第6章體外分析技術(shù)

1、重慶醫(yī)科大學(xué) 李少林 第6章 體外分析技術(shù)體外分析技術(shù)臨床醫(yī)學(xué)八年制核醫(yī)學(xué)教學(xué)課件Summary Radioimmunoassay is a highly sensitive and specific assay method (in vitro assay) that uses the competition between radiolabeled （or unradiolabeled） and unlabeled substances in an antigen-antibody reaction to determine the concentrantion of the unlabe

2、led substances ;It can be used to determine antibody concentrantion or to determine the concentrantion.of any substance against which specific antibody can be produced. 待測物質(zhì)濃度與檢測手段待測物質(zhì)濃度與檢測手段 臨床化學(xué)分析10-1210-910-610-310-0pg/mLng/mLm mg/mLmg/mLg/L免疫分析免疫分析Therapeutic DrugsThyroid HormoneFertility Hormon

3、eAllergyCancer MarkersInfectious DiseaseVitaminsSerum Proteins常量常量微量微量超微量超微量現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展疾病診斷的革新可在沒有任何臨床癥狀，而病人體內(nèi)發(fā)生可在沒有任何臨床癥狀，而病人體內(nèi)發(fā)生 1. 基因表達異常；基因表達異常； 2. 受體分布異常或受體功能改變；受體分布異?；蚴荏w功能改變； 3. 器官代謝異常；器官代謝異常； 4. 激素水平異常激素水平異常 酶、神經(jīng)遞質(zhì)酶、神經(jīng)遞質(zhì) 等異常，等異常， 可早期發(fā)現(xiàn)。可早期發(fā)現(xiàn)。 體外分析和影像學(xué)的發(fā)展起了很大作用體外分析和影像學(xué)的發(fā)展起了很大作用 例如例如 癌癥的早期診斷

4、癌癥的早期診斷放射免疫分析法的創(chuàng)立集中了放射性核素示蹤技術(shù)的高靈敏度和免疫發(fā)應(yīng)的高特異性1959 美國美國Yalow & Berson1960 英國英國 Ekims1977 獲諾貝爾醫(yī)學(xué)生物學(xué)獎獲諾貝爾醫(yī)學(xué)生物學(xué)獎開創(chuàng)了醫(yī)學(xué)生物學(xué)超微量分析方法開創(chuàng)了醫(yī)學(xué)生物學(xué)超微量分析方法使人體內(nèi)微量生物活性物質(zhì)的測量成為可能使人體內(nèi)微量生物活性物質(zhì)的測量成為可能對現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展起到推動作用對現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展起到推動作用 R：放射性核素標(biāo)記抗原：放射性核素標(biāo)記抗原 高靈敏（高靈敏（10 -9 -15 g/ml） 探測待測物上的標(biāo)記信號探測待測物上的標(biāo)記信號 (標(biāo)記物的放大效應(yīng)標(biāo)記物的放大效應(yīng))I：免疫學(xué)

5、反應(yīng)免疫學(xué)反應(yīng)高特異高特異以抗體為結(jié)合劑以抗體為結(jié)合劑B:標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原競爭與同種抗體結(jié)標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原競爭與同種抗體結(jié)合合定定 義義以放射核素標(biāo)記（或其他非放射性標(biāo)記）的以放射核素標(biāo)記（或其他非放射性標(biāo)記）的配體配體(Ligand)為示蹤劑，以配體和結(jié)合體的為示蹤劑，以配體和結(jié)合體的結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，在試管內(nèi)進行的微量生物結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，在試管內(nèi)進行的微量生物活性物質(zhì)的檢測技術(shù)?；钚晕镔|(zhì)的檢測技術(shù)。 體外分析技術(shù)是結(jié)合了放射性核素的高靈體外分析技術(shù)是結(jié)合了放射性核素的高靈敏度和特異性結(jié)合反應(yīng)的高特異性的一種超微敏度和特異性結(jié)合反應(yīng)的高特異性的一種超微量分析技術(shù)，具有量分析技術(shù)，具有靈

6、敏度高、特異性強、精密靈敏度高、特異性強、精密度好、應(yīng)用面廣、方法簡便度好、應(yīng)用面廣、方法簡便等優(yōu)點。等優(yōu)點。方法學(xué)基礎(chǔ)方法學(xué)基礎(chǔ)結(jié)合反應(yīng)結(jié)合反應(yīng)遵守可逆反應(yīng)的質(zhì)量作用定律：遵守可逆反應(yīng)的質(zhì)量作用定律： k1, v1R+L RL k2, v2定量手段定量手段放射性測量技術(shù)放射性測量技術(shù)酶定量技術(shù)酶定量技術(shù)化學(xué)發(fā)光定量技術(shù)化學(xué)發(fā)光定量技術(shù)生物學(xué)基礎(chǔ)生物學(xué)基礎(chǔ) 特異性結(jié)合反應(yīng)：特異性結(jié)合反應(yīng)： 抗原抗原-抗體的免疫結(jié)合反應(yīng)；抗體的免疫結(jié)合反應(yīng)； 配基配基-受體的結(jié)合反應(yīng)；受體的結(jié)合反應(yīng)； 底物底物-催化酶之間的酶促反應(yīng)；催化酶之間的酶促反應(yīng)； 結(jié)合體：結(jié)合體： 抗原抗原-抗體抗體 激素激素-激素結(jié)

7、合球蛋白激素結(jié)合球蛋白 受體受體-配體配體體體外外分分析析技技術(shù)術(shù)體外放射分析體外放射分析體外非放射分析體外非放射分析放射性競爭放射性競爭結(jié)合分析結(jié)合分析放射性非競放射性非競爭結(jié)合分析爭結(jié)合分析Dr. Yalow 在體外條件下在體外條件下, 利用利用Ag與定量的與定量的*Ag對限量的特異性對限量的特異性Ab的競爭結(jié)合反應(yīng)，的競爭結(jié)合反應(yīng)，通過測定放射性復(fù)合物的量來計算出通過測定放射性復(fù)合物的量來計算出Ag 量的一種超微量分析技術(shù)。量的一種超微量分析技術(shù)?；驹砘驹?Ag-Ab + Ag *Ag AbAg+*Ag-Ab + *Ag(B)(F) 4*Ag與與Ag 免疫活性相同免疫活性相同4*

8、AgAg AbAg= * Ag , AgAb=*AgAbAg *Ag , *AgAb (B) *Ag(F)Ag 90%2）半衰期足夠長）半衰期足夠長3）保持原有抗原的特性）保持原有抗原的特性大分子：125I小分子：3H or 125I3.非標(biāo)記抗原非標(biāo)記抗原 （標(biāo)準(zhǔn)品）（標(biāo)準(zhǔn)品）化學(xué)結(jié)構(gòu)、免疫活性與被測抗原相同化學(xué)結(jié)構(gòu)、免疫活性與被測抗原相同高純度高純度B和和F的分離的分離1.第一類第一類2.第二類第二類雙抗體沉淀法雙抗體沉淀法PEG沉淀法沉淀法固相第二抗體法固相第二抗體法+AgAb(1)Ab(2)Ab(2)Ab(1)Ag可溶性復(fù)合物可溶性復(fù)合物可沉淀復(fù)合物可沉淀復(fù)合物試管試管試管試管分離方法

9、的要求分離方法的要求分離完全、快速。分離完全、快速。不影響免疫反應(yīng)的平衡，即是要求在分離過程中不使抗不影響免疫反應(yīng)的平衡，即是要求在分離過程中不使抗原原-抗體復(fù)合物解離或形成新的復(fù)合物?？贵w復(fù)合物解離或形成新的復(fù)合物。受環(huán)境因素（溫度、受環(huán)境因素（溫度、pH值等）的影響小。值等）的影響小。操作簡便，分離劑來源豐富、價廉。操作簡便，分離劑來源豐富、價廉。質(zhì)量控制質(zhì)量控制（quality controlquality control） 1.精密度（精密度（precision） 變異系數(shù)（變異系數(shù)（ CV ）7%10%2.準(zhǔn)確度（準(zhǔn)確度（accuracy） 回收率回收率=測定值測定值/真實值真實值1

10、00% 90%110% 3.靈敏度靈敏度 （sensitivity） 方法的最小可測量方法的最小可測量4.特異性（特異性（specificity） 交叉反應(yīng)率交叉反應(yīng)率5.可靠性（可靠性（validity） 平行性試驗平行性試驗6.穩(wěn)定性（穩(wěn)定性（stability）B0%，NSB，ED25，ED50，ED75 ABC 質(zhì)量控制就是使用合適的方法以檢查、質(zhì)量控制就是使用合適的方法以檢查、表示和消除來自試劑藥盒和測量體系的誤差，表示和消除來自試劑藥盒和測量體系的誤差，并使這種誤差降低到某一允許水平。并使這種誤差降低到某一允許水平。 具體作用有：具體作用有：1檢查誤差的程度，決定測定結(jié)果的取舍。檢

11、查誤差的程度，決定測定結(jié)果的取舍。2識別誤差的來源并消除其原因。識別誤差的來源并消除其原因。3改進測定方法的設(shè)計以提高質(zhì)量。改進測定方法的設(shè)計以提高質(zhì)量。 RIARIA小結(jié)小結(jié)1. 靈敏度高靈敏度高2. 特異性好特異性好3. 精確的定量精確的定量4. 方法操作簡便方法操作簡便免疫放射分析法*Ab+Ag-*Ab + *Ab（immunoradiometric assay,IRMA）B%Ag（B）（F）在體外在體外, 利用利用Ag與過量的與過量的*Ab的非競爭性結(jié)合反應(yīng)，通過測定放射性的非競爭性結(jié)合反應(yīng)，通過測定放射性復(fù)合物的量來計算出復(fù)合物的量來計算出Ag 量。標(biāo)記抗體，抗體是過量的。量。標(biāo)記抗

12、體，抗體是過量的。IRMA與與RIA工作原理的主要區(qū)別工作原理的主要區(qū)別RIAIRMA競爭性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)非競爭性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)采用標(biāo)記抗原采用標(biāo)記抗體三種主要反應(yīng)試劑二種主要反應(yīng)試劑所用抗體是限量的所用抗體是過量的*AgAb的量與待測Ag的量呈負相關(guān)Ag*Ab的量與待測Ag的量呈正相關(guān)反應(yīng)到達平衡慢反應(yīng)到達平衡快非特異結(jié)合主要影響高劑量區(qū)非特異結(jié)合主要影響低劑量區(qū)低劑量區(qū)有不確定因素低劑量區(qū)無不確定因素B%B%擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的擬合的NSB擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的擬合的NSBIRMA的標(biāo)準(zhǔn)曲線及的標(biāo)準(zhǔn)曲線及非特異結(jié)合曲線非特異結(jié)合曲線RIA的標(biāo)準(zhǔn)曲線及的標(biāo)準(zhǔn)曲線

13、及非特異結(jié)合曲線非特異結(jié)合曲線RIA+或或01IRMA+1非放射性標(biāo)記免疫分析技非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)術(shù)酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)時間分辨熒光免疫分析技術(shù)酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)酶標(biāo)記免疫分析技術(shù) 用酶分子代替放射性核素標(biāo)記抗原或抗用酶分子代替放射性核素標(biāo)記抗原或抗體，進行競爭性或非競爭性免疫分析的技術(shù)。體，進行競爭性或非競爭性免疫分析的技術(shù)。其中應(yīng)用最多的就是酶聯(lián)免疫吸附分析法其中應(yīng)用最多的就是酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISAELISA）。）。 是結(jié)合了抗原抗體高特異性和酶促反應(yīng)是結(jié)合了抗原抗體高特異性和酶促反應(yīng)的高敏感性的檢測技術(shù)。的高敏感性的檢測技術(shù)。 ELISA ELISA方法是

14、用酶分子標(biāo)記抗體，進行與方法是用酶分子標(biāo)記抗體，進行與IRMAIRMA相似的夾心法免疫反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后分相似的夾心法免疫反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后分離結(jié)合部分和游離部分，利用結(jié)合部分上的離結(jié)合部分和游離部分，利用結(jié)合部分上的酶分子的催化活性將底物轉(zhuǎn)化為特定的顏色，酶分子的催化活性將底物轉(zhuǎn)化為特定的顏色，用分光光度計測定，顏色的深淺和酶量成正用分光光度計測定，顏色的深淺和酶量成正比，而酶量又和復(fù)合物的量成正比。比，而酶量又和復(fù)合物的量成正比。 常用的酶是常用的酶是辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶，底物是，底物是四四甲基聯(lián)苯胺甲基聯(lián)苯胺 (TMB) (TMB) ，反應(yīng)后顯黃色。，反應(yīng)后顯黃色。 化學(xué)發(fā)光免疫分析

15、技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是以化學(xué)發(fā)光物質(zhì)代化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是以化學(xué)發(fā)光物質(zhì)代替放射性核素作為示蹤物的超微量分析技術(shù)。替放射性核素作為示蹤物的超微量分析技術(shù)。 化學(xué)發(fā)光物質(zhì)在氧化劑或催化劑的作用下能化學(xué)發(fā)光物質(zhì)在氧化劑或催化劑的作用下能形成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物，并在退激時將能量轉(zhuǎn)化為形成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物，并在退激時將能量轉(zhuǎn)化為光子的物質(zhì)。光子的物質(zhì)。1.1.化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析 是用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)作為標(biāo)記物，標(biāo)記抗原是用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)作為標(biāo)記物，標(biāo)記抗原或抗體，反應(yīng)以后，利用堿性條件下化學(xué)發(fā)光或抗體，反應(yīng)以后，利用堿性條件下化學(xué)發(fā)光物質(zhì)在氧化物作用下可以發(fā)生單光子放射。檢物質(zhì)在氧

16、化物作用下可以發(fā)生單光子放射。檢測光子的數(shù)量就可以反映復(fù)合物的量。測光子的數(shù)量就可以反映復(fù)合物的量。 常用的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)是常用的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)是異魯米那異魯米那和和吖啶酯吖啶酯。 2.2.化學(xué)發(fā)光酶免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析 和和ELISAELISA相似，用堿性磷酸酶標(biāo)記抗體，相似，用堿性磷酸酶標(biāo)記抗體，經(jīng)夾心法免疫反應(yīng)后，帶有酶的復(fù)合物作用經(jīng)夾心法免疫反應(yīng)后，帶有酶的復(fù)合物作用于特殊的底物于特殊的底物-金剛烷金剛烷，使底物發(fā)射出光子。，使底物發(fā)射出光子。 此法光子發(fā)射持續(xù)時間較長，可靠性比此法光子發(fā)射持續(xù)時間較長，可靠性比較好。較好。 3.3.電化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析( (略略)

17、) 4.4.生物發(fā)光免疫分析生物發(fā)光免疫分析( (略略) ) 時間分辨熒光免疫分析技術(shù)時間分辨熒光免疫分析技術(shù)（time-resolved fluoroimmunoassay）標(biāo)記物為具有獨特?zé)晒馓匦缘南⊥两饘勹|系元素鑭系元素共有鑭系元素共有15種，應(yīng)用在時間分辨熒光免疫技術(shù)種有四種種，應(yīng)用在時間分辨熒光免疫技術(shù)種有四種 釤（釤（Sm），銪（），銪（Eu），鏑（），鏑（Dy），鋱（），鋱（Te）鑭系元素?zé)晒庵匾攸c：鑭系元素?zé)晒庵匾攸c： 1.極長的熒光衰退時間極長的熒光衰退時間 銪：銪：730000ns，釤：，釤：50000ns，一般熒光物質(zhì)：，一般熒光物質(zhì)：10ns 2.200nm的的St

18、okes位移位移 銪：激發(fā)光銪：激發(fā)光340nm，發(fā)射光，發(fā)射光613nm 熒光素的熒光素的Stokes位移為位移為273nm 3.狹窄的發(fā)射峰狹窄的發(fā)射峰 4.解離解離-增強技術(shù)可使其熒光性提高增強技術(shù)可使其熒光性提高100萬倍萬倍時間分辨熒光免疫分析技術(shù)時間分辨熒光免疫分析技術(shù)（time-resolved fluoroimmunoassay）基本原理基本原理鑭系元素（鑭系元素（1515）：銪（）：銪（EuEu），釤），釤（SmSm），鏑（），鏑（DyDy），鋱（），鋱（TeTe）Eu+EuEu+增強液增強液+Eu“解離增強鑭系熒光免疫分析解離增強鑭系熒光免疫分析”時間分辨熒光檢測的基本原理

19、示意圖時間分辨熒光檢測的基本原理示意圖熒光衰退時間熒光衰退時間銪：銪：730000 ns釤：釤：50000 ns一般熒光物質(zhì)：一般熒光物質(zhì)：10 ns銪的熒光銪的熒光TrFIA的特點1.最大限度提高測量方法的靈敏度最大限度提高測量方法的靈敏度2.有與有與RIA相似的特異性和精密度相似的特異性和精密度3.可同時測定兩種以上的抗原可同時測定兩種以上的抗原4.無輻射污染無輻射污染DELFIA技術(shù)的特點為臨床檢測帶來的先進性技術(shù)的特點為臨床檢測帶來的先進性技術(shù)技術(shù)特點特點檢驗先進性檢驗先進性時間分辨時間分辨波長分辨波長分辨將特異性熒光與非特異性熒將特異性熒光與非特異性熒光分離開光分離開零背景零背景高特異性高特異性解離解離-增強增強熒光性大大提高熒光性大大提高穩(wěn)定的熒光螯合物穩(wěn)定的熒光螯合物線性范圍更寬線性范圍更寬重復(fù)性更好重復(fù)性更好低分子量原子低分子量原子標(biāo)記標(biāo)記標(biāo)記位點多可達標(biāo)記位點多可達20個個對標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)與活性影響對標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)與活性影響小小無衰變無衰變受環(huán)境影響小受環(huán)境影響小靈敏度更高靈敏度更高高穩(wěn)定性，高精確度