G顯帶染色體脫色FISH技術在識別胃癌標記染色體中的應用

1、G顯帶染色體脫色FISH技術在識別胃癌標記染色體中的應用【摘要】目的應用一種能快速、準確識別胃癌標記染色體來源的技術，以提高對胃癌細胞復雜染色體畸變辨認的能力。方法采用改良的G顯帶染色體標本脫色后進行熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)，分別對胃癌細胞系SGC-7901的兩條標記染色體(M1和M2)和一例原發(fā)性胃癌的標記染色體(M3)進行分析。結果顯示了M1、M2和M3有復雜的染色體結構畸變：del(7)(p15)/del(7)(q22);t(1;3)(p11;q11)和del(7)(q32)。結論該方法具有信號強、背景低和重復性好等

2、優(yōu)點，在識別胃癌染色體復雜結構改變中具有重要的作用。【關鍵詞】染色體畸變；細胞遺傳學；熒光原位雜交 The application of fluorescence in situ hybridization performed on the decolorized G-banding chromosomes in detecting the marker chromosomes of gastric cancerXIA Jianchuan(Department of Pathology, Cancer Center, Sun Yat-sen University of Medical Scie

3、nce, Guangzhou, Guangdong, 510060 P. R. China. E-mail: xiajc51)ZHANG Jianhua(Health Department of Jiangxi, Nanchang, Jiangxi, 330046 P. R. China)GUAN Xinyuan(Laboratory of Cancer Genetics, National Institute of Health, National Human Genome Research Institute, USA)WANG Huiyun(Laboratory of Medical G

4、enetics, Harbin Medical University, Harbin, Heilongjiang, 150086 P. R. China)LIU Quanzhang(Laboratory of Medical Genetics, Harbin Medical University, Harbin, Heilongjiang, 150086 P. R. China)ZHANG Guiyin(Laboratory of Medical Genetics, Harbin Medical University, Harbin, Heilongjiang, 150086 P. R. Ch

5、ina)LI Pu(Laboratory of Medical Genetics, Harbin Medical University, Harbin, Heilongjiang, 150086 P. R. China)【Abstract】ObjectiveUsing a rapid, accurate method that detects the marker chromosomes of gastric cancer and enhancing the ability of discriminating complicated chromosome rearrangements of g

6、astric cancer. MethodsThe improved method of fluorescence in situ hybridization(FISH) performed on the decolorized G-banding chromosome was used. ResultsThe changes of two marker chromosomes (M1, M2) of the cell line(SGC-7901) of gastric cancer and one marker chromosomes(M3) of one primary gastric c

7、ancer were respectively analyzed by this method. The M1, M2 and M3 had complicated structural chromosome aberrations: del(7)(p15)/del(7)(q22), t(1;3)(p11;q11) and del(7)(q32). ConclusionThis method showed strong signals, low backgrounds and well-repetitions. It may play an important part in explorin

8、g the chromosome rearrangements in the process of pathogenesis and development of gastric cancer.【Key words】chromosome aberration;cytogenetics;fluorescence in situ hybridization* Project No. 39270398, supported by the National Natural Science Foundation of China熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridizat

9、ion,FISH)技術與常規(guī)的細胞遺傳學技術的有機結合，提高了人們對染色體缺失、重復、易位以及來源不清的標記染色體的識別能力。腫瘤特征性的染色體異常，通常表明癌基因和抑癌基因的位點。例如：染色體缺失，常常包括抑癌基因的丟失，而染色體易位常導致原癌基因的激活。因此，建立一種能快速、準確識別腫瘤標記染色體的方法，對探討染色體畸變在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用具有重要意義。1材料和方法1.1標本胃癌細胞系SGC-7901和原發(fā)性胃癌分別由中國醫(yī)科大學遺傳研究室和哈爾濱醫(yī)科大學附屬二院腹外科提供。1.2染色體涂染探針由美國國立衛(wèi)生院，國家人類基因組研究中心，腫瘤遺傳研究室關新元博士惠贈，探針用顯微切割獲得1。

10、1.3胃癌細胞系的染色體制備及G顯帶按常規(guī)方法復蘇胃癌細胞系，待復蘇細胞生長旺盛時收獲，并按常規(guī)法制備染色體。一部分片子在室溫下老化23 d，置-20 備用，另一部分在75 拷片2 h后，0.025%胰酶液中處理6090 s，生理鹽水漂洗，Giemsa染色35 min；對染色體分散好、G顯帶清晰者進行顯微照相。沖洗放大后，按ISCN(1995)標準進行核型分析。1.4原發(fā)性胃癌染色體直接制備及G顯帶從手術剛切除的新鮮標本上切取12 cm3的胃癌組織，置于含有RPMI-1640培養(yǎng)液(無血清)的培養(yǎng)瓶內，用眼科剪剔除非腫瘤組織及腫瘤壞死組織。將余下的腫瘤組織用37 預溫的RPMI-1640培養(yǎng)液

11、反復洗滌23次。將選取的腫瘤組織盡快剪碎。將細胞懸液及組織置于兩個離心管中，分別加入37 預溫的RPMI-1640培養(yǎng)液10 ml刻度處，加入秋水仙素，使終濃度達到1 g/ml。將標本在37恒溫水浴箱內培養(yǎng)11.5 h。離心(1500 r/min)8 min。去上清液，加入37 預溫的低滲液(0.4%氯化鉀0.4%枸櫞酸三鈉11)至10 ml，用吸管均勻吸打細胞，混勻，37 溫育1015 min。離心(1500r/min)8 min。去上清液，進行第2次低滲(時間同上)。加入12 ml新鮮的固定液(甲醇冰醋酸31)，混勻后立即離心。棄上清液，加入10 ml固定液，輕輕混勻(不可用力吹打)，室溫

12、固定1520 min后離心。棄上清液，加入12 ml固定液，常規(guī)法滴片。G顯帶和染色體分析與細胞系的相同。1.5探針的生物素標記及標記物檢測采用缺口平移法，以biotin-14-dATP標記探針(按GIBCO BRL公司提供的方法)。用0.8%瓊脂糖/TAE緩沖液凝膠電泳檢測標記產物。以DNA片段長度300500 bp為宜，如片段較大，則應補加適量的DNase 繼續(xù)酶切，直至DNA長度適中后，加5 l終止緩沖液(300 nmol/L EDTA)終止反應。1.6熒光原位雜交1.6.1標本的預處理將G顯帶標本在甲醇中脫色兩次，每次5 min，75%、85%、100%酒精脫水各2 min，室溫氣干；

13、在新鮮的固定液中(甲醇冰醋酸31)固定10 min，室溫氣干；甲醛(1% formaldehyde in 1PBS/MgCl2)再固定20 min，在1PBS液中洗3次，每次5 min，酒精系列脫水各5 min，室溫氣干。1.6.2標本變性將預處理后的標本，置70%甲酰胺/2SSC(75)中變性23 min，立即經70%、85%和100%的冰乙醇脫水各5 min，室溫干燥。1.6.3染色體涂染探針變性取2 l生物素標記的涂染探針(10 g/ml)加入Cot DNA(100 g/ml)1 l，加入7 l MM2.1(5.5 ml formamide, 1 g dextran sulfate, 0

14、.5 ml 20SSC)雜交液，在76的恒溫水浴箱內變性810 min，置37 水浴箱預復性20 min。1.6.4原位雜交將已變性或預退火的DNA探針滴于已變性并脫水的標本上，蓋上蓋玻片，rubber cement封片，放置潮濕暗盒中，在37 的恒溫箱內雜交1824 h或過液。1.6.5洗脫及免疫熒光檢測與信號放大雜交次日，將標本去掉蓋玻片，依次于4250 50%甲酰胺2SSC中洗滌4次，每次5 min，在1SSC中洗滌3次，每次5 min，然后將玻片置室溫2SSC中漂洗，加100200 l avidin-FITC(4SSC/1%BSA/0.1% Tween 20，按1200400比例稀釋)

15、于玻片上，37 溫育3060 min。取出標本后，于4250 4SSC/0.1% Tween 20中洗滌3次，每次5 min，再加100200 l anti-avidin(以上述稀釋液按1100200稀釋)于玻片上，繼續(xù)于37 溫育3060 min。取出標本后，再于4250 4SSC/0.1% Tween 20中洗滌3次，每次5 min，再加入avidin-FITC于37溫育3060 min，以放大信號，玻片洗滌同上。1.6.6染色玻片于洗滌液中取出，酒精系列脫水，每次1 min，PI/antifade復染，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡觀察結果。1.6.7顯微鏡觀察及顯微照相用Zeiss Axio

16、skop 20熒光顯微鏡觀察FISH結果，用Kodak Ektachrome 400ASA彩色負片顯微照相，信號的曝光時間為4050 s，復染顏色曝光時間48 s，依熒光強度的不同，曝光時間宜進行適當調整。2結果2.1G顯帶核型分析我們選用的胃癌細胞系SGC-7901已傳了100代以上2，生物學特性穩(wěn)定。分別對胃癌細胞系和原發(fā)性胃癌的3個G顯帶中期分裂相進行了分析。胃癌細胞系G顯帶分裂相中有1條小標記染色體(M1)和1條大標記染色體(M2)；原發(fā)性胃癌的G顯帶分裂相中有1條標記染色體(M3)。2.2FISH檢測G顯帶分析提示7號、3號染色體異常，選生物素標記的7號染色體涂染探針，對胃癌細胞系(

17、SGC-7901)G顯帶脫色的中期分裂相染色體進行FISH，證實M1為1條具有短臂和長臂缺失的7號染色體(1)；選生物素標記的3號染色體涂染探針，對胃癌細胞系SGC-7901的另一個G顯帶脫色的中期分裂相染色體進行FISH，證實M2為1號染色體長臂(M3) 和3號染色體短臂易位染色體(2)。選生物素標記的7號染色體長臂涂染探針，對原發(fā)性胃癌G顯帶脫色的中期分裂相染色體進行FISH，證實M3為具有長臂缺失的7號染色體(3)。1胃癌細胞SGC-7901 FISH(a)和G顯帶中期分裂相(b)對照分析探針：生物素標記的7號染色體。箭頭所指為3條正常的7號染色體；箭頭所指為異常7號染色體(M1)。G顯

18、帶分析表明：M1為del(7)(p15)/del(7)(q22)。2胃癌細胞系SGC-7901 FISH(a)和G顯帶中期分裂相(b)對照分析探針：生物素標記的3號染色體；箭頭指為正常的3號染色體；箭頭所指為4條異常的3號染色體，G顯帶分析表明，從上到下可見：t(1;3)(p11;q11)(M2);del(3)(q11);t(3;10)(p21;q11);t(3;5)(q11;p11)。3原發(fā)性胃癌FISH(a)和G顯帶中期分裂相(b)對照分析探針：生物素標記7號長臂；箭頭所為2條正常的7號染色體長臂；箭頭所指為2條異常的染色體長臂，G顯帶分析表明，從上到下可見：del(7)(q32)(M3)

19、;del(7)(q32)Fig 1The contrast analysis of FISH of biotin-labeled chromosome painting probe of 7 (a) and G-banding on metaphase spread (b) from the cell line (SGC-7901) of gastric cancer. The photograph of the metaphase spread showed three normal chromosomes 7 () and one abnormal chromosome 7 (M1)().

20、 The structural changes of the M1 by G-banding analysis involved del(7)(p15)/del(7)(q22)Fig 2The contrast analysis of FISH of biotin-labeled chromosome painting probe of 3 (a) and G-banding on metaphase spread (b) from the cell line (SGC-7901) of gastric cancer. The photograph of the metaphase sprea

21、d showed one normal chromosome 3 () and four abnormal chromosomes 3 (). The changes of the four abnormal chromosomes 3 by G-banding analysis involved t(1;3)(p11;q11)(M2), del(3)(q11),t(3;10)(p21;q11) and t(3;5)(q11;p11)Fig 3The contrast analysis of FISH of biotin-labeled chromosome painting probe of

22、 7q (a) and G-banding on metaphase spread (b) from one primary gastric cancer. The photograph of the metaphase spread showed two normal 7q () and two abnormal 7q(). The structural changes of the two abnormal 7q by G-banding analysis involved del(7)(q32)and del(7)(q32)3討論G顯帶脫色FISH技術國內外已有報道。Garson等3報道

23、的G顯帶法，雖然盡可能地避免了雜交信號的損失，但效果不夠理想。Hirai等4建立了可同時觀察到FISH雜交的熒光G帶技術，在基因組作方面顯示了良好的應用前景，卻不適合與整條染色體涂染探針的FISH同時使用。我們改良的G顯帶褪色FISH技術不僅適合染色體涂染探針，也適應于著絲粒探針，在胃癌細胞系和原發(fā)性胃癌中都獲得了良好結果，與同類技術比有信號強、背景低、重復性好的特點。直接采用FISH識別腫瘤標記染色體來源，面臨的最大的問題是探針的選擇5。如先對腫瘤的染色體標本進行G顯帶，可以了解腫瘤細胞整個染色體組的改變情況，為進一步用FISH技術檢測提供選擇適合探針的信息。然后在原來G顯帶的核型上，選擇適

24、合的探針來證實或辨認G顯帶分析過程中有疑問的、或不能確認的染色體畸變。對那些僅有部分區(qū)帶易位的異常染色體，F(xiàn)ISH的結果不能直觀地鑒別。用G顯帶標本經脫色后進行FISH的方法，既能直觀地鑒別異常染色體，又能準確地描繪染色體缺失或易位的斷裂位點。本研究中，SGC-7901細胞系中，出現(xiàn)的標記染色體(M1)，G顯帶后用生物素標記的7號染色體涂染探針進行FISH，證實是一條結構異常的7號染色體，結合G顯帶，M1為del(7)(p15)/del(7)(q22)；另一條標記染色體(M2)，G顯帶后用生物素標記的3號染色體涂染探針進行FISH，證實為1和3號染色體相互易位形成，結合G顯帶，M2為t(1;3

25、)(p11;q11)；原發(fā)性胃癌中，出現(xiàn)的標記染色體(M3)，G顯帶后用生物素標記的7號染色體長臂涂染探針進行FISH，證實有7號染色體長臂缺失，結合G顯帶，M3為del(7)(q32)。由此可見，把G顯帶技術與FISH結合起來，在用少量探針的情況下，能快速、準確地檢測腫瘤復雜染色體結構異常。顯示了該方法在識別標記染色體來源方面具有獨特的優(yōu)勢6，7。G顯帶脫色FISH技術的關鍵性步驟：常規(guī)G顯帶的染色體標本經甲醇脫色后，再經常規(guī)固定液(甲醇冰醋酸31)和含有少量的MgCl2的甲醛溶液兩次固定后再作FISH，能使經胰酶消化過的染色體標本耐受強烈的變性作用而保持良好的形態(tài)，避免靶染色體DNA的斷裂

26、丟失，在G顯帶脫色后，能防止雜交信號的損失。一般在甲醛中固定2030 min為宜，對比實驗發(fā)現(xiàn)，染色體標本的變性時間和甲醛固定呈正相關，這可能與甲醛固定后的染色體蛋白質改變影響染色體變性的時間有關。此外，染色體G顯帶后標本即時放-20 冰箱保存一年，對探針的雜交質量沒有多大影響。但通過油鏡觀察，照相后的染色體標本不可存放時間太長，過夜后的染色體標本常常影響探針的雜交質量，最有效的辦法是顯帶、染色，照相后立即褪色再做FISH。染色體玻片變性的時間至關重要，變性溫度相對低有利于染色體保持良好的形態(tài)。研究中發(fā)現(xiàn)，染色體標本的變性時間和染色體老化時間呈正相關。老化時間長的片子在相同的變性溫度(75)下

27、，可延長一些變性時間。洗脫的溫度一般不超過50。這些步驟對G顯帶標本脫色后進行FISH起著關鍵性的作用。應用該技術，不僅能通過特異性涂染探針的雜交有效地檢測結構復雜的染色體，而且通過G顯帶分析能對雜交信號進行準確的定位?；痦椖浚簢易匀豢茖W基金(39270398)作者單位：夏建川（510060廣州，中山醫(yī)科大學腫瘤防治中心腫瘤病理研究室）張建華（江西省衛(wèi)生廳）關新元（Laboratory of Cancer Genetics, National Institute of Health, National Human Genome Reasearch Institute, USA）劉權章（哈爾

28、濱醫(yī)科大學醫(yī)學遺傳研究室）張貴寅（哈爾濱醫(yī)科大學醫(yī)學遺傳研究室）李璞（哈爾濱醫(yī)科大學醫(yī)學遺傳研究室）參考文獻1，Guan XY, Paul S, Meltzer, et al.Rapid generation of whole chromosome painting probes (WCPs) by chromosome microdissection. Genomics, 1994,22101-107.2，Lin CH, Fu ZM, Liu YL, et al.The establishment of human gastric cancer cell line SGC-7901.Tumor J, 1981,11-3.林超鴻，富志民，劉亞倫，等.人體胃腺癌細胞株SGC-7901的建立.腫瘤，1981，11-3.3，Garson JA, Berghe JA, Kemshead JT, et al.Novel non-isotopic in situ hybridization technique detects small (1 kb) unique sequences in routinely G-banded human chromosomes: fine mapping of N-m