大鼠急性一氧化碳中毒后遲發(fā)性腦病模型的建立

1、大鼠急性一氧化碳中毒后遲發(fā)性腦病模型的建立    作者：趙天智，常耀明，李金聲，謝小萍 【關鍵詞】 Morris水迷宮；一氧化碳中毒；遲發(fā)性腦?。淮笫?Establishment of delayed neuropsychologic sequelae rat model after acute carbon monoxide poisoning 【Abstract】 AIM: To establish the delayed neuropsychologic sequelae rat model after acute carbon monoxide

2、(CO) poisoning for further elucidating its pathogenesis. METHODS: Male SD rats (240-280 g BW) were poisoned with CO in the animal experimental hyperbaric oxygen chamber. Cognitive ability was measured by the escape latency of searching the objective in the Morris water maze. The brains of the rats (

3、3, 7, 10, 20 d after poisoning) were taken for paraffin pathological section and HE staining to observe the pathological change in cerebral cortex and hippocampal area. RESULTS: Rats lost consciousness when they were exposed to 2000 ppm (part per million) CO for 40 min and then 3000 ppm for up to 20

4、 min. Maze test showed that the escape latency of the CO poisoned rats was significantly longer than the air exposed rats (F=4.74，P=0.047). The pathological examination revealed apparent neuronal degeneration and necrosis in the cerebral cortex and hippocampal area in CO poisoned rats. CONCLUSION: B

5、esides the evidence of pathologic results, our models basically simulate the praxiologic change induced by central nervous system damage in the patients with delayed neuropsychologic sequelae after CO poisoning. 【Keywords】 Morris water maze; carbon monoxide poisoning; delayed neuropsychologic sequel

6、ae; rats 【摘要】 目的: 建立大鼠急性一氧化碳（CO）中毒致遲發(fā)性腦病模型，以探討其發(fā)病機制. 方法: 質量240280 g雄性SD大鼠，于動物實驗高壓氧艙內(nèi)行急性CO暴露，以Morris水迷宮中搜索目標的逃避潛伏期(escape latency)來評價大鼠的認知記憶能力，并于染毒后3，7，10，20 d取腦組織，常規(guī)制備石蠟病理切片，行HE染色觀察急性CO中毒后大鼠腦皮質及海馬神經(jīng)元的病理性改變. 結果:大鼠在2000×10-6體積分數(shù)CO濃度和3000×10-6體積分數(shù)CO濃度下分別暴露40 min和20 min后全部昏迷，Morris水迷宮測試發(fā)現(xiàn)CO暴露組

7、大鼠逃避潛伏期顯著落后于空氣對照組（F=4.74，P=0.047），病理學檢查發(fā)現(xiàn)CO暴露組大鼠的皮質及海馬有明顯的神經(jīng)元變性壞死. 結論: 本實驗建立的模型基本模擬了CO中毒后遲發(fā)性腦病患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的行為學特征改變，且有相應的病理學檢測結果作為其佐證. 【關鍵詞】 Morris水迷宮；一氧化碳中毒；遲發(fā)性腦?。淮笫?【中圖號】 R595.1 0引言 一氧化碳（carbon monoxide, CO）中毒后3%30%的患者經(jīng)過一段時間的“假愈期”會出現(xiàn)以癡呆、精神癥狀和錐體外系癥狀為主遲發(fā)性腦病(delayed neuropsychologic sequelae, DNS)1. 目前其

8、發(fā)病機制仍未完全闡明，缺少可靠的動物模型是阻礙其深入研究的重要原因之一2，主要問題在于中毒濃度的掌握和動物行為學評價方法的缺陷上. 因此，我們嘗試采用急性靜態(tài)CO吸入的方法制備大鼠的DNS動物模型，并采用Morris水迷宮來評價中毒后大鼠認知記憶能力的改變，為進一步研究DNS的發(fā)病機制提供客觀有效的手段. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1CO氣體于染毒前新鮮制備. 1.1.2染毒裝置DWC4501150型（上海七零一所）動物實驗高壓氧艙，艙體為直徑0.45 m，長1 m的圓筒形，有效空間160 L，可同時對4只大鼠染毒. 1.1.3行為實驗裝置由Morris水迷宮和圖像自動監(jiān)視系統(tǒng)(Mor

9、ris Maze Experimental Assistant System, MMEAS)組成（第四軍醫(yī)大學防原教研室提供）. Morris水迷宮為內(nèi)壁黑色的不銹鋼圓柱形儲水池(d=100 cm，h=50 cm)，內(nèi)置一個高度可調位置可移動的黑色圓臺，圓臺頂部直徑為10 cm. 在水池上緣等距離設置東南西北四個標記點，以這四個入水點在水面和水桶底部的投影點，將水面和水池均分為四個象限，圓臺設置于某一象限中間. 實驗時，使水深淹沒圓臺頂部2 cm，調節(jié)水溫至2224之間. 整個實驗周期之內(nèi)室內(nèi)物品擺設和實驗人員站立位置相對固定，并嚴格控制噪聲干擾. MMEAS系統(tǒng)以圖像采集卡、攝像機、圖像監(jiān)視

10、器等為主要擴展硬件，利用圖像軟件包提供的各層次庫函數(shù)完成數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計處理. 1.1.4實驗動物封閉群健康成年雄性SpragueDawley大鼠（第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供），約910 wk齡，體質量為240280 g. 飼養(yǎng)于12 h明暗交替，室溫1823環(huán)境，喂飼標準大鼠飼料，不限食水. 1.2方法 1.2.1染毒方法參照Thom等 3報道的染毒方法及預實驗的結果，將清醒大鼠置于動物實驗高壓氧艙內(nèi)（每次最多4只）密封艙門，由進氣口加入制備的純凈CO氣體，使艙內(nèi)CO氣體濃度達到2000×10-6體積分數(shù)，維持40 min，后補加氣體達3000×10-6體積分數(shù)，約20

11、min，至大鼠出現(xiàn)昏迷時止. 1.2.2Morris水迷宮行為測試16只雄性SD大鼠適應性飼養(yǎng)1 wk后，隨機分為CO暴露組和空氣對照組，每組8只. 大鼠于CO暴露后的第二日上午10點開始行水迷宮實驗，實驗時從除站臺外的三個象限隨機選擇一個入水點，將大鼠面向池壁放入水中，每一次入水位置是假性隨機的. 觀察并記錄大鼠尋找并爬上平臺所需時間(逃避潛伏期)，如果大鼠在120 s內(nèi)未找到平臺，則人為引導大鼠到達平臺且停留30 s，這時逃避潛伏期為120 s. 實驗每隔一日進行一次，持續(xù)到染毒后21 d，每次實驗訓練3次，每個象限一次，每次間隔20 min，3次成績的平均值記為當天成績. 1.2.3病理

12、學檢查28只雄性SD大鼠適應性飼養(yǎng)1 wk后，隨機分為A，B，C，D，E 5組，其中A，B，C，D 4組為實驗組，每組5只，E組8只為空氣對照組. 實驗組按上述染毒方法予以染毒，對照組按相同步驟注入空氣. A，B，C，D 4組分別于染毒后3，7，10，20 d取腦，實驗組取腦同時取2只E組大鼠作為對照. 大鼠用20 g/L戊巴比妥鈉(60 mg/kg) 腹腔麻醉，開胸暴露心臟，插管，由左心室經(jīng)主動脈快速灌注生理鹽水200 mL, 40 g/L多聚甲醛0.1 mol/L PB液400 mL，斷頭取腦，再置于多聚甲醛PB液中浸泡24 h，根據(jù)大鼠腦定位圖譜選取冠狀切面（Bregma4.16 mm）

13、海馬與齒狀回互包平面，按常規(guī)脫水、媒染、浸蠟步驟，將組織塊包埋制成蠟塊，石蠟切片機連續(xù)切取厚5 m的切片，行HE染色.    統(tǒng)計學處理: 數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS 10.0軟件進行重復測量資料方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義. 2結果 2.1大鼠染毒表現(xiàn)2000×10-6體積分數(shù)CO氣體濃度下，前15 min大鼠表現(xiàn)活躍，有輕度的興奮和躁動，隨后的2540 min，大鼠呼吸急促，呼吸幅度明顯增大，口鼻粘膜及耳、爪、尾皮膚成櫻桃紅色，補加氣體濃度至3000×10-6體積分數(shù)時，大鼠出現(xiàn)躁狂，隨后四肢癱軟

14、無力，至60 min時大鼠全部昏迷，出艙后吸入空氣直至意識恢復.    2.2Morris水迷宮測試兩組大鼠爬上平臺的逃避潛伏期均隨學習組次的增加而縮短. 經(jīng)重復測量資料方差分析，CO暴露組大鼠逃避潛伏期落后于空氣對照組（F=4.74，P=0.047, 表1）. 表1兩組大鼠平均逃避潛伏期（略） 2.3HE染色正常對照組大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元呈圓形或橢圓形，細胞形態(tài)正常，核膜完整，核仁清晰可見，細胞核呈淡藍色（圖1A，B）. CO中毒組大鼠腦內(nèi)有廣泛的病理改變，皮質、海馬、以及齒狀回出現(xiàn)大量的神經(jīng)元變性壞死. 皮質中以頂葉及顳葉皮質損傷最為嚴重，可見點片狀壞死，

15、壞死神經(jīng)元呈三角形或多角形，細胞縮小，細胞核固縮，核仁不明顯，周圍出現(xiàn)空暈，在變性壞死的神經(jīng)元周圍可見膠質細胞浸潤（圖2A）；海馬錐體細胞層變薄，兩側細胞稀疏，CA1區(qū)和CA4區(qū)壞死明顯（圖2B）. 以上病理改變在4組腦切片中均可觀察到，以B組、C組最為明顯. D組大鼠腦切片中還可以見到壞死神經(jīng)元被吸收后所留下的龕影（圖2C），其周亦可見到膠質細胞的蹤跡. 3討論 日常生活中的CO中毒，主要是經(jīng)由呼吸道吸入引起，因此，CO中毒模型多采用吸入染毒法制備，一般可分為動式和靜式兩種. 動式吸入染毒有濃度較穩(wěn)定、可避免缺氧及二氧化碳蓄積等優(yōu)點，但該法所需儀器昂貴，CO消耗量巨大，難以普遍應用. 我們采

16、用靜式吸入法對大鼠進行染毒來制備DNS模型，CO的使用量不多，實驗室即可自行配置，且染毒艙體的體積較大可有效避免長時間染毒過程中氧分壓降低，二氧化碳分壓上升所導致缺氧對實驗結果產(chǎn)生的影響，并可同時對多只大鼠染毒. 圖1對照組大鼠組織結構HE ×400（略） 圖2大鼠組織結構改變HE ×400（略） CO中毒后DNS患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要表現(xiàn)出癡呆、記憶力受損、定向力障礙等癥狀1. 而經(jīng)典的Morris水迷宮所檢測的是大鼠在多次的訓練中，學會尋找固定位置的隱蔽平臺，形成穩(wěn)定的空間位置認知的能力. 從信息的加工和提取方式來看，這種空間參考記憶應該屬于陳述性記憶. 而臨床健忘和癡

17、呆的患者，正是陳述性記憶首先受損而且比較突出. 與過去的跳臺、避暗等檢測工具相比，Morris水迷宮主要優(yōu)點在于:能系統(tǒng)全面地考察實驗動物空間認知加工的過程，客觀地反映其認知水平；將實驗動物的學習記憶障礙和感覺、運動缺陷等分離開來，而且對動物的傷害性刺激作用較小，減少了對學習記憶過程檢測的干擾4. 所以，我們選取Morris水迷宮作為CO中毒后DNS大鼠模型的行為學評價方法. 在Morris水迷宮測試中發(fā)現(xiàn)，CO暴露組大鼠的逃避潛伏期落后于空氣對照組（F=4.74，P=0.047），提示CO暴露組大鼠出現(xiàn)了認知記憶功能的障礙. 海馬區(qū)與大腦學習記憶功能密切相關，其損傷會對這一功能產(chǎn)生嚴重影響，

18、而DNS患者臨床表現(xiàn)正是以癡呆、記憶力受損等神經(jīng)功能紊亂癥狀為主，提示海馬區(qū)神經(jīng)細胞的遲發(fā)性壞死可能是DNS發(fā)病的病理基礎. 我們復制的大鼠模型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理學檢查顯示:CO暴露后3 d，大鼠腦皮質和海馬區(qū)細胞出現(xiàn)變性和壞死，至710 d時最為嚴重，并至少持續(xù)到20 d，與Morris水迷宮行為學檢測提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)損傷的結果相符合. 臨床上DNS患者的影像學表現(xiàn)亦與本研究結果相符，如張鐳5報道在CT檢查中，海馬回病變是CO中毒遲發(fā)腦病和急性CO中毒的特異表現(xiàn)；MRI上亦可顯示皮層和海馬區(qū)出現(xiàn)異常高信號等6.綜上所述，本實驗建立的模型基本模擬了CO中毒后DNS患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的行為學特征改變，且有病理學檢測的結果為這種改變提供了佐證. 【參考文獻】 1 Piantadosi CA. Carbon monoxide poisoning J. Undersea Hyperb M