抗高血壓藥物對機械牽張力誘導(dǎo)的VSMCsMAPKs磷酸化、細胞增殖凋亡及甲基化的影響

1、抗高血壓藥物對機械牽張力誘導(dǎo)的VSMCMAPK瞬酸化、細胞增殖/凋亡及甲基化的影響研究目的:高血壓誘導(dǎo)的機械牽拉作用是造成血管壁結(jié)構(gòu)與功能改變即血管重構(gòu)的重要因素之一。過去人們普遍認為臨床上降壓藥物,主要是通過降低血壓進而減少機械力對管壁作用而發(fā)揮治療作用,這種作用強調(diào)了藥物間接阻斷機械力對血管的作用。降壓藥物是否可以直接阻斷機械力對管壁的作用而改善血管重塑呢?未見相關(guān)報道。目前臨床上常用抗高血壓藥物有四大類,分別為受體抑制劑、離子通道阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和利尿劑等。本研究選取了臨床傳統(tǒng)上常用的利尿劑,氫氯噻嗪(Hydrochlorothiazide,HCTZ);離子通道阻滯劑,鈣離

2、子阻滯劑,硝苯地平(Nifedipine);受體抑制劑-血管緊張素受體A抑制劑,纈沙坦(Valsartan),以及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑,依那普利(Enalapril)等四種藥物作為實驗藥物,觀察這些藥物是否可以直接阻斷機械力引起的血管平滑肌細胞(vascularsmoothmusclecells,VSMCs)的作用。本課題組前期研究證實,機械牽張力(mechanicalstretchstress,SS)可以非特異性激活小鼠VSMC田胞膜上所有跨膜蛋白如離子通道、受體和其它跨膜蛋白等,同時激活下游MAPKt號傳導(dǎo)通路,改變基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達,最終導(dǎo)致細胞增殖和凋亡同時增加,從而加速血管重塑過程

3、。本研究旨在上述研究模型和成果的基礎(chǔ)上,繼續(xù)探討上述四種藥物(氫氯噻嗪、硝苯地平、纈沙坦以及依那普利)是否可以直接阻斷機械牽張力誘導(dǎo)的VSMCMAPKs舌性、細胞增殖與凋亡以及細胞內(nèi)DNA?基化白影響,以期發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)抗高血壓藥物新的作用機制(直接阻斷機械力的作用),為傳統(tǒng)的抗高血壓藥物的新降壓機制的探討提供重要的實驗資料。實驗方法:(1)利用實驗室傳統(tǒng)的貼塊培養(yǎng)法,體外分離C57BL/6J小鼠的主動脈中膜，對VSMCSS行原彳t培養(yǎng),通過倒置相差顯微鏡觀察和拍照以及隨后的進行形態(tài)學(xué)分析和鑒定,繼而用免疫熒光的方法對VSMCSI有生物標志物平滑肌a肌動蛋白(SM-a-actin)進行鑒定，確認為高

4、純度的VSMC后繼續(xù)傳代培養(yǎng),擴增細胞,用于后續(xù)實驗研究。(2)無血清細胞培養(yǎng)使得細胞同步化，處于靜息狀態(tài)下的VSMC荏分別給予氫氯噻嗪、硝苯地平、纈沙坦以及依那普利四藥預(yù)處理1h后,給予機械牽張力牽拉不同時間和強度。收集處理后的細胞蛋白用免疫印跡法檢測細胞內(nèi)ERK1/2、JNK1/2和p38磷酸化水平。設(shè)DMSOJ陰性對照組。(3)無血清細胞培養(yǎng)使得細胞同步化，處于靜息狀態(tài)下的VSMCSE分別給予氫氯曝嗪、硝苯地平、繳沙坦以及依那普利四藥預(yù)處理1h后，給予10涮械牽張力牽拉強度1h,再靜息培養(yǎng)23h。處理后的細胞用免疫熒光方法對細胞進行細胞增殖(Ki67)和細胞凋亡(TUNELffi性)以及

5、靜息細胞(DAPI核染色)同時觀察分析。設(shè)DMSO陰性對照組。(4)無血清細胞培養(yǎng)使得細胞同步化，處于靜息狀態(tài)下的VSMC荏分別給予氫氯噻嗪及硝苯地平預(yù)處理1h,給予10%機械牽張力牽拉強度1h,再靜息培養(yǎng)23h。處理后的細胞用免疫熒光方法對細胞進行DNA甲基化(5mC陽性)以及細胞核(DAPI染色)檢測和分析。設(shè)DMSOJ陰性對照組。結(jié)果:(1)組織塊培養(yǎng)7天后，小鼠主動脈中膜組織有細胞從中長出,并逐漸達融合。而后,胰酶消化分離、傳代培養(yǎng)。種植的VSMCSt呈圓形，貼壁后呈梭形，最后細胞長成“峰谷”樣特性。經(jīng)免疫熒光鑒定VSMC杷強陽性表達平滑肌特異性抗原SM-a-actin,陽性細胞數(shù)大于

6、90%（2）與加入DMSOJ陰性對照組相比，氫氯曝嗪或硝苯地平對靜息培養(yǎng)的VSMC的ERK1/2、JNK1/2、p38的磷酸化無影響，但對機械力牽拉引起的MAPK#酸化影響不同。機械力可激活MAPKE成員，硝苯地平可直接抑制機械力誘導(dǎo)的MAPKE成員的激活，與硝苯地平作用相反，氫氯嚷嗪可進一步協(xié)同促進機械力誘導(dǎo)的MAPK勺激活，而繳沙坦以及依那普利與硝苯地平作用相同。（3）同樣，與加入DMSOJ陰性對照組相比，氫氯曝嗪或硝苯地平對靜息培養(yǎng)的VSMCS勺增殖和凋亡無影響，但對機械力牽拉引起的細胞增殖和凋亡同時增加的影響不同。機械力可誘導(dǎo)細胞增殖和凋亡同時增加,硝苯地平可直接抑制機械力誘導(dǎo)的細胞增

7、殖和凋亡同時增加,與硝苯地平作用相反,氫氯噻嗪可進一步協(xié)同促進機械力誘導(dǎo)的細胞增殖和凋亡同時增加。（4）DMSO的陰性對照組細胞甲基化水平較高，氫氯嚷嗪對靜息細胞甲基化水平無影響，與DMSO1相近，但硝苯地平可少量減少靜息培養(yǎng)的VSMCS勺甲基化。機械力牽拉引起的細胞甲基化明顯減少,硝苯地平可抑制機械力誘導(dǎo)引起的甲基化減少，氫氯嚷嗪也可阻斷機械力誘導(dǎo)的甲基化減少達到與DMSO!性組相近的高度。（5）與DMSO1相比，繳沙坦和依那普利并不引起靜息細胞的MAPK磷酸化變化，而機械力可誘導(dǎo)VSMCERKf口P38MAp瞬酸化增加，這種增加可分別被纈沙坦和依那普利濃度依賴性抑制。結(jié)論:（1）機械力可誘導(dǎo)靜息培養(yǎng)的VSMC的ERK1/2、JNK1/2、p38的磷酸化增加,氫氯噻嗪起到協(xié)同促進作用,而硝苯地平與氫氯噻嗪作用相反,呈現(xiàn)抑制作用。纈沙坦以及依那普利與硝苯地平作用相同,呈現(xiàn)濃度依賴性抑制。(2)機械力可引起VSMC4曾殖與凋亡同時增加，氫氯嚷嗪起到協(xié)同促進作用,而硝苯地平與氫氯嚷嗪作用相反，呈現(xiàn)抑制作用。(3)機械力可引起VSMCSP基化減少,氫氯