物，

29、隨機(jī)地?cái)U(kuò)增與靶序列完全或部分配對(duì)，以擴(kuò)增出特異的以擴(kuò)增出特異的DNA產(chǎn)物，然后進(jìn)行瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢產(chǎn)物，然后進(jìn)行瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)電泳條帶的不同，即所謂的多態(tài)性就可進(jìn)行基因定位、連鎖測(cè)，根據(jù)電泳條帶的不同，即所謂的多態(tài)性就可進(jìn)行基因定位、連鎖圖建立、品系圖建立、品系(種種)鑒別等方面。由于該技術(shù)具有快速靈敏，程序簡(jiǎn)便鑒別等方面。由于該技術(shù)具有快速靈敏，程序簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)等優(yōu)點(diǎn), 因此在短時(shí)間內(nèi)，已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究領(lǐng)域因此在短時(shí)間內(nèi)，已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究領(lǐng)域.聚類分析聚類分析凝膠成像系統(tǒng)得到凝膠成像系統(tǒng)得到RAPD圖像后，直接在其軟件中根據(jù)圖像后，直接在其軟件中根

30、據(jù)Marker及隨及隨機(jī)擴(kuò)增片段在凝膠中的位置計(jì)算不同擴(kuò)增片段的分子量大小，然后機(jī)擴(kuò)增片段在凝膠中的位置計(jì)算不同擴(kuò)增片段的分子量大小，然后采用采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件或其它聚類分析軟件，根據(jù)片段的分子量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件或其它聚類分析軟件，根據(jù)片段的分子量數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。進(jìn)行聚類分析。同源性分析同源性分析M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 3425002000100075050020001000750500例一例一例二例二利用利用SPSS軟件對(duì)前軟件對(duì)

31、前2圖進(jìn)行聚類分析，根據(jù)遺傳距離的差異，將圖進(jìn)行聚類分析，根據(jù)遺傳距離的差異，將34株霍亂弧菌分成了株霍亂弧菌分成了2個(gè)個(gè)聚類群，每個(gè)聚類群內(nèi)部菌株的遺傳距離基本相同，反映了這聚類群，每個(gè)聚類群內(nèi)部菌株的遺傳距離基本相同，反映了這2組菌株的親緣關(guān)系較近。組菌株的親緣關(guān)系較近。同源性分析同源性分析0281.250100150200250Enterohaemorrhagic E.coli.SEQShigella flexneri.SEQEnterobacter aerogenes.SEQKlebsiella pneumoniae.SEQYersinia enterocolitica.SEQShig

32、ella dysenteriae.SEQSalmonella enteritidis.SEQSalmonella choleraesuis.SEQSalmonella typhimurium.SEQSalmonella typhi.SEQEnteroinvasive E.coli.SEQEnteropathogenic E.coli.SEQEnterotoxingenic E.col.SEQProteus mirabilis.SEQ0352.050100150200250300350Proteus mirabilis.SEQSalmonella typhimurium.SEQKlebsiell

33、a pneumoniae.SEQEnterotoxingenic E.coli.SEQYersinia enterocolitica.SEQSalmonella choleraesuis.SEQEnterobacter aerogenes.SEQShigella flexneri.SEQShigella dysenteriae.SEQEnteroinvasive E.coli.SEQEnteropathogenic E.coli.SEQEnterohaemorrhagic E.coli.SEQSalmonella enteritidis.SEQSalmonella typhi.SEQ核糖體基因分型核糖體基因分型Ribotyping核糖體基因分型核糖體基因分型傷寒沙門菌傷寒沙門菌16S rRNA 基因擴(kuò)增片段的酶切鑒定基因擴(kuò)增片段的酶切鑒定: Bca I 酶切酶切 脈沖場(chǎng)電泳及相關(guān)技術(shù)脈沖場(chǎng)電泳及相關(guān)技術(shù)脈沖場(chǎng)電泳脈沖場(chǎng)電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)通過(guò)交替改變的電場(chǎng)方通過(guò)交替改變的電場(chǎng)方向向,