細(xì)胞劃痕實驗

1、細(xì)胞劃痕實驗很多戰(zhàn)友肯定現(xiàn)在都做過關(guān)于細(xì)胞遷移的實驗。其中劃痕法以其材料廉價，操作簡單而多年來一直深受大家的歡迎。我這里介紹一下我自己的操作過程和結(jié)果圖。希望能給新來的戰(zhàn)友們以幫助。材料：6 孔板（其他的也可以，但感覺 6 孔比較好，大小適中） marker 筆直尺20 微升槍頭（滅菌） 無血清培養(yǎng)基PBS準(zhǔn)備：所有能滅菌的器械都要滅菌，直尺和 marker 筆在操作前紫外照射 30min （超凈臺內(nèi)） 流程：1。 先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻得劃橫線，大約每隔0.51cm 道，橫 穿過孔。每孔至少穿過 5 條線。2。在空中加入約 5X105 個細(xì)胞，具體數(shù)量因細(xì)胞不同而不

2、同，掌握為過夜能鋪滿。3。第二天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。4。用 PBS 洗細(xì)胞 3 次，去處劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。5。放入 37度 5%co2 培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按 0， 6， 12， 24小時取樣，拍照。96 孔板，可以同時我們一般使用共聚5 條定位線，與劃痕樓主的照片很漂亮但是用六孔板我覺得有些浪費，我們實驗室常用的是 做很多平行復(fù)孔。 不知你照片拍完了之后用什么軟件統(tǒng)計劃痕的寬度呢， 焦顯微鏡自帶的軟件。你能把統(tǒng)計方法介紹一下嗎？ 老實說，我們實驗室沒有什么好的軟件。所以一般只作定性，不作定量。 如果樓上有好的軟件能否共享一下，不勝感謝。6 空

3、板可以保證有相當(dāng)距離的平直劃痕，我覺得挺不錯的。而且因為有 相交，這樣就有 1 0個可固定監(jiān)測點，不作重復(fù)，誤差也很小。細(xì)胞遷移實驗是做什么研究的啊，不是很懂 感謝，學(xué)到寶貴經(jīng)驗！ 謝謝樓主，照片很漂亮，實驗步驟也很清楚。需要提醒樓主的是：如果你連續(xù)監(jiān)測 24 小時，你需要考慮到劃痕縮小是細(xì)胞遷移和細(xì)胞繁 殖共同作用的結(jié)果， 而不是單純的細(xì)胞遷移。 如果你要單純的考慮細(xì)胞遷移， 你可以先用絲 裂霉素處理一小時，抑制細(xì)胞的分裂，這樣你的結(jié)果就是細(xì)胞遷移的作用了。照片拍完之后，可以用 image J 來測量劃痕區(qū)域的像素定量比較細(xì)胞遷移的速度。 恩,學(xué)習(xí)了不少 ,tacthgin wrote:謝謝

4、樓主，照片很漂亮，實驗步驟也很清楚。需要提醒樓主的是：如果你連續(xù)監(jiān)測 24 小時，你需要考慮到劃痕縮小是細(xì)胞遷移和細(xì)胞繁 殖共同作用的結(jié)果， 而不是單純的細(xì)胞遷移。 如果你要單純的考慮細(xì)胞遷移， 你可以先用絲 裂霉素處理一小時，抑制細(xì)胞的分裂，這樣你的結(jié)果就是細(xì)胞遷移的作用了。照片拍完之后，可以用 image J 來測量劃痕區(qū)域的像素定量比較細(xì)胞遷移的速度。謝謝。無血清的話，應(yīng)該一個細(xì)胞周期內(nèi)，增殖可以忽略吧。而且我定點監(jiān)測的話，差不多 可以對應(yīng)到每個細(xì)胞。 好像沒有看見很明顯的增殖現(xiàn)象。 絲裂霉素貌似很貴的說。 。如果用 這個還不如直接用 transwell 呢。另， image J 哪里有

5、下載么？謝謝。ImageJ 下載網(wǎng)址： /ij/download.html無血清培養(yǎng)， 確實細(xì)胞增殖可以忽略了， 不過由于細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)整體性的下調(diào)節(jié)， 細(xì) 胞遷移的速度也會慢很多。 不知道是不是大多數(shù)文獻(xiàn)都用無血清培養(yǎng)狀態(tài)下作劃痕實驗?zāi)兀?你這不是 “又叫馬兒跑，又叫馬兒不吃草么 “。呵呵tacthgin wrote:ImageJ 下載網(wǎng)址： /ij/download.html無血清培養(yǎng)， 確實細(xì)胞增殖可以忽略了， 不過由于細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)整體性的下調(diào)節(jié)， 細(xì) 胞遷移的速度也會慢很多。 不知道是不是大多數(shù)文

6、獻(xiàn)都用無血清培養(yǎng)狀態(tài)下作劃痕實驗?zāi)兀?你這不是 “又叫馬兒跑，又叫馬兒不吃草么 “。呵呵謝謝， tacthgin 戰(zhàn)友的提醒，確實存在這個問題。所以目前最好的方法還是 transwell 法。 一般做劃痕實驗，都是無血清或者低血清（ 2% ）否則細(xì)胞增殖就不能忽略。一般認(rèn)為細(xì)胞 周期是 24 小時，但對于一些特殊的細(xì)胞系來說，生長可能會快一點。因此好像還沒看見用 帶血清培養(yǎng)，短時間檢測的。不過我會去試試看?？赡苁莻€好方法。 劃痕法的意義在于，價格低廉，操作簡單。還有很重要的一點在于細(xì)胞外圍環(huán)境簡單單純， 容易控制。（比如做加藥的，可能會和血清的組分有反映，而且受血清批次的影響，造成誤 差。如果

7、是鋪了 ECM 物質(zhì)的，組分就更復(fù)雜了。 ） 劃痕法的不足也很明顯，適用的細(xì)胞系很窄，一般只能用于上皮，纖維樣細(xì)胞系。因為1。這些細(xì)胞本身有遷移能力，且較強。2。細(xì)胞有極性，方便測量，觀察。3。細(xì)胞對無血清有較強的忍受力 （至少 24 小時），因此很多腫瘤細(xì)胞系是不適合做劃痕的， 很多腫瘤細(xì)胞系在無血清培養(yǎng)下， 12 小時細(xì)胞凋亡就超過 50%。這也就是 transwell 發(fā)展的 最大要求。而一些上皮樣細(xì)胞系甚至可以忍受高達(dá) 72 小時的無血清實驗。足以彌合劃痕。另：在此貼出的圖片都是本人實驗數(shù)據(jù)，非將本人同意不得轉(zhuǎn)載，引用。如需要引用者，請 同本人聯(lián)系協(xié)商。一下是一種上皮樣細(xì)胞的 48 小

8、時監(jiān)測圖?？梢钥吹絼澓垡呀鼜浐稀，F(xiàn)在好多SCI雜志都不認(rèn)這個實驗了，要求做 transwell 了。這個方法無法進(jìn)行精確定量，前期做起來容易，后期數(shù)據(jù)處理比較麻煩，還得附圖，SCI雜志照片之昂貴，遠(yuǎn)超過了transwell的價格。Photoshop 6.0以前的版本有個直方圖的功能可以直接反映選擇區(qū)域的象素多少，用來做面積分析應(yīng)當(dāng)很好用，用于做劃痕修復(fù)的實驗應(yīng)當(dāng)也很好用，當(dāng)然，有更專業(yè)的Image Pro Plus的話PS就沒必要了。wuushark wrote:現(xiàn)在好多SCI雜志都不認(rèn)這個實驗了，要求做 transwell 了。這個方法無法進(jìn)行精確定量，前期做起來容易，后期數(shù)據(jù)處理比較麻煩，

9、還得附圖，SCI雜志照片之昂貴，遠(yuǎn)超過了transwell的價格。本人正打算投稿呢，其中就包括劃痕實驗，能否請 wuushark指點一下哪些SCI雜志不認(rèn)這個實驗?zāi)?我個人認(rèn)為選擇 scratch assay或者是transwell assay是根據(jù)所研究的細(xì)胞系的特點來決定 的。上皮細(xì)胞，癌細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞，在生理狀態(tài)下，形成單層或者復(fù)層上皮，當(dāng)病理狀態(tài)下，比 如創(chuàng)傷愈合，細(xì)胞遷移的時候，以側(cè)向運動為主，scratch assay很好的模擬了這種運動形式， 是很好的模型。neutrophil, monocyte/macrophage, mesenchymal stem cell,這類纟田胞在生

10、理狀態(tài)下并不形成 mo no layer,病理狀態(tài)下的細(xì)胞遷移是在細(xì)胞因子或趨化因子的影響下在基質(zhì)中縱向運動， tran swell assay模擬了這種運動形式，是適合的模型。tacthgin wrote:本人正打算投稿呢，其中就包括劃痕實驗，能否請wuushark指點一下哪些SCI雜志不認(rèn)這個實驗?zāi)?？我個人認(rèn)為選擇 scratch assay或者是transwell assay是根據(jù)所研究的細(xì)胞系的特點來決定 的。上皮細(xì)胞，癌細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞，在生理狀態(tài)下，形成單層或者復(fù)層上皮，當(dāng)病理狀態(tài)下，比 如創(chuàng)傷愈合，細(xì)胞遷移的時候，以側(cè)向運動為主，scratch assay很好的模擬了這種運動形式，

11、 是很好的模型。neutrophil, monocyte/macrophage, mesenchymal stem cell,這類纟田胞在生理狀態(tài)下并不形成 mo no layer,病理狀態(tài)下的細(xì)胞遷移是在細(xì)胞因子或趨化因子的影響下在基質(zhì)中縱向運動， tran swell assay模擬了這種運動形式，是適合的模型。非常同意，tacthgin戰(zhàn)友的思想。其實在傷口彌合中，fibroblast的向創(chuàng)口處遷移就是典型的側(cè)向爬行。 但是其實癌細(xì)胞的遷移倒不是側(cè)向爬行那么簡單， 我覺得應(yīng)該是綜合效應(yīng)， 而且 要看是什么類型的腫瘤。 因為對于遠(yuǎn)端病灶的轉(zhuǎn)移， 顯然是通過血液運輸?shù)摹?這是一個細(xì)胞 去黏附

12、和再黏附的過程。其實 transwell 也不能很好的模仿這個過程。只是 transwell matrigel 可以模仿腫瘤細(xì)胞融解基質(zhì)，侵入到正常組織的這個過程。也就是侵襲。所以對于做 cancer 的來說，可能transwell會更好些。但我覺得并不能就簡單否定scar assay。細(xì)胞的遷移作為細(xì)胞的一個正常生理活動，是表征細(xì)胞生理變化的一個重要指標(biāo)。這點是很主要的意義。僅供個人用于學(xué)習(xí)、研究；不得用于商業(yè)用途For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l