第七章蛋白質(zhì)的分離純化與表征ppt課件

1、艾永興艾永興動物生物技術(shù)系動物生物技術(shù)系吉林大學畜牧獸醫(yī)學院吉林大學畜牧獸醫(yī)學院:yongxingai163Cellogo主要內(nèi)容：主要內(nèi)容： 蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)的性質(zhì)(酸堿性質(zhì)、分子大小與形狀、酸堿性質(zhì)、分子大小與形狀、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)沉淀 )、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)分離純化的原則與方法和蛋白質(zhì)含量與純分離純化的原則與方法和蛋白質(zhì)含量與純度測定方法。度測定方法。Logo分離蛋白質(zhì)的目的分離蛋白質(zhì)的目的 許多蛋白質(zhì)的研究與應(yīng)用都要獲得許多蛋白質(zhì)的研究與應(yīng)用都要獲得純蛋白質(zhì)。如研究蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、組成和某些物理純蛋白質(zhì)。如研究蛋白質(zhì)的分子結(jié)

2、構(gòu)、組成和某些物理化學性質(zhì)，需要純的、均一的甚至是結(jié)晶的蛋白質(zhì)樣品?；瘜W性質(zhì)，需要純的、均一的甚至是結(jié)晶的蛋白質(zhì)樣品。分離和純化蛋白質(zhì)方法的原理分離和純化蛋白質(zhì)方法的原理 根據(jù)蛋白質(zhì)的之間的各根據(jù)蛋白質(zhì)的之間的各種特性的差異，包括分子的大小和形狀、酸堿性質(zhì)、溶種特性的差異，包括分子的大小和形狀、酸堿性質(zhì)、溶解度、吸附性質(zhì)和對配體分子的特異生物學親和力進行解度、吸附性質(zhì)和對配體分子的特異生物學親和力進行分離。分離。Logo蛋白質(zhì)中的一些氨基酸的側(cè)鏈有可解離的基團蛋白質(zhì)中的一些氨基酸的側(cè)鏈有可解離的基團一、蛋白質(zhì)的酸堿性一、蛋白質(zhì)的酸堿性Logo蛋白質(zhì)的等電點蛋白質(zhì)的等電點 蛋白質(zhì)所帶正電荷與負電

3、荷相等即凈電荷為零，蛋白質(zhì)所帶正電荷與負電荷相等即凈電荷為零，蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點。稱為蛋白質(zhì)的等電點。一、蛋白質(zhì)的酸堿性一、蛋白質(zhì)的酸堿性Logo二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀(一一) 根據(jù)化學組成測定最低相對分子質(zhì)量根據(jù)化學組成測定最低相對分子質(zhì)量如果已知蛋白質(zhì)分子中含某種微量元素，并已知其含量，如果已知蛋白質(zhì)分子中含某種微量元素，并已知其含量，則可測定此微量元素的含量，計算出最低相對分子質(zhì)量。則可測定此微量元素的含量，計算出最低相對分子質(zhì)量。如肌紅蛋白含鐵量為如肌紅蛋白含鐵量為0.335%最低相對分子質(zhì)量最低相對分子質(zhì)量= 100= 100

4、=16 700血紅蛋白與肌紅蛋白一樣，但用其它方法得血紅蛋白與肌紅蛋白一樣，但用其它方法得Mr是是68000，所以血紅蛋白中含有所以血紅蛋白中含有4個鐵。個鐵。 鐵的原子量鐵的原子量 55.8鐵的百分含量鐵的百分含量 0.335Logo二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀(二二) 根據(jù)滲透壓法測定相對分子質(zhì)量根據(jù)滲透壓法測定相對分子質(zhì)量當?shù)鞍踪|(zhì)分子處于等點時測定的滲透壓才不受緩沖當?shù)鞍踪|(zhì)分子處于等點時測定的滲透壓才不受緩沖液中無機離子的影響。液中無機離子的影響。(范托夫公式范托夫公式)0limrccRTMR：氣體常數(shù)：氣體常數(shù)8.314J/(Kmol)）T：絕對溫度：絕對溫度K

5、）：滲透壓：滲透壓N/m2，即，即Pa）Mr：相對分子量或摩爾質(zhì)量：相對分子量或摩爾質(zhì)量g/mol）Logo二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀(三三) 蛋白質(zhì)的擴散和擴散系數(shù)蛋白質(zhì)的擴散和擴散系數(shù)平移擴散：由于濃度差引起的溶質(zhì)分子的凈遷移稱為平移擴散平移擴散：由于濃度差引起的溶質(zhì)分子的凈遷移稱為平移擴散擴散系數(shù)：當濃度梯度為一個單位時，在一秒鐘內(nèi)通過擴散系數(shù)：當濃度梯度為一個單位時，在一秒鐘內(nèi)通過1cm2面面積所擴散的溶質(zhì)的量。積所擴散的溶質(zhì)的量。蛋白質(zhì)的擴散系數(shù)與分子大小和形狀及溶劑的粘度有關(guān)。蛋白質(zhì)的擴散系數(shù)與分子大小和形狀及溶劑的粘度有關(guān)。擴散過程受到蛋白質(zhì)分子與溶劑間

6、的內(nèi)磨擦阻力所反抗，這種阻擴散過程受到蛋白質(zhì)分子與溶劑間的內(nèi)磨擦阻力所反抗，這種阻力大小不僅取決于蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量，并且還強力地取決于它的力大小不僅取決于蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量，并且還強力地取決于它的顆粒形狀。顆粒形狀。菲克擴散定律：菲克擴散定律：222 1241xxDtcceLogo(四四) 沉降分折法測定相對分子質(zhì)量沉降分折法測定相對分子質(zhì)量1.沉降速度法沉降速度法(斯維得貝格方程斯維得貝格方程)2.沉降平衡法沉降平衡法二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀(1)rRTsMDvR：氣體常數(shù)：氣體常數(shù)8.314J/(Kmol)）T：絕對溫度：絕對溫度K）s：沉降系數(shù)：沉降系數(shù)s）D：

7、蛋白質(zhì)擴散系數(shù)：蛋白質(zhì)擴散系數(shù)cm2/s）v:偏微比容蛋白質(zhì)溶于水時為偏微比容蛋白質(zhì)溶于水時為0.74cm3/g）：溶劑密度：溶劑密度21222212ln(/ )(1)()rRTdc cMvxx (五五)凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量應(yīng)用標準蛋白洗脫速度制作標準曲線進行比算。應(yīng)用標準蛋白洗脫速度制作標準曲線進行比算。s：單位離心場的沉降速度。：單位離心場的沉降速度。1 10-13 200 10-13秒秒把把10-13秒作為一個單位，秒作為一個單位，斯維得貝格單位斯維得貝格單位Svedberg unit）LogoLogo(五五) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳

8、SDS-PAGE） SDS十二烷基硫酸鈉是一種陰離子去污劑，帶有十二烷基硫酸鈉是一種陰離子去污劑，帶有很多負電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合以后，蛋白質(zhì)分子帶有足很多負電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合以后，蛋白質(zhì)分子帶有足夠的負電荷，遠遠超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷，蛋夠的負電荷，遠遠超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷，蛋白質(zhì)分子原有的電荷就變得無足輕重了，所以在電場白質(zhì)分子原有的電荷就變得無足輕重了，所以在電場上移動的速度完全取決于蛋白質(zhì)分子的大小。上移動的速度完全取決于蛋白質(zhì)分子的大小。SDS可可將蛋白質(zhì)解離成亞基，所以測出的分子量是亞基的分將蛋白質(zhì)解離成亞基，所以測出的分子量是亞基的分子量子量 。1.4克克SDS/1克蛋白質(zhì)

9、。不同的蛋白質(zhì)的克蛋白質(zhì)。不同的蛋白質(zhì)的SDS復復合體具有幾乎相同的荷質(zhì)比。合體具有幾乎相同的荷質(zhì)比。二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀Logo(五五) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE）二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀Logo(一一) 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)穩(wěn)定膠體具備穩(wěn)定膠體具備3個條件：個條件： 1.分散相質(zhì)點大小在分散相質(zhì)點大小在1100nm范圍，這在動力學上是穩(wěn)定范圍，這在動力學上是穩(wěn)定的，可不斷作布朗運動。的，可不斷作布朗運動。 2.分散相質(zhì)點帶有同種電荷，互相排斥，不易聚集形成大分散相質(zhì)點帶有同種電荷，互

10、相排斥，不易聚集形成大顆粒而沉淀。顆粒而沉淀。 3.分散相能與溶劑形成溶劑化層，這樣質(zhì)點相互不易靠攏分散相能與溶劑形成溶劑化層，這樣質(zhì)點相互不易靠攏而聚集。而聚集。三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀Logo(二二) 蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性與質(zhì)點大小、電荷和水化有關(guān)。蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性與質(zhì)點大小、電荷和水化有關(guān)。（1鹽析法：硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等。通常不引起蛋白鹽析法：硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等。通常不引起蛋白質(zhì)變性，質(zhì)變性，去鹽即可溶解。去鹽即可溶解。 (2)有機溶劑沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等。有機溶劑沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等。 (3)重金屬鹽沉

11、淀法：重金屬鹽沉淀法：pHpI時時,蛋白質(zhì)帶負電荷，能與重金蛋白質(zhì)帶負電荷，能與重金屬離子作用而變性。屬離子作用而變性。如如Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+等）等） (4)生物堿試劑和某些酸類沉淀法：生物堿試劑和某些酸類沉淀法：pHpI時，蛋白質(zhì)帶正電時，蛋白質(zhì)帶正電荷，能與生物堿和酸根負離子作用生成不溶性鹽，鞣酸、苦荷，能與生物堿和酸根負離子作用生成不溶性鹽，鞣酸、苦味酸、鎢酸、味酸、鎢酸、KI；三氯醋酸、磺基水楊酸和硝酸等。；三氯醋酸、磺基水楊酸和硝酸等。 (5)加熱變性沉淀：加熱變性沉淀：三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀Logo（1 1前處理：細胞

12、破碎，有機械方法如高速組織搗碎器、玻璃勻漿器、在研前處理：細胞破碎，有機械方法如高速組織搗碎器、玻璃勻漿器、在研缽中或球磨機上磨等。還有超聲法、反復凍融法、自溶等方法。缽中或球磨機上磨等。還有超聲法、反復凍融法、自溶等方法。 (2) (2)粗分離：鹽析、等電點沉淀有機溶劑法分離，用粗分離：鹽析、等電點沉淀有機溶劑法分離，用PEGPEG濃縮。濃縮。 (3) (3)細分離：電泳、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析、吸附層析等細分離：電泳、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析、吸附層析等 (4) (4)蛋白質(zhì)結(jié)晶：蛋白質(zhì)溶液略過飽和。蛋白質(zhì)結(jié)晶：蛋白質(zhì)溶液略過飽和。四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則四、蛋白質(zhì)分

13、離純化的一般原則Logo一般是根據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小、溶解度、電荷、吸附性質(zhì)和與配體分子的生物一般是根據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小、溶解度、電荷、吸附性質(zhì)和與配體分子的生物學親和力等。學親和力等。( (一一) ) 根據(jù)分子大小不同的純化方法根據(jù)分子大小不同的純化方法1.1.透析和超過濾透析和超過濾2.2.密度梯度密度梯度( (區(qū)帶區(qū)帶) )離心離心3.3.凝膠過濾凝膠過濾(1)(1)凝膠過濾的介質(zhì)凝膠過濾的介質(zhì)(2)(2)凝膠過濾的原理凝膠過濾的原理五、蛋白質(zhì)的分離純化方法五、蛋白質(zhì)的分離純化方法Logo(一一) 根據(jù)分子大小不同的純化方法根據(jù)分子大小不同的純化方法1.透析和超過濾透析和超過濾五、蛋白質(zhì)的

14、分離純化方法五、蛋白質(zhì)的分離純化方法切向流過濾切向流過濾Logo(一一) 根據(jù)分子大小不同的純化方法根據(jù)分子大小不同的純化方法1.透析和超過濾透析和超過濾五、蛋白質(zhì)的分離純化方法五、蛋白質(zhì)的分離純化方法Logo(一一) 根據(jù)分子大小不同的純化方法根據(jù)分子大小不同的純化方法2.密度梯度離心密度梯度離心常用氯化銫、蔗糖、聚蔗糖常用氯化銫、蔗糖、聚蔗糖Ficoll）、）、 (Ficoll)-泛影葡胺泛影葡胺(Urografin等等五、蛋白質(zhì)的分離純化方法五、蛋白質(zhì)的分離純化方法Logo(一一) 根據(jù)分子大小不同的純化方法根據(jù)分子大小不同的純化方法3.凝膠過濾凝膠過濾常用常用Sephadex、聚丙烯酰

15、胺凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖等，凝膠的粒度與洗脫流速瓊脂糖等，凝膠的粒度與洗脫流速和分辨率有關(guān)，粒度常用篩眼數(shù)或和分辨率有關(guān)，粒度常用篩眼數(shù)或目數(shù)或珠直徑。目數(shù)或珠直徑。五、蛋白質(zhì)的分離純化方法五、蛋白質(zhì)的分離純化方法凝膠柱床總體積凝膠柱床總體積(Total Volume,Vt):(Total Volume,Vt):某一溶質(zhì)組分的洗脫體積某一溶質(zhì)組分的洗脫體積(Elution Volum,Ve):(Elution Volum,Ve):自加自加樣品開始到該組分的洗脫峰峰頂或洗脫峰上升邊樣品開始到該組分的洗脫峰峰頂或洗脫峰上升邊緣的半高點出現(xiàn)時所流出的體積。緣的半高點出現(xiàn)時所流出的體積。孔隙體積

16、孔隙體積(Void volume)(Void volume)或外體積或外體積(outer volume(outer volume，Vo)Vo)或外水體積：存在于柱床中凝膠珠外孔隙的水相或外水體積：存在于柱床中凝膠珠外孔隙的水相體積。用藍色葡聚糖體積。用藍色葡聚糖20002000檢測。檢測。內(nèi)體積內(nèi)體積(inner volume,Vi)(inner volume,Vi)或內(nèi)水體積：凝膠珠內(nèi)部或內(nèi)水體積：凝膠珠內(nèi)部的水相體積。用小分子的的水相體積。用小分子的Ve-VoVe-Vo。凝膠基質(zhì)體積凝膠基質(zhì)體積(matrix volume(matrix volume，Vm)Vm)Logo(一一) 根據(jù)分子

17、大小不同的純化方法根據(jù)分子大小不同的純化方法3.凝膠過濾凝膠過濾五、蛋白質(zhì)的分離純化方法五、蛋白質(zhì)的分離純化方法溶質(zhì)在柱中的移動速度取決于它在溶質(zhì)在柱中的移動速度取決于它在兩相之間的分配系數(shù)兩相之間的分配系數(shù)Kd）:eodVVKVi可用分配系數(shù)可用分配系數(shù)available coefficient,Kav）:eoavtoVVKVV()()seeavavtoVV VKKV V兩種不同兩種不同Mr和不同和不同Kav值的組分洗脫體積差：值的組分洗脫體積差：完全分開兩種組分，樣品的體積不能大于完全分開兩種組分，樣品的體積不能大于VsLogo(二二) 根據(jù)溶解度差別的純化方法根據(jù)溶解度差別的純化方法1.

18、等電點沉淀和等電點沉淀和pH控制控制2.蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析3.有機溶劑分級分離法有機溶劑分級分離法4.溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響五、蛋白質(zhì)的分離純化方法五、蛋白質(zhì)的分離純化方法(三三) 根據(jù)電荷不同的純化方法根據(jù)電荷不同的純化方法1.電泳電泳(electrophoresis)2.聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)3.毛細管電泳毛細管電泳(capillary electrophoresis)4.等電聚焦等電聚焦(isoelectric focusing,IEF)5.聚焦層析聚焦層析(chromatofocusing)6.離子交換層析離子交換層析(ion-exchange column chromatography)Logo(四四) 利用選擇性吸附的純化方法利用選擇性吸附的純化方法1.羥磷灰石層析羥磷灰石層析2.疏水作用層析疏水作用層析(苯基瓊脂糖、辛基瓊脂糖苯基瓊脂糖