過濾技術(shù)對(duì)血液中腫瘤細(xì)胞去除作用的可行性研究

1、過濾技術(shù)對(duì)血液中腫瘤細(xì)胞去除作用的可行性研究寧吉順 王惠霞 高成杰 類維富作者單位：濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院麻醉科，濟(jì)南市，250031通訊作者：類維富，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院麻醉科工作，濟(jì)南市，250012 摘要 目的：觀察白細(xì)胞過濾器能否將血液回收機(jī)漂洗后殘存的腫瘤細(xì)胞徹底清除；觀察經(jīng)白細(xì)胞過濾器過濾后紅細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及其Na+-K+ATP酶活性是否發(fā)生改變。方法：選擇胃腫瘤細(xì)胞SGC-170以及腸腫瘤細(xì)胞LOVO，進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞消化后制成單一細(xì)胞懸液，采集非腫瘤患者術(shù)野血液，經(jīng)過濾、離心、漂洗，采集到濃縮紅細(xì)胞。將細(xì)胞懸液中的腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)后放入濃縮的紅細(xì)胞中，混勻。將混有腫瘤細(xì)胞的濃縮紅細(xì)胞采用血液回收

2、機(jī)將其過濾、離心、漂洗，將漂洗后得到的濃縮紅細(xì)胞用白細(xì)胞過濾器過濾，觀察過濾后腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，測(cè)定紅細(xì)胞Na+-K+ATP酶，觀察紅細(xì)胞的形態(tài)及活性。結(jié)果：經(jīng)過白細(xì)胞過濾器過濾后的血樣中未發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞，而對(duì)照組中可見到腫瘤細(xì)胞。將血樣稀釋10倍后置于1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)14天。發(fā)現(xiàn)過濾后的血樣未見腫瘤細(xì)胞生長，而對(duì)照組有大量的腫瘤細(xì)胞生長，過濾后的紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)未發(fā)生明顯改變，Na+-K+ ATP酶含量與對(duì)照縛相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著性差異。結(jié)論：自體血液回收機(jī)配合白細(xì)胞過濾器，可完全去除血液中的腫瘤細(xì)胞，對(duì)紅細(xì)胞形態(tài)及Na+-K+ ATP酶活性未產(chǎn)生明顯影響。 關(guān)鍵詞：回收式；自體輸血；白細(xì)胞

3、清除過濾器； Na+-K+ ATP酶Effect of leucocyte depletion filter on contaminating tumor cells and red blood cells in intraoperative autotransfusion bloodObject: whether leucocyte depletion filter could remove the left tumor cells that were being washed through the cell saver, whether the morphology of the red

4、 blood cell was changed through cell saver and leucocyte depletion filter, whether the Na+-K+ ATP dipase of the red blood cell was changed. Methods: Red blood cell concentrate was inoculated with intestiual cancer cell LOVO and gastric cancer cell SGC. The blood was centrifuged, washed through cell

5、saver, the tumor cells was then isolated from centrifuge, and the living tumor cells could be calculated with trypan blue and cultured. The left tumor cells after being washed through cell saver went filtered through the leucocyte depletion filter, and the living tumor cells could be calculated with

6、 typan blue and cultured, unwashed and unfiltered blood was used as a control and then cultured. The left tumor cells after being washed and filtered were cultured for two weeks. The colony forming assay was analyzed by microscopy. At the same time the morphology and the Na+-K+ ATP dipase of the red

7、 blood cells. Conclusion: Cell saver can not completely remove malignant cells from blood; After being washed through cell saver and being filtered through leucocyte depletion filter, the malignant cells in blood can be completely removed; The morphology and the Na+-K+ ATP dipase of the red blood ce

8、lls are not changed after being washed through cell saver and being filtered through leucocyte depletion filter.Key words: intraoperative autotransfusion; leucocyte depletion filter; Na+-K+ ATP自體血液回收技術(shù)的推廣應(yīng)用對(duì)血液保護(hù)的實(shí)施發(fā)揮了巨大作用。但由于腫瘤患者，采用自體血液回收技術(shù)并不能將血液中的腫瘤細(xì)胞徹底清除1。本研究在應(yīng)用自體血液回輸技術(shù)聯(lián)合白細(xì)胞過濾器，觀察能否將血液中的腫瘤細(xì)胞徹底清除，是

9、否對(duì)紅細(xì)胞產(chǎn)生影響。1 資料與方法1.1 資料選擇胃腫瘤細(xì)胞SGC-170以及腸腫瘤細(xì)胞LOVO，進(jìn)行培養(yǎng)，接種于RPMI1640培養(yǎng)基，在37、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周，用機(jī)械和0.25%胰蛋白酶消化，待細(xì)胞成熟后吸出，制成單一細(xì)胞懸液。腫瘤細(xì)胞株均經(jīng)山東大學(xué)齊魯醫(yī)院病理科組織學(xué)鑒定未發(fā)現(xiàn)畸形細(xì)胞。1.2 研究設(shè)備 自體血液回收機(jī)Cell Savers（美國血液公司）；白細(xì)胞過濾器（南京雙威實(shí)業(yè)公司生產(chǎn)）；Eppendorf centrifuge 5804R冷凍離心機(jī)；UV/vis 7530-G分光光度儀5.5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。ATP酶測(cè)試盒：南京建成生物工程研究所制備。測(cè)定高速冷凍

10、后紅細(xì)胞膜的ATP酶活性；RPMI1640培養(yǎng)基（GIBCO公司生產(chǎn)）Brdu肝素（Sigma公司）；PDGF小鼠抗Brdu（Oncogene Science公司）。2 方法2.1 取腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞消化后制成單一細(xì)胞懸液，觀察腫瘤細(xì)胞的活性。2.2 采集非腫瘤患者術(shù)野血液，回收入血液回收機(jī)貯血罐，經(jīng)過濾、離心、漂洗，采集到濃縮紅細(xì)胞200ml。2.3 將細(xì)胞懸液中的腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)后放入濃縮的紅細(xì)胞中，混勻。取出7ml血樣做對(duì)照。將混有腫瘤細(xì)胞的濃縮紅細(xì)胞采用血液回收機(jī)將其過濾、離心、漂洗，得到濃縮紅細(xì)胞。2.4 將漂洗后得到的濃縮紅細(xì)胞用白細(xì)胞過濾器過濾，過濾后的血樣取7ml。其中5m

11、l加入Percall分離液中，經(jīng)離心分離腫瘤細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)濃縮紅細(xì)胞中存活的腫瘤細(xì)胞。并將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。剩余2ml血樣測(cè)定紅細(xì)胞Na+-K+ ATP酶，觀察紅細(xì)胞的形態(tài)及活性。2.5 將對(duì)照血樣、過濾后的血樣各稀釋10倍，經(jīng)轉(zhuǎn)速為2000rpm/min密度梯度離心30min，取中間層腫瘤細(xì)胞（密度1.021.05），接種于直徑35mm的1640培養(yǎng)皿中，置于37 、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。靜態(tài)培養(yǎng)14天。14天后將腫瘤細(xì)胞收集，觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)是否改變，是否有克隆形成，并對(duì)腫瘤細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行計(jì)數(shù)。2.6 紅細(xì)胞Na+-K+ ATP酶活性測(cè)定。蛋白質(zhì)測(cè)量為280nm紫外比色，

12、以牛血清的蛋白為對(duì)照，濃度為5mg/ml。三次試驗(yàn)計(jì)算紅細(xì)胞Na+-K+ ATP酶的活性。2.7 離心、過濾對(duì)紅細(xì)胞質(zhì)量的影響，隨機(jī)選取5目，細(xì)胞數(shù)在60個(gè)以上，且細(xì)胞疏密程度適中的1000倍視野進(jìn)行拍照。在400倍的放大率下，瀏覽整張玻片，觀察血樣中雜質(zhì)微粒的大小及數(shù)量。3 檢測(cè)觀察的指標(biāo)3.1 觀察過濾后腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，同時(shí)臺(tái)盼藍(lán)染色觀察腫瘤細(xì)胞數(shù)目的改變，并與對(duì)照組進(jìn)行比較。3.2 將過濾后的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)兩周進(jìn)行克隆形成試驗(yàn)。與對(duì)照組相比較，觀察細(xì)胞克隆形成情況，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞的數(shù)目。3.3 過濾后紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，并進(jìn)行Na+-K+ ATP酶含量測(cè)定，并與對(duì)照組比較。3.

13、4 觀察過濾后非血液成份中的碎片和微粒。4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理紅細(xì)胞Na+-K+ ATP酶油定結(jié)果，數(shù)據(jù)采用±S表示，采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05，p<0.05為有顯著性差異。結(jié)果1經(jīng)白細(xì)胞過濾器過濾后的血樣中未發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞，而對(duì)照組中可見到大量的腫瘤細(xì)胞，見圖1，2。2克隆形成實(shí)驗(yàn)將血樣稀釋10倍后置于1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)14天。發(fā)現(xiàn)過濾后的血樣未見腫瘤細(xì)胞生長，而對(duì)照組有大量的腫瘤細(xì)胞生長，見圖3、4。3紅細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及Na+-K+ ATP酶含量測(cè)定過濾后的紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)未發(fā)生明顯改變，Na+-K+ ATP酶含量與對(duì)照組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著性差異，見表1。4過濾后的紅細(xì)胞質(zhì)量及形態(tài)變

14、化掃描電子顯微鏡所見：回收血液清洗前均有較多細(xì)胞碎片及微小組織碎屑，其中組織碎屑以骨屑、肌肉組織為主。漂洗后，細(xì)胞碎片明顯減少，但仍可見少量組織碎屑等非血液優(yōu)分微粒。PALL 40SQ型微聚體輸血濾器過濾后，視野中非血液成分微粒明顯減少。表1 紅細(xì)胞Na+-K+ ATP酶測(cè)定結(jié)果（±S，n=3）處 理Na+-K+ ATP酶（umol pi/mg pro/hr）對(duì) 照0.137±0.034漂 洗0.125±0.026過 濾0.122±0.022與對(duì)照組比較，p>0.05，無顯著性差異。圖1 對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)七天時(shí)（×400）圖2 過濾后細(xì)胞培

15、養(yǎng)七天時(shí)（×400）圖3 對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)兩周時(shí)（×400）圖4 過濾后細(xì)胞培養(yǎng)兩周時(shí)（×400）討論隨著外科手術(shù)的發(fā)展，晚期困難腫瘤手術(shù)病人術(shù)中常伴隨大量的出血，多需要輸注異體血補(bǔ)充血容量，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)約有1/4的庫血用于腫瘤手術(shù)中。這些病人面臨因輸異體血而帶來的并發(fā)癥和危險(xiǎn)，尤其對(duì)于腫瘤病人，由于免疫力的被抑制造成的感染、傳染病和腫瘤復(fù)發(fā)率的上升。雖然有人主張腫瘤自體血可回輸，但大多局限于離心、漂冼的研究。去白細(xì)胞過濾器避免了由白細(xì)胞引起的輸血反應(yīng)、非溶血性發(fā)熱反應(yīng)（NHFR）、成人呼吸窘迫綜合征、輸血后移植物抗宿主癥（GVUD），減弱了親細(xì)胞病毒感染。Kong

16、sgaard2，利用白細(xì)胞過濾器RC400將自體回收血中乳腺癌細(xì)胞PM1和MGF7清除掉，其過濾后的血液中并未發(fā)現(xiàn)具有活性的腫瘤細(xì)胞，Wisel3采用自體血液回收機(jī)（Althin Mediplast）和去除白細(xì)胞過濾器（Pall RC 100），處理含有腫瘤細(xì)胞（膀胱、前列腺、腎癌細(xì)胞）的紅細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理后腫瘤細(xì)胞可被徹底清除。Edelman-MJ4則分別將同樣的腫瘤細(xì)胞通過去除白細(xì)胞過濾器（LDF）和去除紅細(xì)胞過濾器（SBF），并將過濾后的細(xì)胞行臺(tái)盤藍(lán)染色，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)無論臺(tái)盤藍(lán)染色還是細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)果均提示LDF可完全去除腫瘤細(xì)胞，而血液回收機(jī)離心、漂洗不能將腫瘤細(xì)胞完全去除

17、。本次實(shí)驗(yàn)選用具有繁殖能力的腸腫瘤細(xì)胞與胃腫瘤細(xì)胞，將其計(jì)數(shù)后放入濃縮的紅細(xì)胞中。在血樣培養(yǎng)的過程中動(dòng)態(tài)觀察腫瘤細(xì)胞的生長情況。結(jié)果，培養(yǎng)7天時(shí)，對(duì)照樣本有克隆形成，漂洗后血樣及過濾后血樣均未發(fā)現(xiàn)有克隆形成；培養(yǎng)14天后，過濾后血樣未發(fā)現(xiàn)有腫瘤細(xì)胞生長，對(duì)照樣本、漂洗后血樣均有大量的腫瘤細(xì)胞團(tuán)。而過濾后血樣仍未見有克隆形成，從而進(jìn)一步證明了第四代白細(xì)胞過濾器可完全去除腫除細(xì)胞。白細(xì)胞過濾器由于其過濾介質(zhì)僅0.3-3um，并且交織成非編織的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，因而能夠比較有效地去除腫瘤細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過濾后臺(tái)盼藍(lán)染色未發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)14天后亦未發(fā)現(xiàn)有腫瘤細(xì)胞克隆形成，DNA代謝物測(cè)定未發(fā)現(xiàn)具有繁殖能

18、力的細(xì)胞存在。而紅細(xì)胞由于直徑小、無核并且具有變形性，可以通過濾網(wǎng)而不發(fā)生形態(tài)破壞，其生理功能也不受影響。從血液中去除腫瘤細(xì)胞的前提是不損傷紅細(xì)胞。紅細(xì)胞呈雙凹圓碟形，在全身血管中循環(huán)運(yùn)行時(shí)，可擠過口徑比它小的毛細(xì)血管和血竇孔隙。在此過程中，紅細(xì)胞可發(fā)生卷曲變形，在通過后又可恢復(fù)原狀，其可塑性較好。實(shí)驗(yàn)中我們采用等滲氯化鈉鹽水，因此在血液漂洗機(jī)離心、漂洗過程中，能夠維持其形態(tài)的穩(wěn)定性，而不易發(fā)生水腫、破裂。實(shí)驗(yàn)中研究者應(yīng)用了較為可靠的紅細(xì)胞Na+-K+ ATP酶活性檢測(cè)紅細(xì)胞功能及顯微鏡觀察紅細(xì)胞的形態(tài)。結(jié)果顯示：顯微鏡下未發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞有明顯的形態(tài)學(xué)改變。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，采用血液回收機(jī)離心漂洗不能徹底清除，在紅細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的分層界各種細(xì)胞是混雜的，不能保證所有的腫瘤細(xì)胞能完全與紅細(xì)胞完全分離開，因此直接回輸是不安全的。而白細(xì)胞過濾器（如RC400TE）由于限制了通過濾網(wǎng)的細(xì)胞直徑，從而安全、有效地禁止腫瘤細(xì)胞通過。該研究實(shí)驗(yàn)證明，通過血液回收機(jī)的離心、漂洗配合白細(xì)胞過濾器的應(yīng)用可清除血液中混雜的腫瘤細(xì)胞，同國外多數(shù)研究相同。配合使用白細(xì)胞過濾器進(jìn)一步增加了腫瘤外科手術(shù)中自體血液回輸?shù)陌踩?。參考文獻(xiàn)1Hansen E, Waff