DNA測序原理和方式

1、DNA測序原理和方式DNA序列測定分手工測序和自動測序，手工測序包括Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學降解法。自動化測序事實上已成為現(xiàn)今DNA序列分析的主流。美國PEABI公司已生產出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA測序儀，其中310型是臨床檢測實驗室中利用最多的一種型號。本實驗介紹的是ABIPRISM310型DNA測序儀的測序原理和操作規(guī)程?！驹怼緼BIPRISM310型基因分析儀（即DNA測序儀），采納毛細管電泳技術取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳，應用該公司專利的四色熒光染料標記的ddNTP（標記終止物法），因此通過單引物PCR測序反映，生

2、成的PCR產物那么是相差1個堿基的3”結尾為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產物可在一根毛細管內電泳，從而幸免了泳道間遷移率不同的阻礙，大大提高了測序的精準度。由于分子大小不同，在毛細管電泳中的遷移率也不同，當其通過毛細管讀數窗口段時，激光檢測器窗口中的CCD（charge-coupleddevice）攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測，激發(fā)的熒光經光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機上同步成像，分析軟件可自動將不同熒光轉變成DNA序列，從而達到DNA測序的目的。分析結果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出

3、。它是一臺能自動灌膠、自動進樣、自動數據收集分析等全自動電腦控制的測定DNA片段的堿基順序或大小和定量的高檔精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子聚合物，包括DNA測序膠（POP6）和GeneScan月（POP4）。這些凝膠顆粒孔徑均一，幸免了配膠條件不一致對測序精度的阻礙。它要緊由毛細管電泳裝置、Macintosh電腦、彩色打印機和電泳等附件組成。電腦中那么包括資料搜集， 分析和儀器運行等軟件。 它利用最新的CCD攝影機檢測器， 使DNA測序縮短至，PCR片段大小分析和定量分析為1040min。由于該儀器具有DNA測序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可進行DNA測序、雜合子分析、單鏈構

4、象多態(tài)性分析（SSCP）、微衛(wèi)星序列分析、長片段PCR、RT-PCR（定量PCR）等分析，臨床上可除進行常規(guī)DNA測序外，還可進行單核昔酸多態(tài)性（SNP）分析、基因突變檢測、HLA配型、法醫(yī)學上的親子和個體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等?！驹噭┡c器材】1.BigDye測 序 反 應 試 劑 盒 要 緊 試 劑 是BigDyeMix,內 含PE專 利 四 色 熒 光 標 記 的ddNTP和 一 般dNTP,AmpliTaqDNApolymeraseFS,反映緩沖液等。2.pGEM-3Zf（+）雙鏈DNA對照模板L,試劑盒配套試劑。3.M13（-21）引物TGTAAAACGACGGCCAGT,g

5、mol/L，即l,試劑盒配套試劑。4. DNA測序模板能夠是PCR產物、單鏈DNA和質粒DNA等。模板濃度應調整在PCR反映時取量1從的宜。本實驗測定的質粒DNA,濃度為L,即200ng/gl。5.引物需依照所要測定的DNA片段設計正向或反向引物， 配制成gmol/L即從l。 如重組質粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13（-21）引物，T7引物等。6.滅菌去離子水或三蒸水。7.或和的PCR管蓋體分離，PE公司產品。8.3mol/L醋酸鈉稱取NaAc-3H2cm于70ml蒸儲水中，冰醋酸調pH至，定容至100ml,高壓滅菌后分裝。9.70%乙醇和無水乙醇。10.NaAc/乙醇混合液取無水乙

6、醇和3mol/LNaAc混勻，室溫可保留1年。11.POP6測序膠ABI產品。12.模板抑制試劑(TSR)ABI產品。13.10X電泳緩沖液ABI產品。14.ABIPRISM310型全自動DNA測序儀。15.2400型或9600型PCR儀。16.臺式冷凍高速離心機。17.臺式高速離心機或袖珍離心機。【操作步驟】1 .PCR測序反應(1)取的PCR管，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑：所加試劑測定模板管標準對照管BigDyeMix1gl11待測的質粒DNA1glpGEM-3Zf(+)雙鏈DNA11待測DNA的正向引物1glM13(-21)引物一1I滅菌去離子水2Rl2Ml總反應體積5

7、gl,不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。(2)將PCR管置于9600或2400型PCR儀上進行擴增。98C變性2min后進行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數為9610s,50C5s,60C4min,25個循環(huán)，擴增終止后設置4c保溫2.醋酸鈉/乙醇法純化PCR產物(1)將混合物離心，將擴增產物轉移到EP管中。加入25醋酸鈉/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10min以沉淀DNA。12000r/min于4c離心30min,警惕棄上清。(3)加70%(V/V)的乙醇50R洗滌沉淀2次。12000r/min于4c離心5min,警惕棄上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀1015min3 .電

8、泳前測序PCR產物的處理加入12R的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心。(2)將溶液轉移至蓋體分離的PCR管中，稍離心。(3)在PCR儀上進行熱變性(952min),冰中驟冷，待上機4 .上機操作按儀器操作說明書安裝毛細管，進行毛細管位置的校正，人工手動灌膠和成立運行的測序順序文件。儀器將自動灌膠至毛細管，預電泳5min,按編程順序自動進樣，再預電泳，20min）,在下電泳2h。電泳終止后儀器會自動清洗，灌膠，進下一樣品，預電泳和電泳。每一個樣品電泳總時刻為。電泳終止后儀器會自動分析或打印出彩色測序圖譜。5 .儀器將自動進行序列分析，并可根據用戶要求進行序列比較。如測序

9、序列已知，可通過序列比較以星號標出差異堿基處，提高工作效率。6 .測序完畢按儀器操作規(guī)程進行儀器清洗與保養(yǎng)?！居嬎恪繙y序反應精確度計算公式：100%差異堿基數（不包括N數）/650X100%差異堿基即測定的DNA序列與已知標準DNA序列比較不同的堿基，N為儀器不能辨讀的堿基?！咀⒁馐马椗c評價】1 .ABIPRISM310基因分析儀是高級周密儀器，需專人操作、治理和保護。2 .本實驗測序PCR反應的總體積是5gl,而且未加礦物油覆蓋，所以PCR管蓋的密封性很重要，除加完試劑后蓋緊PCR管蓋外，最好選用PE公司的PCR管。如PCR結束后PCR液小于4從l,則此CR反應可能失敗，不必進行純化和上樣。3.作為測序用戶來說，只需提供純化好的DNA樣品和引物，一個測序PCR反應使用的模板不同，需要的DNA量也就不同，PCR測序所需模板的量較少，一般PCR產物需3090ng,單鏈DNA需50100ng,雙鏈DNA需200500ng,DNA的純度一般是A260nm/A280nm為,最好用去離子水或三蒸水溶解DNA,不用TE緩沖液溶解。引物用去離子水或三蒸水配成較好。4 .本實驗使用的測序試劑盒是BigDye熒光標記終止底物循環(huán)測序試劑盒，一般可測DNA長度為650bp