缺血性損傷對大鼠心肌生物膜的影響及益心康膠囊的保護(hù)作用

1、中藥藥理與臨床2000;16(62方法和結(jié)果211對S 180肉瘤鼠T 淋巴細(xì)胞酯酶染色率的影響取S 180肉25表2蜂毒對S 180肉瘤鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)碳粒廓清能力的影響(x ±s 組別劑量(動物數(shù)( 10101010K 值2333164±1815545190±1219452150±1812632120±121903值3172±11284120±01925183±113333瘤株接種于小鼠腹腔內(nèi),012ml/鼠,7天后, 將肉瘤鼠斷頭放血后, 放在瓷盤上, 消毒腹部, 用無菌針筒抽取腹部腹水, 以生理鹽水13稀釋,

2、 接種于小鼠腋窩皮下012ml/鼠, 第2天, 將肉瘤鼠隨機(jī)分4組, 每組12只。腹腔給藥015ml/20g , 連續(xù)5天, 末次給藥后2h , 于各鼠眼眶靜脈叢取血, 采置到干凈玻片上, 迅速推成均勻血涂片, 將片子自然干燥, 浸入到已預(yù)熱30min 的孵育液中孵育3h , 取出用自來水沖洗3min , 自然放干, 將涂片置復(fù)染液中, 染片15min , 取出, 自來水沖洗, 濾紙吸干, 鏡檢, 計數(shù)100個淋巴細(xì)胞, 觀察ANAE 陽性淋巴細(xì)胞, 計算陽性淋巴細(xì)胞染色率, 結(jié)果見表1。表1蜂毒對S 180肉瘤鼠T (x ±s 對照蜂毒蜂毒52Fu 3P <0. 050163

3、013247211法, 抽取S 18013稀釋, 接種于2226g 雄性小鼠腋窩皮下012ml/, 天, 將肉瘤鼠隨機(jī)分為4組, 每/鼠, 連續(xù)給藥4天(分組與只, 11 , 以10%SRBC 20/只鼠注入小鼠20h 后, 測厚儀測量小鼠足厚度, 計算差值作, 結(jié)果見表3。表3蜂毒對SRBC 誘發(fā)S 180肉瘤鼠足墊DTH 反應(yīng)的影響組別劑量(動物數(shù)( 10101010足腫脹度( 0118±01040116±01070115±01040111±0105組別對照蜂毒蜂毒52Fu劑量( 10101010E 3212±41915214±8

4、1484612±111085212±13186P 值t 值P 值0163013247615231714126<0. 01<0. 01<0. 01對照蜂毒蜂毒52Fu0163013247<0. 05結(jié)果所示, 蜂毒二個劑量組均可明顯增加S 180肉瘤鼠T 淋巴細(xì)胞酯酶陽性染色率。212對S 180肉瘤鼠血液中惰性碳粒廓清能力的影響按211法將肉瘤鼠隨機(jī)分為4組, 每組12只, 連續(xù)給藥5天, 末次給藥后24h , 于鼠尾靜脈注入稀釋墨汁(14 011ml/10g 鼠重, 注入墨汁后2min 、12min 分別用毛細(xì)管于小鼠眼眶后靜脈叢取血25l ,立即

5、放入 2ml 0. 1%Na 2CO 3溶液中, 取正常小鼠血溶于2ml 0. 1%Na2CO 3溶液中校零, 于分光光度計675nm 處測OD 值, 取肝、脾稱重, 結(jié)果見表2。結(jié)果所示:蜂毒在0132mg/kg 劑量組可顯著增強(qiáng)S 180肉瘤鼠RES 吞噬功能, K 值和值均見明顯增高。213蜂毒對SRBC 誘發(fā)S 180肉瘤鼠足DTH 反應(yīng)的影響按結(jié)果所示, 蜂毒兩個劑量組對S 180肉瘤鼠DTH 反應(yīng)未顯示明顯影響。3討論本文結(jié)果表明, 蜂毒0132mg/kg 、0163mg/kg 能增加T 淋巴細(xì)胞酯酶陽性染色率, 表明具有增強(qiáng)T 淋巴細(xì)胞功能的作用。光鏡下中性粒細(xì)胞數(shù)目相對多于T

6、淋巴細(xì)胞數(shù)目, 可能與S 180肉瘤鼠引起炎性滲出增多致腹水有關(guān)。蜂毒0132mg/kg 能增強(qiáng)S 180肉瘤鼠RES 對碳粒廓清能力, 具有增強(qiáng)RES 單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能作用。蜂毒對SRBC 誘發(fā)足墊DTH 反應(yīng)未能顯示明顯增強(qiáng)的作用。綜上所述, 蜂毒用于抗腫瘤治療, 其機(jī)理可能與增強(qiáng)RES 的吞噬功能和增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能有關(guān)。缺血性損傷對大鼠心肌生物膜的影響及益心康膠囊的保護(hù)作用韓玲陳可冀11(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所北京100850, 中國中醫(yī)研究院西苑醫(yī)院北京100091觀察了異丙腎上腺素(ISO 對大鼠心肌生物膜的損傷作用, 評價了益心康膠囊對心肌生物膜2線粒體和肌纖維膜的提要

7、保護(hù)作用。關(guān)鍵詞異丙腎上腺素; 線粒體; 肌纖維膜; 益心康膠囊; 磷脂; 磷脂酶A 2; 游離脂肪酸; 膜脂流動性已有研究表明, 心肌生物膜損傷是心肌細(xì)胞由可逆性損傷轉(zhuǎn)化為不可逆性損傷的早期特定和重要標(biāo)志。本實驗觀察了異丙腎上腺素?fù)p傷大鼠心肌模型心肌生物膜2線粒體及肌纖維膜的損傷作用及益氣活血中藥復(fù)方益心康膠囊對上述損傷導(dǎo)致的心肌肌纖維膜和線粒體膜結(jié)構(gòu)及功能損傷的保護(hù)作用。H303, 上海藥物研究所制藥廠生產(chǎn), 批號9506303, 棕色粉末狀物,014g/粒, 實驗時用水溶解配成50mg/ml 濃度。112動物Wistar 大鼠, 雄性, 體重250280g 。由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供

8、。113試劑DPH 為Sigma 產(chǎn)品。CP K 、LDH 、膽固醇試劑盒:1材料和方法111試驗藥物益心康膠囊由丹參、川芎、黃芪等組成, 簡稱中生公司產(chǎn)品; 磷脂測定試劑盒:德國Bavaria 公司產(chǎn)品。114儀器GF 21型控時調(diào)速式高速分散器(江蘇 ,CR21型高26中藥藥理與臨床2000;16(6量H303組, 可顯著降低線粒體和血清MDA 含量, 見表1。表1H303對ISO 損傷大鼠線粒體及血清MDA 水平的影響(x ±s,n =7速冷凍離心機(jī)(日立 , TLL 2C 型臺式高速冷凍離心機(jī)(北京 ,F 24000型熒光分光光度計(日立 。115異丙腎上腺素ISO 致在體大

9、鼠心肌損傷模型1大鼠背部皮下注射ISO 5mg/kg ,24h 后再重復(fù)注射相同劑量, 第二次注射后60分鐘處死動物后取血,4離心, 血清-20保存, 待測LDH 、CPK 、MDA 。另取011ml 血漿測LDH 。取200mg 左室, 制備心肌線粒體2及心肌肌纖維膜3, 測MDA 、膜脂流動性。線粒體脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物用微量測定法4。線粒體膜磷脂酶A 2(PLA 2 活性測定5。線粒體膜磷脂(PL 及膽固醇(CHO 的測定。PL 的測定, 磷脂測定試劑盒, 按trinder 酶法。CHO 測定, 應(yīng)用中生生物工程高技術(shù)公司生產(chǎn)的試劑盒,CHOD 2PAP 法測定。游離脂肪酸(FFA 的測定6。

10、膜脂流動性(L FU 的測定7, 應(yīng)用DPH 探針, 在熒光分光光度儀上測定。116分組及給藥隨機(jī)分為(1 ; (2 傷組(ISO ; (3 H303大劑量組(小劑量組(H 2S 50mg/kg 。每組7天開始灌胃給藥,2次/日, 連續(xù)7天。6天起sc ISO 造型。117統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用美國Sigmaplot 程序進(jìn)行t 檢驗。表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,P <0. 05, 具有統(tǒng)計學(xué)差異。組別對照損傷H303H303劑量(線粒體MDA ( 16129±6198102138±4613633#血清MDA ( 96125±8114183115±

11、;261233123133±141553333#3#1005025101±11194#3與對照組比3P <0. 05, P <0. 01;<0. 01(下同21ISO 損傷大鼠血中CP K組分別升高了33%和56%。H303可顯著損傷所致的CP K 和LDH 水平的升高, 見表2。表2H303對ISO 損傷大鼠血清酶水平的影響(x ±s ,n =7 組別對照損傷H303H30310050劑量(mg/kg LDH (U/L 157167±53178358175±92102210189±8814833#CP K (U/L

12、 631124±206111943157±2931743841172±210148685196±167184#195167±67174#2結(jié)果211H303對大鼠心肌組織脂質(zhì)過氧化的影響ISO 損傷大鼠213H303對線粒體磷脂酶A 2活性的影響ISO 損傷大鼠心心肌可導(dǎo)致心肌線粒體及血清MDA 含量異常升高, 尤以心肌線粒體升高為著, 分別較正常CON 升高了48%、84%, 兩個劑表3組別對照損傷H303H30310050肌線粒體PLA 2活性顯著升高。預(yù)防性給予H303, 可明顯抑制PLA 2活性的升高, 見表3。H303對ISO 大鼠心

13、肌線粒PLA 2、PL 、CHO 及PL/CHO 比值的影響(x ±s 劑量(mg/kg PLA 2( 92184±5143126140±814633#PL (mol/mg pro 245195±65191165171±2912733#CHO (mol/mg pro 11745±0150511784±0137211957±0133811857±01330PL/CHO141182±1319794116±1310133#110157±8199#231120±28129#

14、120107±17185333與CON 組比較3P <0. 05, 33P <0. 01; 與ISO 組比較#P <0. 05, #P <0. 01214H303對大鼠心肌線粒體PL/CHO 的影響表3結(jié)果表CON 組增加了54%; 微粘度增加約58%, 因此導(dǎo)致線粒體膜明,ISO 損傷組線粒體膜PL 總量顯著降低, H 2L 和H 2S 組可明顯提高線粒體膜PL 含量對CHO 含量, 無顯著影響。損傷組可見PL/CHO 比值比正常CON 組降低了34%。H303對PL/CHO 的降低均具有一定的改善作用。215H303對大鼠心肌線粒體和肌纖維膜游離脂肪酸的影

15、響ISO 損傷可致大鼠心肌線粒體、心肌肌纖維膜及血清中的FFA 含量及水平明顯升高。給予H303后可明顯降低FFA 的升高, 大劑量組也可顯著降低線粒體及肌纖維膜的FFA 含量, 小劑量組僅可使肌纖維膜的FFA 顯著降低, 對線粒體的FFA 含量增高無顯著性降低作用, 見表4。表4H303對ISO 大鼠血清、心肌線粒體及肌纖維膜游離脂肪酸的影響(x ±s ,n =7組別對照損傷H303H303劑量(mg/脂流動性L FU 顯著降低。H303可明顯改善其流動性的降低。大鼠心肌肌纖維膜的膜脂流動性變化與上述相同, ISO 可值增高,L FU 顯著降低。H303預(yù)防性致心肌纖維膜的P 值、

16、給藥后可使其改善, 見表5。表5H303對ISO 大鼠心肌線粒體及肌纖維膜脂流動性(L FU 的影響(x ±s ,n =7組別對照線損傷粒體H -LH -S 對照肌纖損傷維H -L 膜H -S劑量(熒光偏振度( 01116±0100301138±010053301124±01004333301180±0101801277±010303301221±010323#微粘度( 01672±0102301857±0104633膜脂流動性( 2818±1181911±116332417±

17、;11933331012±217311±01933612±2173#15#01735#±010343#311299±0121111917±0153133#3#血清FFA (Eq/ 71177±12123Eq/mg FFA (pro 線粒體33131±1716#31164±0196533#肌纖維膜199134±140184#33333141124±2913333159167±9519133419141 ±19614231005085177±915438013

18、6±712747123±43175#242132±126174#138147±4211933223144±118133#3討論本研究表明ISO 確可致心肌嚴(yán)重?fù)p傷, 表現(xiàn)為:脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多, 線粒體及血中MDA 水平異常增高; 心肌組織損216H303對大鼠心肌線粒體、肌纖維膜膜脂流動性的影響大鼠ISO 損傷后線粒體膜脂中的DPH 探針的熒光偏振度P 比中藥藥理與臨床2000;16(6傷, 酶漏出增加, 血中CP K 及LDH 水平增高; 線粒體磷脂酶A 2激活, 繼而導(dǎo)致線粒體膜PL 含量減少, 分解產(chǎn)物FFA 增加, 并造成線粒體膜、肌

19、纖維膜L FU 降低。H303為抗心肌缺血及再灌注損傷的中藥復(fù)方8,9。本實驗發(fā)現(xiàn)預(yù)防性給予H303可通過如下途徑發(fā)揮其抗心肌缺血作用。311減輕生物膜的脂質(zhì)過氧化程度本研究表明, ISO 損傷可導(dǎo)致大鼠體內(nèi)或線粒體脂質(zhì)過氧化水平明顯增高, 導(dǎo)致了生物膜損傷。H303可使因ISO 所致的線粒體膜的脂質(zhì)過氧化程度減輕, 從而發(fā)揮其抗損傷作用。312抑制PLA 2的激活, 減輕PL 的分解及FFA 的增加實驗結(jié)果表明,ISO 損傷可導(dǎo)致膜PL 含量降低, FFA 含量增加, 說明是因PLA 2的激活所產(chǎn)生的結(jié)果。PL 降解產(chǎn)生的FFA 和溶血磷脂均可對膜脂產(chǎn)生去垢樣作用, 壞。此外,ISO 屬兒茶

20、酚胺類物質(zhì), FFA 水平的增高, 故在ISO 高。FFA 抑制作用, 因而使得A TP , 而導(dǎo)致氧化磷酸化脫偶聯(lián), 使ADP/O 降低, 影響線粒體呼吸功能。FFA 中的花生四烯酸還可經(jīng)環(huán)氧化酶和脂氧化酶途徑, 在分解產(chǎn)生脂介質(zhì)的過程中形成自由基, 從而進(jìn)一步加重心肌損傷10。H303可明顯降低ISO 損傷所致的PLA 2活性的增高, 并使膜磷脂的降解減少,FFA 的生成減少, 說明H303可通過抑制氧自由基的產(chǎn)生或抑制自由基或增加內(nèi)源性抗氧化能力等作用而發(fā)揮其心肌保護(hù)作用。313阻止生物膜脂流動性的降低本文結(jié)果, ISO 模型大鼠心 均顯著增加, 肌線粒體及肌纖維膜熒光偏振度(P 及微粘

21、度(表明膜脂流動性降低。而H303可有效地抑制ISO 損傷后的膜脂流動性的降低。其可能機(jī)制為:(1 H303通過抑制ISO 損傷27后的脂質(zhì)過氧化而減少MDA 進(jìn)入膜脂雙層結(jié)構(gòu)的水相與膜蛋白、膜脂上的NH 2交聯(lián)形成Shiff s 堿而降低的膜脂流動性; (2 H303通過降低PLA 2的激活而減少膜磷脂的降解, 使膜磷脂分子中的不飽和脂肪酸增加, 來維持其膜脂流動性。參考文獻(xiàn)1Sanchez VC. Sequential changes of energy metabolism and mitochondrial function in myocardial infarciton induc

22、ed by isoproterenol in rats :a long 2term and integrative study. Can J Pharmacol ,1997;75130013112Zydowo MM , G , et al. The respiration and cal 2of rats with vitamin 2D 2induced car 2155161Dk , K arlimer TS. Refined membrane preparations fall in myodardial 2receptor density. Am J Physicol ,1989; 25

23、7(3pt2 H1032H10364孫士勇, 徐波, 李秋菊, 等1在96孔板上進(jìn)行脂質(zhì)過氧化的微量測定1生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1995;22(2 1651695陳思鋒, 吳中立1體液和組織磷脂酶A 2簡便快速測定法1第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,1989;10(3 2542566李龍官1臨床生化檢驗1上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,19791687Lin KC , Nie SQ , Bo H J et al. Research on membrane fluidity of ascites cells with fluorescence probe DPH. Biochem Biophys ,1981;63134

24、8韓玲, 任建平, 楊素娟, 等1益心康膠囊和復(fù)方丹參片對心肌代謝及其耗氧量的影響1中藥藥理與臨床,2000;16(2 359韓玲, 陳可冀1氧應(yīng)激對線粒體的損傷及抗心肌缺血中藥復(fù)方益心康膠囊含藥血清的保護(hù)作用1中國心血管藥理通訊,2000;233010Steven C. Hendricksonm , James D. St. Louis , James E. Lowe Abdel 2aleem. Free fatty acid metabolism during myocardial ischemia and reperfu 2sion. Molecular and Cellular Biochemistry ,1997;1668594E ffect of ischemia injury on myocardium bio 2membrane and the protective effect