淺談紅曲米中七株紅曲霉純培養(yǎng)的分離鑒定

1、淺談紅曲米中七株紅曲霉純培養(yǎng)的分離鑒定        文章標(biāo)題：淺談紅曲米中七株紅曲霉純培養(yǎng)的分離鑒定摘要：從廣西武宣地區(qū)的紅曲米中分純得到7株紅曲霉純培養(yǎng)。初步鑒定分屬3類(lèi)：M-1、M-2、M-6屬于紫色紅曲霉類(lèi)，M-4、M-5屬于紅色紅曲霉類(lèi)，M-3、M-7屬于叢毛狀紅曲霉類(lèi)。發(fā)現(xiàn)M-1菌株具有較為突出的紅曲色素產(chǎn)生能力，通過(guò)形態(tài)觀察和耐酒精、耐NaCl實(shí)驗(yàn)，對(duì)M-1菌株進(jìn)行了種的鑒定。關(guān)鍵詞：紅曲米；紅曲霉；分純；鑒定中圖分類(lèi)號(hào)：TS201.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A自1884年VanTieghen首次分離出紅曲霉，至

2、今已有百年的歷史。近幾年紅曲霉的許多功效相繼被證實(shí)后，紅曲菌的相關(guān)專(zhuān)利陸續(xù)出現(xiàn)。自1975年至1997年為止各國(guó)關(guān)于紅曲霉的專(zhuān)利將近200篇1。目前紅曲色素應(yīng)用是紅曲研究的主要方向，近20年有近40的專(zhuān)利都在此領(lǐng)域。1979年紅曲霉被發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生膽固醇合成抑制劑，紅曲霉降血糖、血壓及膽固醇功效即成為眾人關(guān)注的焦點(diǎn)2。另外作為食品添加劑也是紅曲應(yīng)用的主要方向，有關(guān)添加紅曲成為功能性食品的專(zhuān)利有31篇，且多在日本申請(qǐng)。還有用于生產(chǎn)各種酶的專(zhuān)利15篇，以及在化妝品、處理廢水、飼料上的應(yīng)用3。對(duì)紅曲霉的研究已從紅曲色素?cái)U(kuò)展到有關(guān)降血壓、血糖及膽固醇，紅曲霉抗菌作用等多個(gè)方面。本論文報(bào)道了對(duì)廣西所產(chǎn)紅曲米

3、中紅曲霉的分離純化工作。對(duì)廣西武宣一帶的紅曲米中的紅曲霉進(jìn)行分純，得到了7個(gè)純培養(yǎng)，進(jìn)行了屬的鑒定。發(fā)現(xiàn)其中一株有較為突出的抗菌能力（另文發(fā)表）；還有一株有較為突出的產(chǎn)紅曲色素能力。研究成果擴(kuò)大了紅曲霉的菌種庫(kù)，為發(fā)掘紅曲霉生物資源做了有益工作。1實(shí)驗(yàn)材料1.1紅曲米：取自廣西武宣地區(qū)，是居民制作紅糟酸所用的發(fā)酵劑。1.2培養(yǎng)基：富集活化液：120Bx米曲汁900mL，乳酸7mL，無(wú)水乙醇100mL，于121滅菌20min，使用時(shí)以無(wú)菌操作加入30ppm鏈霉素。分純培養(yǎng)基:120Bx米曲汁900mL，6NaCl，2瓊脂，121滅菌30min。2研究方法2.1紅曲霉的分純與鑒定：取紅曲米25粒放

4、入100mL富集活化液中，30培養(yǎng)天。采用米曲瓊脂汁培養(yǎng)基，對(duì)數(shù)稀釋傾注法分純。以無(wú)菌操作將生長(zhǎng)迅速、健壯的菌落，挑取放到富集活化液中繼續(xù)富集活化，待培養(yǎng)5天后重復(fù)上述分純操作，經(jīng)過(guò)多次操作就可以分離得到紅曲霉純培養(yǎng)。通過(guò)菌落形態(tài)、菌絲體形態(tài)觀察，耐酒精、耐NaCl實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行紅曲霉純培養(yǎng)的鑒定。2.2紅曲霉產(chǎn)紅曲色素的研究：用米曲汁培養(yǎng)基，遮光，32，160r/min培養(yǎng)六天。用分光光度法測(cè)定總色價(jià)。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1紅曲霉的富集活化活化培養(yǎng)的第二天，紅曲米開(kāi)始有附著的白色菌絲；第三天紅曲米上浮，米身附著大量菌絲；第四天紅曲米全部上浮，菌絲開(kāi)始粘連；五天以后出現(xiàn)白色菌膜；七八天后白色菌膜轉(zhuǎn)變?yōu)榧t

5、色。根據(jù)菌體質(zhì)量測(cè)定，紅曲霉生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期大約處于第五、第六天，最適合用作接種材料。3.2紅曲霉的分離鑒定：3.2.1菌落形態(tài)特征。紅曲霉培養(yǎng)初期都為白色小菌落，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，菌落開(kāi)始老熟，表面的顏色變化比較豐富，有的菌落顏色開(kāi)始改變，逐漸變成橙色、淺藍(lán)色、灰色、鉛灰色和灰白色等；菌落的主要形狀為皮膜狀和絨毯狀，大多菌落有放射狀的溝紋，邊沿一般比較整齊。得到7個(gè)純培養(yǎng)，菌落特征見(jiàn)表1。表17株紅曲霉純培養(yǎng)的菌落形態(tài)菌株菌落大小正面形態(tài)皺折顏色側(cè)面觀背面顏色編號(hào)(mm)M-138圓形絨墊狀輻射狀紅色凸起深紅色M-220圓形皮膜狀有皺折白色不凸起紅色M-338圓形絨墊狀輻射狀橙色凸起橙色M-440圓形皮

6、膜狀輻射狀白綠灰不明顯橙色M-529圓形皮膜狀不明顯白鉛綠不凸起橙色M-620圓形皮膜狀不明顯白綠不凸起橙色M-742圓形絨墊狀不明顯白色不凸起橙色注:菌落從里至外為三個(gè)色環(huán)，顏色依次為灰色、綠色和白色；菌落從里至外為兩個(gè)色環(huán)，顏色依次為灰色和白色；菌落從里至外為兩個(gè)色環(huán)，顏色依次為綠色和白色。3.2.2個(gè)體形態(tài)特征。30培養(yǎng)3天的紅曲霉純培養(yǎng)，用手術(shù)刀切取大小約1×1的菌苔，制成水浸片，鏡檢觀察個(gè)體形態(tài)，7個(gè)菌株均觀察到細(xì)胞橫隔，有足細(xì)胞，梨形的分生孢子，有的還觀察到閉囊殼結(jié)構(gòu)如圖1。注：氣生菌絲和足細(xì)胞注：分杈菌絲注：閉囊殼圖1紅曲霉的個(gè)體形態(tài)圖（640×）3.2.3曲

7、霉純培養(yǎng)的分類(lèi)根據(jù)以上形態(tài)觀察結(jié)果，將株純培養(yǎng)鑒定為紅曲霉屬4。根據(jù)1992年ATCC真菌目錄，紅曲霉菌主要可分為三大類(lèi)。按照文獻(xiàn)的檢索方法對(duì)所得的7個(gè)菌株進(jìn)行        測(cè)定后，分類(lèi)結(jié)果見(jiàn)表2。表2株紅曲霉純培養(yǎng)的分類(lèi)結(jié)果類(lèi)別MEA上菌落直徑（mm）色素顆粒菌株編號(hào)M.purpureur<28mm有M-2M-6M-1M.pilosus28mm有M-3M-7M.ruber28mm無(wú)M-5M-4M-1、M-2、M-6屬于紫色紅曲霉類(lèi)(M.purpureus)，M-4、M-5屬于紅色紅曲霉類(lèi)(M.ruber)

8、，M-3、M-7屬于叢毛狀紅曲霉類(lèi)(M.pilosus)。3.3M-1的紅曲色素產(chǎn)生能力分純過(guò)程中發(fā)現(xiàn)M-1菌株的菌落及其培養(yǎng)液顯示出突出的紅色，見(jiàn)圖3、圖4、圖5。我們對(duì)其進(jìn)行了種的鑒定和紅曲色素產(chǎn)生能力的測(cè)定。圖3M-1，M-2，M-3，M-4菌株發(fā)酵液3.3.1根據(jù)PDA平板上30培養(yǎng)7天的結(jié)果和耐乙醇、NaCl特征可以對(duì)M-1菌株進(jìn)一步分類(lèi)，結(jié)果如表3所示。表3M-1菌株的分類(lèi)特征菌株形成菌落分生孢子產(chǎn)色素耐30耐6代號(hào)閉囊殼形狀鏈形狀乙醇NaClM-1否溶巖狀螺旋產(chǎn)生不耐不耐根據(jù)檢索表5，將M-1菌株鑒定為M.purpureusWen紫色紅曲菌。3.2.2M-1、M-2、M-3、M-

9、4產(chǎn)紅曲色素的能力米曲汁培養(yǎng)基，32，160r/min遮光培養(yǎng)六天。用分光光度法測(cè)定總色價(jià)。結(jié)果見(jiàn)表4。表4M-1，M-2，M-3，M-4菌株產(chǎn)色素能力對(duì)比菌株第一次146.689.862.162.5第二次143.383.857.359.2第三次142.681.360.857.1平均144.285.060.159.6可見(jiàn)M-菌株產(chǎn)紅曲色素能力十分突出，發(fā)酵液總色價(jià)為144.2/mL。4結(jié)論4.1從廣西武宣紅曲米中獲得了7個(gè)紅曲霉純培養(yǎng)。M-2、M-6、M-1屬于紫色紅曲霉類(lèi)(M.purpureus)，M-5、M-4屬于紅色紅曲霉類(lèi)(M.ruber)，M-3、M-7屬于叢毛狀紅曲霉類(lèi)(M.pilosus)。4.2成功篩選到一株發(fā)酵液總色價(jià)為144.2/ml的紅曲霉菌株M-1。經(jīng)形態(tài)觀察和耐酒精、耐NaCl能力實(shí)驗(yàn)鑒定為紫色紅曲霉（M.purpureusWen）。說(shuō)明廣西武宣地區(qū)的紅曲米中的紅曲霉在產(chǎn)生紅曲色素方面具有較高的研究潛力。4.3關(guān)于M-1號(hào)菌株所產(chǎn)色素的成分、性質(zhì)還有待進(jìn)一步研究和探討。以M-1作為出發(fā)菌株，通過(guò)誘變育種和基因工程，開(kāi)發(fā)紅曲色素生產(chǎn)菌株具有研究?jī)r(jià)值。參考文獻(xiàn)1陳彥霖,李昭蓉,陳建州等.紅曲菌種的研究開(kāi)發(fā)與應(yīng)用J.食品工業(yè)月刊(臺(tái)),1998,30.2路秀玲,趙樹(shù)欣,宮慧梅.紅曲霉的應(yīng)用研究現(xiàn)狀與展望J.食品科技,2001,(1):43-46.3賈波