CoIP原理與方法

1、免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)原理IP是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細菌蛋白質(zhì)的“proteinA/G特異性地結(jié)合到抗體(免疫球蛋白)的FC片段的現(xiàn)象開發(fā)出來的方法。目前多用proteinA/G預先結(jié)合在argarosebeads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應后，beads上的proreinA/G就能達到吸附抗原的目的。通過低速離心，可以從含有目的抗原的溶液中將目的抗原與其它抗原分離。免疫沉淀實驗的操作步驟比較多，同時由于在非變性條件下進行實驗，所以要得到一個完美的實驗結(jié)果，不僅需要高質(zhì)量的抗體，同時對免疫沉淀體系也需要有嚴格的控制指標。免疫沉淀實驗從：蛋

2、白樣品處理；抗體-agarosebeads孵育；抗體-agarosebeads復基本實驗步驟(1)收獲細胞，加入適量細胞IP裂解緩沖液(含蛋白酶抑制劑)，冰上或者4c裂解30min,12,000g離心30min后取上清；(2)取少量裂解液以備Westernblot分析，剩余裂解液將1國相應的抗體和10-50MproteinA/G-beads加入到細胞裂解液，4C緩慢搖晃孵育過夜；(3)免疫沉淀反應后，在4C以3,000g速度離心5min,將proteinA/G-beads離心至管底；將上清小心吸去，proteinA/G-beads用1ml裂解緩沖液洗34次；最后加入15M的2XSDS加樣緩沖液

3、，沸水煮10分鐘；(4)SDS-PAGE,Westernblotting或進行質(zhì)譜分析。一、樣品處理：免疫沉淀實驗成功與否，第一步處理樣品非常關鍵。免疫沉淀實驗本質(zhì)上是處于天然構(gòu)象狀態(tài)的抗原和抗體之間的反應，而樣品處理的質(zhì)量決定了抗原抗體反應中的抗原的質(zhì)量，濃度以及抗原是否處于天然構(gòu)象狀態(tài)。所以制備高質(zhì)量的樣品以用于后續(xù)的抗體-agarosebeads孵育對免疫沉淀實驗是否成功非常關鍵。在這個環(huán)節(jié)中，除了要控制所有操作盡量在冰上或者4。完成外，最為關鍵的是裂解液的成份。用于免疫沉淀實驗的樣品一般是原代培養(yǎng)細胞裂解液或者細胞系裂解液。我們以常用的例（主要含有pH7.4左右的離子緩沖液，接近生理濃

4、度下的NaCl,一定比例的去垢劑和甘油以及各類蛋白酶抑制劑等）來說明其各主要成份的用途，進而幫助我們?nèi)绾吾槍Σ煌膶嶒災康暮筒煌牡鞍踪|(zhì)特性來選擇最佳的裂解液。a.緩沖液：離子緩沖液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。b.NaCl濃度一般習慣用150mM,這主要是因為150mM接近生理濃度，不會破壞蛋白質(zhì)之間的相互作用。然而細胞內(nèi)部的NaCl濃度并不是均一的，局部NaCl的濃度可以低到50mM,150mM的NaCl有可能會破壞這個區(qū)域的蛋白質(zhì)相互彳用。因此裂解液配方最佳的NaCl濃度要視所分析的蛋白的亞細胞定位而定。c.甘油由于其粘性，可以對蛋白質(zhì)之間的相互作用起到一個很好的保護作

5、用。一般添加10%的甘油有助于穩(wěn)定蛋白質(zhì)之間的相互作用。d.裂解液中的去垢劑可以裂解細胞質(zhì)膜，也同時破壞了許多細胞器的膜，從而釋放了其中儲存的許多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀實驗的去垢劑作用比較溫和，因此蛋白酶的活性大部分得以保存。還有一部分蛋白酶來自胞質(zhì)中，主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制環(huán)境受到改變后從而恢復了蛋白酶活性。因此，添加蛋白酶抑制劑對于防止目的蛋白的降解從而完成免疫沉淀實驗非常關鍵。一般主要通過添加EDTA抑制金屬蛋白酶，通過ProteaseCocktail（多種蛋白酶抑制劑混合物）可以抑制蛋白酶。e.去垢劑對于免疫沉淀實驗尤其是免疫共沉淀實驗是一個非常關鍵的因素。不同的去垢劑種

6、類和不同的去垢劑濃度主要通過影響以下三個因素來影響免疫沉淀效果：- 細胞質(zhì)/器膜的通透性：因為許多目的蛋白都定位在細胞器中，所以必須先將這些蛋白釋放出來，抗體才能與之反應。- 膜蛋白的釋放：許多膜蛋白的構(gòu)象對去垢劑種類和濃度非常敏感，因此針對這類蛋白的免疫沉淀實驗，需要謹慎地嘗試多種去垢劑以及不同濃度。RIPA裂解液為- 蛋白相互作用：不同去垢劑對不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)的相互作用影響程度不一樣，需要根據(jù)具體蛋白的特性進行分析選擇去垢劑種類和濃度。而由于何種去垢劑適應作用于何種蛋白質(zhì)現(xiàn)在很難精準預測，所以一個更為切實可行的辦法就是通過具體實驗篩選合適的去垢劑種類和濃度。二、抗體-agarosebead

7、s孵育裂解細胞，離心并去除不可溶的膜組份后，上清可以儲存在-80。保存3個月，但最好能夠使用新鮮制備的細胞裂解液上清去進行抗體-agarosebeads孵育實驗?？贵w可以先加入上清中與樣品孵育數(shù)小時后再加入ProteinA或者Gbeads孵育過夜，也可以同時加入抗體和ProteinA或者Gbeads孵育過夜。一般選才I1mg總蛋白（1mg/ml）對應添加1ug抗體，最高可以添加至5ug抗體，過多的抗體會產(chǎn)生假陽性。這個步驟中關鍵因素在于選擇合適的陰性對照。一般選用加同樣量的IgG，但更為妥當?shù)姆椒ㄊ沁x擇針對胞內(nèi)其它無關目的蛋白的一抗彳對照。例如，做膜蛋白A的免疫沉淀，選擇膜蛋白B來做陰性對照，

8、只要確認二者之間沒有相互作用；而做胞質(zhì)可溶性蛋白C的免疫沉淀，則選擇另外一個可溶性蛋白D來做陰性對照。同時，為避免ProteinA或者Gbeads有（非）特異性吸附從而造成免疫沉淀實驗結(jié)果的假陽性，一般在加入目的蛋白抗體之前，預先將ProteinA或者Gbeads與細胞裂解液孵育數(shù)小時，然后取上清用于后續(xù)的抗體-agarosebeads孵育。同時，ProteinA或者Gbeads對不同類型的抗體親和力不同，結(jié)合一抗的種屬和Ig亞型，選擇合適的ProteinA或者Gbeads也是決定免疫沉淀實驗成功與否的一個重要因素。一般推薦使用ProteinA和ProteinGbeads的混合物，這樣可以達到

9、最佳實驗效果，而且省去了許多選擇的煩惱。三、抗體-agarosebeads復合物洗滌：除了選擇特異性好的抗體以及選擇合適的陰性對照外， 去除免疫沉淀實驗非特異性的一個辦法是對抗體-agarosebeads復合物進行多次洗滌。一般洗滌緩沖液使用和裂解液一樣的配方，但去除甘油，以減少由于甘油的粘性帶來的非特異性吸附。針對不同的實驗要求，還可以通過更改NaCl的濃度以及去垢劑的比例，種類來達到去除非特異性吸附的效果。例如，針對單純的免疫沉淀而非免疫共沉淀實驗或者雖然是進行免疫共沉淀實驗，但蛋白質(zhì)之間的結(jié)合比較牢靠，可以考慮使用低濃度（agarosebeads復合物，這樣可以去除絕大部分非特異性相互作

10、用。四、鑒定免疫沉淀實驗用途非常廣泛（見IP：Q&A）,而且基于最基本的免疫沉淀實驗衍生出了許多免疫沉淀相關實驗手段（比如免疫共沉淀，染色質(zhì)免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀），因此，免疫沉淀實驗的鑒定方法主要視實驗目的而定。我們在本手冊中主要簡單概述常見的免疫沉淀之后的WB檢測需要注意的實驗環(huán)節(jié)。由于免疫沉淀實驗使用目的蛋白抗體加ProteinA/Gbeads與樣品孵育，因此在最后離心獲得抗體-agarosebeads復合物后，eppendorf管中主要含有抗體，目的蛋白，ProteinA/Gbeads以及一些其它非特異性作用蛋白。其中，抗體和目的蛋白以及ProteinA/Gbeads三

11、者之間是以非共價健結(jié)合在一起，只有ProteinA/G與agarosebeads是共價結(jié)合在一起的。因此，最后經(jīng)過添加含前基乙醇的加樣緩沖液以及煮沸變性并離心出去ProteinA/Gbeads后，eppendorf管只有抗體和目的蛋白以及少量非特異性吸附蛋白。這樣SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗體二種蛋白， 由于加樣緩沖液中含有疏基乙醇從而導致抗體的重鏈與輕鏈之間的二硫鍵被破壞從而使得抗體分子變成重鏈分子（55KD）和輕鏈分子（25KD）。因此，WB顯色反應中除了能檢測到目的蛋白外，如果所使用的二抗與用于免疫沉淀實驗的抗體分子屬于同一種屬的話，還能檢測到重鏈和輕鏈分子。通常用于免疫沉淀的抗

12、體量非常大（1ug）,所以當目的蛋白的大小接近重鏈或者輕鏈分子時，重鏈或者輕鏈分子的WB信號常常由于信號過強而導致影響對目的蛋白的WB結(jié)果判斷。針對上述情況，通常有二種解決辦法：a.選擇不同種屬的抗體分別進行免疫沉淀實驗和WB實驗，這樣再選擇一個種屬交叉反應比較弱或者無種屬交叉反應的二抗進行WB實驗，就可以大大減弱重鏈和輕鏈分子的WB信號。b.使用交聯(lián)劑將抗體和ProteinA/Gbeads交聯(lián)，然后通過添加不含疏基乙醇的加樣緩沖液處理目的蛋白-抗體-agarosebeads復合物，最后離心去除抗體-agarosebeads復合物，上清中只留下目的蛋白。免疫沉淀，免疫共沉淀(Co-immuno

13、precipitation,CO-IP)和染色質(zhì)免疫沉淀(Chromationimmunoprecipitation,CH免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，是確定兩種蛋白質(zhì)是否在生理條件下有相互作用的有效方法。其原理是：當細胞0.2-0.5%）的SDS洗滌抗體-在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X,那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用

14、蛋白。染色質(zhì)免疫沉淀(Chromatinimmunoprecitation,ChIP)是研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的重要工具。 它的基本原理是在生理狀態(tài)下把細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和DNA交聯(lián)在一起，超聲波將其打碎為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過所要研究的目的蛋白質(zhì)特異性抗體沉淀此復合物，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片斷進行PCR檢測，可以知道目的蛋白與那些基因作用。RNA免疫沉淀是研究體內(nèi)RNA與蛋白質(zhì)相互作用的重要手段。它的基本原理是在生理狀態(tài)下針對可以結(jié)合RNA的蛋白質(zhì)進行免疫沉淀，然后通過分離抗體-ProteinA/Gbeads復合物中的RNA成份，最后通過基因芯

15、片或者其它手段檢測目的RNA。由此可見，CO-IP和CHIP以及RIP都是基于IP的基本原理去實現(xiàn)不同的研究目的，CO-IP主要是研究目的蛋白X和與之發(fā)生相互作用的蛋白Y之間的作用關系；而CHIP主要是研究目的蛋白X和與之發(fā)生相互作用的DNA片段Y之間的作用關系；RIP主要是研究RNA結(jié)合蛋白和RNA之間的結(jié)合。這也就決定了在進行IP,CO-IP和CHIP以及RIP實驗時時操作步驟和涉及的緩沖液配方都有所不同。免疫沉淀，免疫共沉淀，染色質(zhì)免疫沉淀和RNA免疫沉淀在實驗操作中所要注意的關鍵點的主要區(qū)別是什么？d dE EaniriaVuaniriaVuj jaa*曲,J J J J aanria

16、XdaanriaXdj jJ J J JAABBUBBU UdUdJJi iiiUdiiUdJJ&土M MK Kd.d.J J J JAABIBMBIBM alalA Ad.d. d dA A-Hd-HdCWCWdddsanVddddsanVd：d dSSSSdsamriaCddsamriaCdJ J J JAAHIBMHIBM C Cd dA A-Hd-Hdt tdidi$ $ A AddjnaiuddjnaiuC Cd4d4免疫沉淀：因為免疫沉淀的目的主要是通過抗體和目的蛋白相互作用從而捕獲目的蛋白，所以實驗中要注意的關鍵點是抗體和目的蛋白相互作用的效果。其主要受抗體的結(jié)合能力，目

17、的蛋白和抗體的可接觸性兩個因素影響。所以免疫沉淀實驗中的關鍵因素是抗體的選擇以及裂解緩沖液中的配方。對于前者而言，抗體所針對的作用表位必須處于目的蛋白表面，對抗體結(jié)合力的要求和免疫印跡或者免疫熒光相比要高得多；對于后者而言，主要考慮因素是緩沖液中的去垢劑成分能否在不破壞目的蛋白天然構(gòu)象的情況下 （不影響目的蛋白和抗體的相互作用效果）將目的蛋白從細胞局部定位（比如位于某些細胞器中）中有效釋放出來。免疫共沉淀：免疫共沉淀的目的是通過抗體和目的蛋白的相互作用從而捕獲目的蛋白復合物，最終檢測目的蛋白復合物中各成分之間的相互作用。所以實驗中要注意的關鍵點和免疫沉淀相比，除了要注意抗體和目的蛋白相互作用的

18、效果外，還要注意目的蛋白復合物的完整性。后者主要考慮因素是緩沖液中的去垢劑成分能否在有效釋放目的蛋白復合物進入可溶相的情況下不破壞目的蛋白復合物中各成分之間的相互作用。所以，免疫共沉淀實驗中的關鍵因素除了抗體的選擇外，裂解緩沖液配方中的去垢劑的成分和濃度對免疫共沉淀實驗的成功與否至關重要，其選擇相比免疫沉淀實驗而言，要求更嚴格。染色質(zhì)免疫共沉淀：染色質(zhì)免疫沉淀的主要目的通過抗體和目的蛋白的相互作用從而捕獲和目的蛋白有相互作用的DNA片段，最終檢測目的蛋白和DNA片段的相互作用。因此，實驗中要注意的關鍵點和前二者（免疫沉淀和免疫共沉淀）有所不同。因為在實驗中中蛋白質(zhì)-DNA復合物的維持需要依靠多

19、聚甲醛的交聯(lián)作用，所以目的蛋白的許多表面表位也在交聯(lián)過程中喪失。因此，除了后續(xù)的基本操作和免疫沉淀以及免疫共沉淀有些許不同，有額外需要注意的是向外，其對抗體的要求要比免疫沉淀和免疫共沉淀高得多，相對而言，裂解緩沖液的成份并不是關鍵因素。LHLHmmmm4444r ranaJJanaJJ. .naausendnaausendJEJEu uJJJJ naaunaau）JmdJmdJ JIBIBHIBIBH*JJ.*JJ. IBMi.JIBMi.J JUJUi iMIBIBHMIBIBHajjnajjnMBIMBI_ _I IaJaJMamaajjMamaajj nanuinanuij jmnama

20、admnamaad- -MIMIuBauuBauJ Ja aJJJJa awtiajwtiajM MmaumauJHJH上上 crinwBBiiajmauJcrinwBBiiajmauJa*naua*nau免疫共沉淀和GST-Pulldown有什么區(qū)別？免疫共沉淀實驗由于在非變性實驗條件性進行，這樣蛋白質(zhì)之間的天然相互作用得以最大程度的保留，因此可以比較真實的反應蛋白質(zhì)之間的相互作用。但也基于此點，免疫共沉淀并不能顯示蛋白質(zhì)之間的相互作用是直接還是間接的，因為通過目的蛋白抗體共沉淀下來的是一個蛋白復合物，而不僅僅是和目的蛋白直接相互作用的蛋白。而GST-Pulldown實驗可以通過體外實驗條件

21、，去除其它蛋白的影響，從而確定目的蛋白和待檢測蛋白是否可以發(fā)生直接相互作用。免疫沉淀，免疫共沉淀和RNA免疫沉淀以及染色質(zhì)免疫沉淀一般都用于什么實驗目的?實驗名稱研究目的研究用途備注蛋白純化利用抗體和抗原的特異性結(jié)合達到純化抗原的目的去除目的蛋白利用抗體和抗原的特異性結(jié)合達到從含有抗原的反應液中去除研究目的優(yōu)化免疫印跡（WB）效果通過IP可以對目的抗原進行富集（最高可以富集10,000倍），然后進行WB。由于對目的抗原進行了富集，提高了抗原濃度，這樣可以解決許多抗體WB實驗效果/、好（包括特異性不好和背景嚴重）的問題免疫沉淀蛋白的理化特性測定蛋白修飾位點信息可以通過免疫沉淀純化抗原去進行質(zhì)譜鑒

22、定從而測定蛋白的修飾位點的信息（磷酸化，甲基化，乙?；吞擎溞揎椀龋y定蛋白的降解速度通過免疫沉淀純化經(jīng)由放線菌酮處埋的細胞樣品中的抗原冉通過WB測定不同樣品中目的抗原的含量；或者對細胞進行同位素脈沖標記然后進行免疫沉淀實驗再通過放射自顯影測定目的抗原的含量測定酶活經(jīng)免疫沉淀純化待測酶后再進行酶活測定（包括激酶測定等）研究蛋白尋找新的相互作用蛋白經(jīng)由免疫共沉淀然后通過質(zhì)譜或者WB鑒定新的相互作用蛋白免疫共沉淀與蛋白的相互作用驗證目的蛋白和待測蛋白是否有相互作用經(jīng)由免疫共沉淀然后通過使用待測蛋白的抗體進行WB實驗可以確定目的蛋白和待測蛋白是否有相互作用研究蛋白研究蛋白與DNA的動態(tài)作用通過對經(jīng)由

23、免疫共沉淀而得到的DNA片段進行PCR實驗可以獲彳導DNA片段的序列信息以及目的蛋白與DNA之間的動態(tài)作用信息染色質(zhì)免疫沉淀與DNA的相互作用研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達之間的關系通過使用針對組蛋白不同修飾位點的抗體進行染色質(zhì)免疫沉淀實驗去檢測組蛋白的不同修飾狀態(tài)和目的基因啟動子之間的動態(tài)相互作用，從而研究組蛋白修飾與目的基因表達之間的關系研究蛋白與基于CHIP的原理發(fā)展出來的RIP（RNA-IP）技術(shù)可以用來研RNA的相互作用究目的蛋白與RNA之間的相互作用信息我該選擇什么樣的抗體做免疫沉淀，免疫共沉淀和RNA免疫沉淀以及染色質(zhì)免疫沉淀?在所有免疫沉淀相關實驗中，抗原的起始濃度相對其它

24、免疫相關實驗（WB和IF等）要低得多，所以對抗體的親和力相對其它實驗（WB和IF等）提出了很高的要求，這就需要使用高親和力的抗體去進行免疫沉淀相關實驗。同時，由于免疫沉淀相關實驗主要是在生理條件性進行，所以需要抗體識別蛋白的天然表面構(gòu)象，因此選擇的抗體其針對的抗原決定族需要暴露在蛋白表面。這些因素對制備能成功應用于IP實驗的抗體提出了很高的要求：a.用于免疫的蛋白抗原其構(gòu)象需要盡量接近目的蛋白的天然構(gòu)象或者用于免疫的多肽盡量暴露在目的蛋白的表面。獲得接近天然構(gòu)象的蛋白抗原的途徑有很多，主要有天然提取，原核表達重組蛋白以及真核表達重組蛋白三種方式。這其中，就蛋白構(gòu)象角度而言，天然提取是最佳途徑，

25、但這種方法受材料來源限制和純化方法復雜等多因素影響，一般很少采用。原核表達因為成本低廉，操作方便最為受歡迎，但其受表達環(huán)境與大部分蛋白天然存在環(huán)境差別巨大，構(gòu)象失真情況嚴重，抗原的構(gòu)象質(zhì)量有嚴重問題。大規(guī)模瞬時真核表達是近期新興的表達系統(tǒng)，具有表達環(huán)境接近天然，操作方便等諸多優(yōu)點，是獲取具有天然構(gòu)象蛋白抗原的首選工具。b.親和力要比普通的抗體應用要求高得多。多克隆抗體由于可以結(jié)合目的抗原的多個抗原決定簇，所以在親和力方面是首選。但考慮到特異性，獲得單克隆抗體群是更好的選擇。具體優(yōu)缺點總結(jié)如下表。多克隆抗體單克隆抗體單克隆抗體群（由一個免疫原產(chǎn)生的多個單克隆抗體混合物）抗體抗原作用信號強度極佳由

26、抗體的親和力決定（極住或者極弱）極佳特異性通常很好，但有時會有非特異性相互作用極住，但啟時會后交叉反應極佳（由于選才i可以進行IP且沒有交叉反應的抗體組成單克隆抗體群）優(yōu)點親和力高（由于抗體可以與目的蛋白的多個抗原決定族相互作用）特異性好，且可以無限量供應特異性好，親和力高（由于選擇可以進行IP且沒有交叉反應的抗體組成單克隆抗體群）缺點非特異性相互作用很難去除需要篩選親和力高的抗體；抗原表位可能會被相互作用蛋白遮蔽能夠篩選得到的符合條件的單克隆并不多，所以單克隆抗體群也就不容易獲得免疫沉淀效果極佳（由于親和力高）由抗體的親和力決定（極住或者極弱）極佳（由于選才i可以進行IP且沒有交叉反應的抗體

27、組成單克隆抗體群）免疫共沉淀效果通常很好，但有時非特異性相互作用會帶來假陽性由抗體的親和力決定和抗原表位是否被相互作用蛋白遮蔽決定（極佳或者極弱）極佳（由于選擇可以成功進行IP且沒有交叉反應的抗體組成單克隆抗體群）染色質(zhì)免疫沉淀效果通常很好，但有時非特異性相互作用會帶來假陽性由抗體的親和力決定和抗原表位是否被遮蔽或者以及抗原表位是否被交聯(lián)實驗所破壞決定（極住或者極弱）極佳（由于選擇可以成功進行IP且沒有交叉反應的抗體組成單克隆抗體群）TroubleshootingforIP,CO-IP,RIPandCHIP免疫沉淀產(chǎn)生的問題產(chǎn)生問題的原因解決辦法沒有得到目的蛋白或者得到的目的蛋白太少1.目的蛋

28、白在樣品中含量太低或者檢測樣品中沒有目的蛋白更換樣品或者在細胞中過表達目的基因2.加入的proteinA/G-beads太少或者與一抗的結(jié)合屬性小匹配增加proteinA/G-beads至60ul/mg總蛋白；檢查proteinA/G-beads與一抗的結(jié)合屬性3.抗體或者proteinA/G-beads與樣品作用時間太短正確按照protocol操作，抗體或者proteinA/G-beads與樣品作用時間最短/、能少于2小時4.蛋白發(fā)生降解盡量使用新鮮制備樣品進行免疫沉淀實驗；將樣品至于冰上或者在冷庫中操作5.雜蛋白太多加入抗體和proteinA/G-beads前100,000g離心細胞30m

29、in以去除膜成分或者不可溶蛋白6.目的蛋白沒有溶解或者溶解不充分針對目的蛋白的特性選擇合適的裂解液7.抗體使用濃度太低提高抗體使用濃度8.抗體親和力差更換親和力更局的抗體9.抗體所識別的抗原表位被相互作用蛋白所遮蔽，無法與目的蛋白相互作用更換抗體10.抗體選擇不合適，所選擇的抗體不能識別處于天然構(gòu)象的蛋白更換抗體11.抗體或者proteinA/G-beads與樣品作用時間太短正確按照protocol操作，抗體或者proteinA/G-beads與樣品作用時間最短/、能少于2小時12.洗滌條件過于劇烈減少洗滌次數(shù)；降低洗滌緩沖液中的鹽濃度或者更換更溫和的去垢劑13.檢測靈敏度不夠更換檢測試劑 （針對WB檢測）或者提高檢測水平 （針對質(zhì)譜檢測）有非特異性相互1.ProteinA/G-beads對蛋白的非特異性吸附或者樣品中有其它蛋白與ProteinA/G-beads有交叉反應用ProteinA/G-beads對細胞進行預處理去除非特異性吸附蛋白，然后再加入抗體；加入2%BSA于ProteinA/G-beads中對beads進行預封閉作用或者