第七節(jié)高效液相色譜

1、 高效液相色譜法高效液相色譜法2:521高效液相色譜簡介 2020世紀(jì)初：世紀(jì)初： 俄國植物學(xué)家茨維特提出經(jīng)典液相色譜法。經(jīng)俄國植物學(xué)家茨維特提出經(jīng)典液相色譜法。經(jīng)典液相色譜法包括柱色譜、薄層色譜、紙色譜。典液相色譜法包括柱色譜、薄層色譜、紙色譜。2020世紀(jì)世紀(jì)6060年代末：年代末：隨著色譜理論的發(fā)展、高效細(xì)微固定相的開發(fā)、隨著色譜理論的發(fā)展、高效細(xì)微固定相的開發(fā)、高壓恒流泵及高靈敏度檢測器的應(yīng)用，高效液相色高壓恒流泵及高靈敏度檢測器的應(yīng)用，高效液相色譜法得到了突破性的發(fā)展。譜法得到了突破性的發(fā)展。 高效液相色譜是在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上，采用了高效液相色譜是在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上，采用了高

2、壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，實(shí)現(xiàn)了高高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，實(shí)現(xiàn)了高效分離和自動(dòng)化操作。效分離和自動(dòng)化操作。2:5222:523采用顆粒極細(xì)、規(guī)則均勻的固定相，傳質(zhì)阻力小，分離效率高采用顆粒極細(xì)、規(guī)則均勻的固定相，傳質(zhì)阻力小，分離效率高HPLC特點(diǎn) 高壓：流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱時(shí)，受阻力較大，為了迅速通過色譜柱，高壓：流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱時(shí)，受阻力較大，為了迅速通過色譜柱，HPLCHPLC使用高壓輸液泵對(duì)流動(dòng)相加高壓，壓力可達(dá)使用高壓輸液泵對(duì)流動(dòng)相加高壓，壓力可達(dá)40-50MPa 40-50MPa 。 高效：分離效能高，柱效達(dá)高效：分離效能高，柱效達(dá)40000-6000040000-6

3、0000塊塊/m/m。 應(yīng)用范圍廣：約適用于應(yīng)用范圍廣：約適用于80%80%的有機(jī)物，特別是高沸點(diǎn)、大分子、的有機(jī)物，特別是高沸點(diǎn)、大分子、熱穩(wěn)定性差的有機(jī)化合物。熱穩(wěn)定性差的有機(jī)化合物。 速度快速度快: :流動(dòng)相速度流動(dòng)相速度1 110ml/mim,10ml/mim,通常分析一個(gè)樣品在通常分析一個(gè)樣品在151530 min30 min，有些樣品甚至在有些樣品甚至在5min5min內(nèi)即可完成。內(nèi)即可完成。 分辨率高分辨率高: :可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果?？蛇x擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果。 靈敏度高靈敏度高: :紫外檢測器可達(dá)紫外檢測器可達(dá)0.01ng0.01ng，熒光和電化

4、學(xué)檢測器可達(dá)，熒光和電化學(xué)檢測器可達(dá)0.1pg0.1pg。 柱子可重復(fù)使用柱子可重復(fù)使用: :用一根色譜柱可分離不同的化合物。用一根色譜柱可分離不同的化合物。 樣品量少樣品量少: :幾微升至幾十微升幾微升至幾十微升 重復(fù)性好重復(fù)性好2:5242:525流動(dòng)相流動(dòng)相選擇范圍選擇范圍分離過程分離過程樣品狀態(tài)樣品狀態(tài)色譜柱色譜柱 柱溫柱溫分離對(duì)象分離對(duì)象性質(zhì)性質(zhì)流動(dòng)相流動(dòng)相不同不同2:526流動(dòng)相及選擇范圍、樣品狀態(tài)、色譜柱溫、分離對(duì)象流動(dòng)相及選擇范圍、樣品狀態(tài)、色譜柱溫、分離對(duì)象高效液相色譜法局限性高效液相色譜法局限性 成本高成本高 易污染環(huán)境易污染環(huán)境 不能代替氣相色譜，無法完成柱效高達(dá)不能代替

5、氣相色譜，無法完成柱效高達(dá)10萬塊萬塊理論塔板數(shù)的分析理論塔板數(shù)的分析2:527液相色譜分類液相色譜分類按分離原理分類：按分離原理分類： 吸附色譜法吸附色譜法 分配色譜法分配色譜法 離子交換色譜法離子交換色譜法 體積排阻色譜法體積排阻色譜法按固定相形式：按固定相形式：柱色譜法柱色譜法 紙色譜法紙色譜法 薄層色譜法薄層色譜法按固定相種類：按固定相種類：液固色譜液固色譜 液液色譜液液色譜 鍵合相色譜鍵合相色譜硅膠為填料的液固色譜和以硅膠為基質(zhì)的鍵合相色譜應(yīng)用最廣硅膠為填料的液固色譜和以硅膠為基質(zhì)的鍵合相色譜應(yīng)用最廣2:528液固色譜法液固色譜法分離機(jī)理：固定相是固體吸附劑，流動(dòng)相中各組分對(duì)固分離機(jī)

6、理：固定相是固體吸附劑，流動(dòng)相中各組分對(duì)固定相的吸附能力不同，使各組分在固定相中保留不同而定相的吸附能力不同，使各組分在固定相中保留不同而實(shí)現(xiàn)分離實(shí)現(xiàn)分離2:5291） 固定相固定相 極性：極性：硅膠硅膠、氧化鎂、氧化鋁等、氧化鎂、氧化鋁等 非極性：活性炭、碳多孔微球等非極性：活性炭、碳多孔微球等2 2） 流動(dòng)相流動(dòng)相 弱極性有機(jī)溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的弱極性有機(jī)溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的混合物。如：正構(gòu)烷烴（己烷、庚烷等）、二氯甲烷混合物。如：正構(gòu)烷烴（己烷、庚烷等）、二氯甲烷/ /甲醇、甲醇、乙酸乙酯乙酸乙酯/ /乙腈等乙腈等流動(dòng)相選擇原則：極性大的試樣選擇極性較強(qiáng)的流動(dòng)相，極流動(dòng)相

7、選擇原則：極性大的試樣選擇極性較強(qiáng)的流動(dòng)相，極性小的試樣則選用低極性流動(dòng)相。必要時(shí)可采用混合溶劑或性小的試樣則選用低極性流動(dòng)相。必要時(shí)可采用混合溶劑或梯度洗脫。梯度洗脫。 3 3）應(yīng)用）應(yīng)用 中等分子量的油溶性樣品如油品、脂肪、芳烴中等分子量的油溶性樣品如油品、脂肪、芳烴等等 不同極性取代基的化合物不同極性取代基的化合物 結(jié)構(gòu)異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體混合物的分離結(jié)構(gòu)異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體混合物的分離2:52102:5211 液液分配色譜法液液分配色譜法 固定相（機(jī)械吸附在惰性載體上的液體）與流動(dòng)相均為固定相（機(jī)械吸附在惰性載體上的液體）與流動(dòng)相均為液體但互不相溶，極性相差大，對(duì)待測組分溶解度都足夠大液體

8、但互不相溶，極性相差大，對(duì)待測組分溶解度都足夠大（待測組分在固定相的溶解度要大些）（待測組分在固定相的溶解度要大些）基本原理：基本原理： 試樣溶于流動(dòng)相后，在色譜柱內(nèi)經(jīng)過兩相分界面進(jìn)入固定試樣溶于流動(dòng)相后，在色譜柱內(nèi)經(jīng)過兩相分界面進(jìn)入固定液中。由于試樣組分在固定相和流動(dòng)相之間的相對(duì)溶解度存在液中。由于試樣組分在固定相和流動(dòng)相之間的相對(duì)溶解度存在差異，因而組分在兩者間進(jìn)行分配，根據(jù)組分在兩相中分配系差異，因而組分在兩者間進(jìn)行分配，根據(jù)組分在兩相中分配系數(shù)的不同實(shí)現(xiàn)分離數(shù)的不同實(shí)現(xiàn)分離。 液一液分配色譜法與氣一液色譜法的比較：液一液分配色譜法與氣一液色譜法的比較： 相似處：相似處： 分離順序決定于

9、分配系數(shù)的大小，分離順序決定于分配系數(shù)的大小，K K大的組分保留值大。大的組分保留值大。 不同處：不同處： GCGC流動(dòng)相性質(zhì)對(duì)流動(dòng)相性質(zhì)對(duì)K K影響不大，而影響不大，而LCLC中流動(dòng)相種類對(duì)中流動(dòng)相種類對(duì)K K影響較影響較大。大。 分配色譜按固定相和流動(dòng)相極性分為分配色譜按固定相和流動(dòng)相極性分為 正相色譜正相色譜: :固定相載體上涂布極性固定液固定相載體上涂布極性固定液, ,流動(dòng)相是非極流動(dòng)相是非極性溶劑性溶劑, ,可分離極性較強(qiáng)的水溶性樣品可分離極性較強(qiáng)的水溶性樣品, ,弱極性組分先出峰弱極性組分先出峰 反相色譜反相色譜: :固定相載體上涂布非極性或弱極性固定液固定相載體上涂布非極性或弱極

10、性固定液, ,流流動(dòng)相是極性溶劑動(dòng)相是極性溶劑, ,可分離非極性和弱極性的樣品可分離非極性和弱極性的樣品, ,強(qiáng)極性組強(qiáng)極性組分先出峰分先出峰 液液分配色譜固定相固定液易流失液液分配色譜固定相固定液易流失, ,重現(xiàn)性差重現(xiàn)性差, ,不不能進(jìn)行梯度洗脫，使用局限能進(jìn)行梯度洗脫，使用局限2:5212化學(xué)鍵合相色譜法化學(xué)鍵合相色譜法將各種不同有機(jī)基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離將各種不同有機(jī)基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。羥基上。作用機(jī)理：分配作用機(jī)理：分配+ +吸附吸附化學(xué)鍵合固定相具有如下優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)鍵合固定相具有如下優(yōu)點(diǎn)：柱效高：傳質(zhì)速度比一般液體固定相快；柱效高

11、：傳質(zhì)速度比一般液體固定相快；穩(wěn)定性：耐溶劑沖洗，無固定液流失，色譜柱的穩(wěn)定性穩(wěn)定性：耐溶劑沖洗，無固定液流失，色譜柱的穩(wěn)定性好、好、柱效高、壽命長柱效高、壽命長； 應(yīng)用范圍廣：改變鍵合有機(jī)分子的結(jié)構(gòu)和基團(tuán)的類型，能靈應(yīng)用范圍廣：改變鍵合有機(jī)分子的結(jié)構(gòu)和基團(tuán)的類型，能靈活地改變分離的選擇性，適用于分離幾乎所有類型的化合物；且活地改變分離的選擇性，適用于分離幾乎所有類型的化合物；且能用各種溶劑作流動(dòng)相（梯度洗脫）。能用各種溶劑作流動(dòng)相（梯度洗脫）。 2:52132:5214化學(xué)鍵合相色譜固定相化學(xué)鍵合相色譜固定相 OHSi 化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相: : a. a. 硅氧碳鍵型：硅氧碳鍵型：

12、 SiSiO OC C b. b. 硅氧硅碳鍵型：硅氧硅碳鍵型：SiSiO OSi Si C C c. c. 硅碳鍵型：硅碳鍵型： SiSiC C d. d. 硅氮鍵型：硅氮鍵型： SiSiN N疏水基團(tuán)疏水基團(tuán) 如不同鏈長的烷烴（如不同鏈長的烷烴（C C8 8和和C C1818）和苯基等）和苯基等極性基團(tuán)極性基團(tuán) 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。固定相極性小固定相極性小 如硅膠如硅膠-C18，硅膠硅膠-苯基；苯基； 流動(dòng)相極性大流動(dòng)相極性大 甲醇甲醇-水、乙腈水、乙腈-水、水和無機(jī)鹽的緩沖液。水、水和無機(jī)鹽的緩沖液。 反相鍵合色譜法反相鍵合色譜法 分析對(duì)象分析對(duì)象 多

13、用于多環(huán)芳烴多用于多環(huán)芳烴(PAHs)等低極性化合物分離；改變流等低極性化合物分離；改變流動(dòng)相配比，動(dòng)相配比，也可分離極性化合物；緩沖液可用于易離也可分離極性化合物；緩沖液可用于易離解的化合物，如有機(jī)解的化合物，如有機(jī)有機(jī)酸、有機(jī)酸、有有機(jī)機(jī)堿和酚堿和酚類類。 固定相極性固定相極性大大 硅膠硅膠-OH(或雙或雙-OH)，硅膠硅膠-CN 流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性小小 烴類烴類+適量極性溶劑適量極性溶劑(CHCl3，CH3OH，CH3CN) 正正相鍵合色譜法相鍵合色譜法 分析對(duì)象分析對(duì)象 多用于極性或中等極性化合物的分離。多用于極性或中等極性化合物的分離。還可用于分離還可用于分離異構(gòu)體、異構(gòu)體、極性不

14、同的化合物以及不同類型的化合物。極性不同的化合物以及不同類型的化合物。 正相和反相鍵合色譜法正相和反相鍵合色譜法 離子對(duì)色譜離子對(duì)色譜 1.1.基本原理基本原理 將一種或數(shù)種與樣品離子電荷（將一種或數(shù)種與樣品離子電荷（A A+ +）相反的離子）相反的離子(B(B- -) )（稱為對(duì)離子（稱為對(duì)離子或反離子）加入到色譜系統(tǒng)流動(dòng)相中，使其與樣品離子結(jié)合生成弱或反離子）加入到色譜系統(tǒng)流動(dòng)相中，使其與樣品離子結(jié)合生成弱極性的離子對(duì)（中性締合物）的分離方法。多為反相離子對(duì)色譜極性的離子對(duì)（中性締合物）的分離方法。多為反相離子對(duì)色譜2.2.固定相、流動(dòng)相和離子對(duì)試劑固定相、流動(dòng)相和離子對(duì)試劑固定相固定相:

15、 :多為多為C18,C8C18,C8反相鍵合相反相鍵合相流動(dòng)相流動(dòng)相: :以水為主的緩沖液，或水以水為主的緩沖液，或水- -甲醇、水甲醇、水- -乙腈等混合溶劑乙腈等混合溶劑離子對(duì)試劑：四丁基銨正離子、十六烷基三甲基銨正離子，離子對(duì)試劑：四丁基銨正離子、十六烷基三甲基銨正離子，ClOClO4 4- -，十，十二烷基磺酸根等二烷基磺酸根等 應(yīng)用有機(jī)酸、有機(jī)堿特別是強(qiáng)酸有機(jī)酸、有機(jī)堿特別是強(qiáng)酸強(qiáng)堿的分析，如羧酸、磺酸、強(qiáng)堿的分析，如羧酸、磺酸、胺類、酚類、藥物、染料等胺類、酚類、藥物、染料等反相離子對(duì)色譜分析有機(jī)酸反相離子對(duì)色譜分析有機(jī)酸固定相：固定相：C18C18烷基鍵合相烷基鍵合相流動(dòng)相：流動(dòng)

16、相：0.03mol/L0.03mol/L四丁基銨四丁基銨+ +戊醇戊醇 1. 4-1. 4-氨基苯甲酸；氨基苯甲酸；2. 3-2. 3-氨基氨基苯甲酸；苯甲酸；3. 4-3. 4-羥基苯甲酸；羥基苯甲酸； 4. 3-4. 3-羥基苯甲酸；羥基苯甲酸；5. 5. 苯磺酸；苯磺酸； 6. 6. 苯甲苯甲酸；酸； 7. 7. 甲苯甲苯-4-4-磺酸磺酸體積排阻色譜體積排阻色譜固定相：凝膠固定相：凝膠( (具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布) )，表面惰性、含許多，表面惰性、含許多尺寸不同的孔穴或立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)尺寸不同的孔穴或立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)分離原理：分離原理： 按分子尺寸大小和形狀不同進(jìn)行分離的一種

17、液相色譜法。按分子尺寸大小和形狀不同進(jìn)行分離的一種液相色譜法。當(dāng)被測組分隨流動(dòng)相通過凝膠色譜柱時(shí)當(dāng)被測組分隨流動(dòng)相通過凝膠色譜柱時(shí): : 尺寸大于孔徑的組分分子不能滲入凝膠孔隙而被全部排斥尺寸大于孔徑的組分分子不能滲入凝膠孔隙而被全部排斥，最先流出色譜柱，最先流出色譜柱 尺寸小于孔徑的分子則全部滲入空穴，最后流出尺寸小于孔徑的分子則全部滲入空穴，最后流出尺寸中等分子部分滲入較大空穴，而排斥較小空穴。因此介尺寸中等分子部分滲入較大空穴，而排斥較小空穴。因此介于中間流出。于中間流出。2:5219分類：分類： 軟質(zhì)凝膠軟質(zhì)凝膠 凝膠過濾色譜凝膠過濾色譜以水溶液作流動(dòng)相以水溶液作流動(dòng)相 硬質(zhì)凝膠硬質(zhì)凝

18、膠 凝膠滲透色譜凝膠滲透色譜以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相硬質(zhì)凝膠應(yīng)用更為廣泛硬質(zhì)凝膠應(yīng)用更為廣泛應(yīng)用：分離相對(duì)分子質(zhì)量大于應(yīng)用：分離相對(duì)分子質(zhì)量大于20002000的化合物；分子質(zhì)量的化合物；分子質(zhì)量相差較大的低聚物和小分子化合物相差較大的低聚物和小分子化合物2:5220高效液相色譜儀儀器組成高效液相色譜儀儀器組成 HPLCHPLC主要有高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分主要有高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)，檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和相關(guān)輔助離系統(tǒng)，檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和相關(guān)輔助部件組成。部件組成。212:52 貯液罐貯液罐v用于存放溶劑，材料要耐腐性，對(duì)溶劑惰性用于存放溶劑，材料要耐腐性，

19、對(duì)溶劑惰性v常用常用1-2L1-2L玻璃瓶，也可用不銹鋼、氟塑料制成玻璃瓶，也可用不銹鋼、氟塑料制成v貯液罐應(yīng)配有溶劑過濾器，以防止流動(dòng)相中顆粒流入泵中貯液罐應(yīng)配有溶劑過濾器，以防止流動(dòng)相中顆粒流入泵中v貯液罐放置位置要高于泵體，以保持輸液靜壓差，使用過程貯液罐放置位置要高于泵體，以保持輸液靜壓差，使用過程應(yīng)密閉，防止溶劑揮發(fā)引起流動(dòng)相組成改變應(yīng)密閉，防止溶劑揮發(fā)引起流動(dòng)相組成改變 高壓泵高壓泵高壓方式輸送流動(dòng)相，提供的壓強(qiáng)高壓方式輸送流動(dòng)相，提供的壓強(qiáng)150450Kg/cm2，流量流量0.10.110ml/min10ml/min，能連續(xù)工作，能連續(xù)工作泵要求：泵要求： 流量穩(wěn)定（流量穩(wěn)定（0

20、.5%0.5%），壓力平穩(wěn)無脈動(dòng)、耐腐蝕、適用于有），壓力平穩(wěn)無脈動(dòng)、耐腐蝕、適用于有機(jī)溶劑、水和緩沖液、密封性好、泵體易于清洗和維修。機(jī)溶劑、水和緩沖液、密封性好、泵體易于清洗和維修。 泵有恒流泵和恒壓泵兩類。泵有恒流泵和恒壓泵兩類。高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)輔助裝置輔助裝置 溶劑過濾器：去除機(jī)械雜質(zhì)和固體顆粒溶劑過濾器：去除機(jī)械雜質(zhì)和固體顆粒 脫氣裝置：去除流動(dòng)相中的各類氣體，以保證柱效脫氣裝置：去除流動(dòng)相中的各類氣體，以保證柱效梯度洗脫裝置梯度洗脫裝置 當(dāng)樣品組成復(fù)雜，組分性質(zhì)差別較大，組分在流動(dòng)相和固當(dāng)樣品組成復(fù)雜，組分性質(zhì)差別較大，組分在流動(dòng)相和固定相中的分配系數(shù)差別很大時(shí)，導(dǎo)致部分組

21、分不能有效分定相中的分配系數(shù)差別很大時(shí)，導(dǎo)致部分組分不能有效分離、部分組分保留時(shí)間過長離、部分組分保留時(shí)間過長,可采用梯度洗脫改變?nèi)軇┑慕M可采用梯度洗脫改變?nèi)軇┑慕M成、極性、成、極性、PH、離子強(qiáng)度，以提高選擇性。、離子強(qiáng)度，以提高選擇性。 通過梯度裝置可使兩種或三種、四種溶劑按一定比例混合通過梯度裝置可使兩種或三種、四種溶劑按一定比例混合進(jìn)行二元三元或四元梯度洗脫。進(jìn)行二元三元或四元梯度洗脫。 優(yōu)點(diǎn)：改善峰形、提高柱效、分離復(fù)雜混合物時(shí)能使所優(yōu)點(diǎn)：改善峰形、提高柱效、分離復(fù)雜混合物時(shí)能使所有組分都處在最佳的有組分都處在最佳的k值范圍內(nèi)、減少分析時(shí)間值范圍內(nèi)、減少分析時(shí)間2:5222梯度洗脫裝

22、置梯度洗脫裝置 低壓梯度（內(nèi)梯度）：溶劑在常壓下混合，再低壓梯度（內(nèi)梯度）：溶劑在常壓下混合，再用高壓泵輸送至柱系統(tǒng)。簡單、經(jīng)濟(jì)，只需一用高壓泵輸送至柱系統(tǒng)。簡單、經(jīng)濟(jì)，只需一個(gè)泵，所用溶劑的元數(shù)沒有限制。個(gè)泵，所用溶劑的元數(shù)沒有限制。 高壓梯度（外梯度）：一般由兩臺(tái)高壓泵構(gòu)成，高壓梯度（外梯度）：一般由兩臺(tái)高壓泵構(gòu)成，每臺(tái)泵輸送一種溶劑。溶劑在混合室混合后，每臺(tái)泵輸送一種溶劑。溶劑在混合室混合后，再輸入柱系統(tǒng)。再輸入柱系統(tǒng)。2:5223242:52隔膜式注射進(jìn)樣器進(jìn)樣、高壓進(jìn)樣閥進(jìn)樣隔膜式注射進(jìn)樣器進(jìn)樣、高壓進(jìn)樣閥進(jìn)樣隔膜式注射進(jìn)樣器進(jìn)樣隔膜式注射進(jìn)樣器進(jìn)樣 可以柱頭進(jìn)樣，減小死體積，充分可

23、以柱頭進(jìn)樣，減小死體積，充分發(fā)揮柱子的性能，簡單便宜；缺點(diǎn)是高壓進(jìn)樣時(shí)漏液，會(huì)產(chǎn)發(fā)揮柱子的性能，簡單便宜；缺點(diǎn)是高壓進(jìn)樣時(shí)漏液，會(huì)產(chǎn)生誤差，隔墊使用次數(shù)有限、進(jìn)樣量小、重復(fù)性差生誤差，隔墊使用次數(shù)有限、進(jìn)樣量小、重復(fù)性差高壓閥進(jìn)樣高壓閥進(jìn)樣 使用耐高壓的六通閥、雙路進(jìn)樣閥，操作時(shí)先將進(jìn)樣口與使用耐高壓的六通閥、雙路進(jìn)樣閥，操作時(shí)先將進(jìn)樣口與定量環(huán)連接，用注射器向定量環(huán)注入樣品液，然后定量環(huán)接定量環(huán)連接，用注射器向定量環(huán)注入樣品液，然后定量環(huán)接入流動(dòng)相管路，流動(dòng)相將樣品帶入色譜柱。入流動(dòng)相管路，流動(dòng)相將樣品帶入色譜柱。 六通閥進(jìn)樣器的進(jìn)樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。六通閥進(jìn)樣器的進(jìn)樣方式有

24、部分裝液法和完全裝液法兩種。使用部分裝液法進(jìn)樣時(shí)，要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同；使使用部分裝液法進(jìn)樣時(shí)，要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同；使用完全裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量最少為定量環(huán)體積的用完全裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量最少為定量環(huán)體積的3 3至至5 5倍，倍，即即20l20l的定量環(huán)最少進(jìn)樣的定量環(huán)最少進(jìn)樣6060至至100l100l的樣品，這樣才能完全的樣品，這樣才能完全置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液，達(dá)到所要求的精密度及重現(xiàn)置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液，達(dá)到所要求的精密度及重現(xiàn)性。性。 2:5225進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)2:52262:5227色譜柱色譜柱 柱溫箱柱溫箱 連接管連接管1 1）色譜柱：色譜分離的首要任務(wù)

25、是選擇性能良好的色譜柱能）色譜柱：色譜分離的首要任務(wù)是選擇性能良好的色譜柱能以獲得高的分離效率和較短的分析時(shí)間以獲得高的分離效率和較短的分析時(shí)間（1 1）柱材料及規(guī)格）柱材料及規(guī)格 柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑聚合材料的其他金屬等。柱長襯光滑聚合材料的其他金屬等。柱長5-50cm,5-50cm,內(nèi)徑內(nèi)徑1-6mm1-6mm。凝膠色。凝膠色譜內(nèi)徑譜內(nèi)徑3-12mm;3-12mm;制備柱內(nèi)徑在制備柱內(nèi)徑在25mm25mm以上以上（2 2）柱填料：固定液涂在擔(dān)體上而成。擔(dān)體有表面多孔型、）柱填料：固定液涂在擔(dān)體上而成。擔(dān)體有表面多孔型、全多孔型。全多孔型

26、。 全多孔微粒擔(dān)體全多孔微粒擔(dān)體（粒徑（粒徑5-10um,5-10um,由由10nm10nm級(jí)的硅膠微粒堆積而成，級(jí)的硅膠微粒堆積而成，又叫堆積硅珠，顆粒小、柱效高、應(yīng)用較廣泛）又叫堆積硅珠，顆粒小、柱效高、應(yīng)用較廣泛） （3 3）保護(hù)柱）保護(hù)柱 長度一般為分析柱長度一般為分析柱1/51/5。價(jià)格較低。價(jià)格較低。 作用：阻斷、收集來自進(jìn)樣器的機(jī)械和化學(xué)雜質(zhì)，延長柱壽作用：阻斷、收集來自進(jìn)樣器的機(jī)械和化學(xué)雜質(zhì)，延長柱壽命命 分析分析50-10050-100次樣品，柱壓力有增大趨勢(shì)時(shí)需更換保護(hù)柱或次樣品，柱壓力有增大趨勢(shì)時(shí)需更換保護(hù)柱或色譜柱分離度下降時(shí)考慮更換色譜柱分離度下降時(shí)考慮更換分離系統(tǒng)分

27、離系統(tǒng)2:52282 2）柱溫控制柱溫控制 HPLCHPLC分析中，柱溫一般為室溫或接分析中，柱溫一般為室溫或接近室溫。近室溫。 適當(dāng)提高柱溫可改善傳質(zhì)阻力、提高柱效、縮短適當(dāng)提高柱溫可改善傳質(zhì)阻力、提高柱效、縮短分析時(shí)間。分析時(shí)間。 恒溫加熱柱溫箱恒溫加熱柱溫箱 柱溫設(shè)置一般界于室溫到柱溫設(shè)置一般界于室溫到6060之間之間 3 3）柱連接方式）柱連接方式 要求死體積小要求死體積小 用窄孔（內(nèi)徑用窄孔（內(nèi)徑0.13mm0.13mm）和厚壁（）和厚壁（1.5-2.0mm)1.5-2.0mm)不銹不銹鋼管，以減小柱外死體積鋼管，以減小柱外死體積 2:5229檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng) 檢測器的作用：檢測器的

28、作用： 將流動(dòng)相中組分含量的變將流動(dòng)相中組分含量的變化變成可測量的電信號(hào)，輸入記錄儀?；兂煽蓽y量的電信號(hào)，輸入記錄儀。 要求：靈敏度高、重復(fù)性好、線性范圍寬、要求：靈敏度高、重復(fù)性好、線性范圍寬、死體積小、對(duì)溫度和流量的變化不敏感死體積小、對(duì)溫度和流量的變化不敏感 紫外可見、示差折光、熒光、電化學(xué)、蒸紫外可見、示差折光、熒光、電化學(xué)、蒸發(fā)光散射、化學(xué)發(fā)光檢測器等發(fā)光散射、化學(xué)發(fā)光檢測器等2:52302:52311 1、紫外光度檢測器、紫外光度檢測器是是LCLC廣泛使用的檢測器，適用于廣泛使用的檢測器，適用于80%80%樣品樣品組成組成: :光源、流通池、記錄儀光源、流通池、記錄儀固定波長、可

29、變波長、二極管陣列三種類型。固定波長、可變波長、二極管陣列三種類型。工作原理：基于被分析試樣組分對(duì)特定波長紫外光的工作原理：基于被分析試樣組分對(duì)特定波長紫外光的選擇吸收，組分濃度與吸光度關(guān)系遵守光吸收定律。選擇吸收，組分濃度與吸光度關(guān)系遵守光吸收定律。固定波長固定波長 檢測波長一般固定在檢測波長一般固定在245nm245nm和和280nm280nm相當(dāng)于紫外光度計(jì)，為了適應(yīng)高效液相色譜儀的要求相當(dāng)于紫外光度計(jì)，為了適應(yīng)高效液相色譜儀的要求: :池體積很小池體積很小5-105-10l l，光路長，光路長5-10mm,5-10mm,結(jié)構(gòu)采用結(jié)構(gòu)采用H H型型可變波長實(shí)際就是一臺(tái)裝有流通池的紫外分光

30、光度計(jì)可變波長實(shí)際就是一臺(tái)裝有流通池的紫外分光光度計(jì)或紫外光度計(jì)。能獲得被分離組分的紫外光譜?；蜃贤夤舛扔?jì)。能獲得被分離組分的紫外光譜。2:5232紫外檢測器特點(diǎn)：紫外檢測器特點(diǎn)：1 1）靈敏度高，最小檢測濃度達(dá)）靈敏度高，最小檢測濃度達(dá)1010-10-10g/ml g/ml 2) 2) 對(duì)溫度和流速不敏感，可用于梯度洗脫對(duì)溫度和流速不敏感，可用于梯度洗脫3 3）不破壞樣品，可用于制備。）不破壞樣品，可用于制備。缺點(diǎn)：不適合于對(duì)紫外光完全不吸收的試樣、需用無紫外吸缺點(diǎn)：不適合于對(duì)紫外光完全不吸收的試樣、需用無紫外吸收的溶劑作流動(dòng)相。收的溶劑作流動(dòng)相。332:52光電二極管陣列檢測器光電二極管陣

31、列檢測器檢測元件：檢測元件： 光電二極陣列，陣列由一系列光電二極管組光電二極陣列，陣列由一系列光電二極管組成，每一個(gè)二極管寬成，每一個(gè)二極管寬5050umum，各自測一窄段光譜，各自測一窄段光譜。 普通紫外普通紫外- -可見檢測器：光源發(fā)出的光經(jīng)單色器分光，只可見檢測器：光源發(fā)出的光經(jīng)單色器分光，只讓特定波長的光進(jìn)入流動(dòng)池讓特定波長的光進(jìn)入流動(dòng)池 二極管陣列檢測器：先讓所有波長的光通過流通池，然后二極管陣列檢測器：先讓所有波長的光通過流通池，然后通過一系列分光技術(shù)，使所有波長的光在檢測器上被檢測，通過一系列分光技術(shù)，使所有波長的光在檢測器上被檢測，以實(shí)際時(shí)間瞬時(shí)檢測在所有波長上的吸光度，得到三

32、維色以實(shí)際時(shí)間瞬時(shí)檢測在所有波長上的吸光度，得到三維色譜譜- -光譜圖，便于定性。光譜圖，便于定性。 二極管陣列檢測器優(yōu)點(diǎn)：二極管陣列檢測器優(yōu)點(diǎn)： 掃描速度快，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好，靈敏度高適用于痕量分掃描速度快，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好，靈敏度高適用于痕量分析析 可獲得三維色譜可獲得三維色譜光譜圖。光譜圖。 2:52342:52352 2、熒光檢測器、熒光檢測器原理：待測物吸收一定波長的紫外光后發(fā)射出原理：待測物吸收一定波長的紫外光后發(fā)射出熒光，在一定條件下熒光強(qiáng)度與濃度成正比，通熒光，在一定條件下熒光強(qiáng)度與濃度成正比，通過測量熒光強(qiáng)度來確定待測物濃度。實(shí)際上是將過測量熒光強(qiáng)度來確定待測物濃度。實(shí)際上是將帶有流

33、通池的熒光分光光度計(jì)或熒光光度計(jì)作為帶有流通池的熒光分光光度計(jì)或熒光光度計(jì)作為HPLCHPLC的檢測器的檢測器 選擇性檢測器，用于本身能夠發(fā)射熒光的物選擇性檢測器，用于本身能夠發(fā)射熒光的物質(zhì)或其衍生物能發(fā)射熒光的物質(zhì)。質(zhì)或其衍生物能發(fā)射熒光的物質(zhì)。 靈敏度高，靈敏度高，1010-13-13g g，比紫外吸收檢測器約高，比紫外吸收檢測器約高二個(gè)數(shù)量級(jí)，適合于痕量分析。二個(gè)數(shù)量級(jí)，適合于痕量分析。2:52362:52373 3、示差折光檢測器、示差折光檢測器通過連續(xù)測定流通池中純流動(dòng)相和含有被測組分通過連續(xù)測定流通池中純流動(dòng)相和含有被測組分的流動(dòng)相之間折光率的差別，根據(jù)不同物質(zhì)具有不的流動(dòng)相之間折

34、光率的差別，根據(jù)不同物質(zhì)具有不同折光率進(jìn)行組分檢測。同折光率進(jìn)行組分檢測。 只要組分折光率與流動(dòng)相折光率不同就能用示只要組分折光率與流動(dòng)相折光率不同就能用示差折光檢測器進(jìn)行檢測。對(duì)沒有紫外吸收的物質(zhì)如差折光檢測器進(jìn)行檢測。對(duì)沒有紫外吸收的物質(zhì)如高分子化合物、糖類、脂肪烷烴都能檢測。高分子化合物、糖類、脂肪烷烴都能檢測。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 通用性好，可檢測的化合物范圍廣，尤其在尺通用性好，可檢測的化合物范圍廣，尤其在尺寸排阻色譜中用很多。寸排阻色譜中用很多。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：最小檢測濃度最小檢測濃度10-7g/ml,靈敏度不高，對(duì)溫度變化靈敏度不高，對(duì)溫度變化敏感，不能用于梯度洗脫敏感，不能用于梯度洗脫 2

35、:52384 4、電化學(xué)檢測器、電化學(xué)檢測器利用物質(zhì)的電學(xué)或電化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析的檢測器。利用物質(zhì)的電學(xué)或電化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析的檢測器。主要有：極譜檢測器、安培檢測器、庫倫檢測器和主要有：極譜檢測器、安培檢測器、庫倫檢測器和電導(dǎo)檢測器，前三種統(tǒng)稱伏安檢測器，以測量電解電導(dǎo)檢測器，前三種統(tǒng)稱伏安檢測器，以測量電解電流為基礎(chǔ)。電流為基礎(chǔ)。電導(dǎo)檢測器：直接測量色譜柱后流出液的電導(dǎo)變化電導(dǎo)檢測器：直接測量色譜柱后流出液的電導(dǎo)變化來計(jì)算物質(zhì)的含量。來計(jì)算物質(zhì)的含量。 電導(dǎo)檢測器響應(yīng)受溫度影響較大，因此要求嚴(yán)格電導(dǎo)檢測器響應(yīng)受溫度影響較大，因此要求嚴(yán)格控溫。一般在電導(dǎo)池中放置熱敏電阻器進(jìn)行監(jiān)測。控溫。一般在電

36、導(dǎo)池中放置熱敏電阻器進(jìn)行監(jiān)測。HPLCHPLC分析條件的選擇分析條件的選擇 1 1分離類型的選擇分離類型的選擇 樣品性質(zhì)（相對(duì)分子量、在水中和有機(jī)溶劑中的溶樣品性質(zhì)（相對(duì)分子量、在水中和有機(jī)溶劑中的溶解度、極性和穩(wěn)定性、化學(xué)結(jié)構(gòu)）解度、極性和穩(wěn)定性、化學(xué)結(jié)構(gòu)） 相對(duì)分子量較低，易揮發(fā)而且受熱又不分解的化合相對(duì)分子量較低，易揮發(fā)而且受熱又不分解的化合物，可用氣相色譜法分離。物，可用氣相色譜法分離。 相對(duì)分子量為相對(duì)分子量為200-2000200-2000的樣品，適用于標(biāo)準(zhǔn)的液的樣品，適用于標(biāo)準(zhǔn)的液相色譜（液液、液固、離子交換色譜等）。相色譜（液液、液固、離子交換色譜等）。 相對(duì)分子量大于相對(duì)分子

37、量大于20002000的宜采用尺寸排阻色譜法。的宜采用尺寸排阻色譜法。 2:52392:5240液相色譜分離類型選擇參考表 溶于水排阻色譜，水為流動(dòng)相 相對(duì)分子質(zhì)量 2000 不溶于水排阻色譜，非水流動(dòng)相 同系物分配色譜 不溶于水 異構(gòu)體吸附色譜樣品 分子大小差異大排阻色譜 反相液-液色譜 相對(duì)分子質(zhì)量 溶于水，不離解 2000 排阻色譜，水為流動(dòng)相 堿陽離子交換色譜 溶于水，可離解 酸陰離子交換色譜 溶于水， 離子與非離子反相離子對(duì)色譜 2:52412固定相的選擇固定相的選擇 分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物 分離非極性和極性較弱的化合物分離非極性和極性較弱的化合

38、物 極性鍵合相極性鍵合相 非極性鍵合相非極性鍵合相 3 3流動(dòng)相的選擇流動(dòng)相的選擇 試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適當(dāng)?shù)娜芙舛?，要能試樣在流?dòng)相中應(yīng)有適當(dāng)?shù)娜芙舛?，要能夠溶于流?dòng)相中，防止在柱子中發(fā)生沉淀。夠溶于流動(dòng)相中，防止在柱子中發(fā)生沉淀。流動(dòng)相不能影響試樣的檢測。流動(dòng)相不能影響試樣的檢測。 盡量使用高純度試劑，避免流動(dòng)與固定相盡量使用高純度試劑，避免流動(dòng)與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損害柱子，流動(dòng)發(fā)生作用而使柱效下降或損害柱子，流動(dòng)相粘度較小。相粘度較小。2:5242高效液相色譜法在職業(yè)衛(wèi)生檢測中的應(yīng)用2:5243檢測物質(zhì)：多環(huán)芳烴、酚類化合物、脂肪族醛檢測物質(zhì)：多環(huán)芳烴、酚類化合物、脂肪族醛類化合

39、物等類化合物等2:5244五氯酚及其鈉鹽的高效液相色譜法五氯酚及其鈉鹽的高效液相色譜法1原理原理 空氣中中五氯酚及五氯酚鈉鹽用微孔濾膜和乙空氣中中五氯酚及五氯酚鈉鹽用微孔濾膜和乙二醇吸收液串聯(lián)采樣，經(jīng)二醇吸收液串聯(lián)采樣，經(jīng)C18柱分離，紫外檢測器柱分離，紫外檢測器檢測，保留時(shí)間定性，峰高或峰面積定量。檢測，保留時(shí)間定性，峰高或峰面積定量。2 儀器儀器2.1大型氣泡吸收管。大型氣泡吸收管。2.2微孔濾膜：孔徑微孔濾膜：孔徑0.8m。2.3塑料采樣夾：濾膜直徑塑料采樣夾：濾膜直徑25mm。2.4空氣采樣器：空氣采樣器：01.5L/min。2.5具塞試管：具塞試管：10ml。2:5245 2.6高效

40、液相色譜儀，紫外檢測器，波長高效液相色譜儀，紫外檢測器，波長300nm；儀器操作條件儀器操作條件色譜柱：色譜柱：250mm4.6mm，5 m ， C18；柱柱溫：室溫；溫：室溫；流動(dòng)相：乙腈流動(dòng)相：乙腈:0.01mol/L磷酸溶液磷酸溶液80:20；流流 量：量：1.5ml/min。3試劑試劑3.1吸收液：乙二醇，色譜純；吸收液：乙二醇，色譜純；3.2甲醇：色譜純；甲醇：色譜純；3.3乙腈：色譜鑒定無干擾雜峰；乙腈：色譜鑒定無干擾雜峰；3.4磷酸（優(yōu)級(jí)純）溶液：磷酸（優(yōu)級(jí)純）溶液：0.01mol/L3.5標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取50gm 五氯酚（優(yōu)級(jí)純），溶于流動(dòng)性中，五氯酚（優(yōu)級(jí)

41、純），溶于流動(dòng)性中，定容至定容至10.0ml 容量瓶中，此溶液為容量瓶中，此溶液為5.0mg/ml五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。或用國家認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制?；蛴脟艺J(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。2:5246 4 樣品的采集、運(yùn)輸和保存樣品的采集、運(yùn)輸和保存現(xiàn)場采樣按照現(xiàn)場采樣按照GBZ 159執(zhí)行。執(zhí)行。4.1 短時(shí)間采樣：在采樣點(diǎn)，將塑料采樣夾（在前）和大短時(shí)間采樣：在采樣點(diǎn)，將塑料采樣夾（在前）和大型氣泡吸收管（內(nèi)裝型氣泡吸收管（內(nèi)裝5.0ml吸收液，在后），以吸收液，在后），以1L/min 流量采集流量采集15min 空氣樣品?？諝鈽悠?。4.2 長時(shí)間采樣：在采樣點(diǎn)，將塑料采樣夾（在前）和大長時(shí)間采樣：在采樣點(diǎn)，將塑料采樣夾（在前）和大型氣泡吸收管（內(nèi)裝型氣泡吸收管（內(nèi)裝5.0ml吸收液，在后），以吸收液，在后），以0.51L/min 流量采集流量采集28h 空氣樣品?？諝鈽悠?。 采樣后，立刻將微孔濾膜放入大型氣泡