棉屬四倍體及其供體基因組單染色體鑒別和rDNA定位

1、棉屬四倍體及其供體基因組單染色體鑒別和rDNA定位棉花是世界上重要的纖維經(jīng)濟(jì)作物,也是細(xì)胞遺傳學(xué)、基因組學(xué)和進(jìn)化研究的模式植物。目前其四倍體供體種尚存在爭(zhēng)議,研究棉屬四倍體及其供體種有利于了解棉屬多樣性和棉花全基因組測(cè)序,為在利用野生棉基因庫(kù)中有目的地開(kāi)采更多基因應(yīng)用于棉花育種。染色體鑒別和rDNA定位是棉花基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)，也為棉屬進(jìn)化和確定四倍體棉供體種提供有力的證據(jù)。本文以?xún)商钻懙孛奕旧w特異BAC?。ˋhDh）為主體探針，結(jié)合D基因組著絲粒一個(gè)特異BAC克隆、45SrDNAffi5s兩種rDNA,對(duì)四倍體基因組及其二倍體供體的A和D兩個(gè)基因組共18個(gè)棉種的單染色體進(jìn)行FISH鑒別,將

2、兩個(gè)rDNA定位在特定的染色體和染色體臂上，并整合了遺傳連鎖圖和物理圖。本研究取得的主要結(jié)果如下：1、采用篩選自陸地棉A亞組單染色體所對(duì)應(yīng)BAC克隆的13對(duì)特異SSR8I物，分別對(duì)四倍體海島棉和達(dá)爾文氏棉A亞組，以及二倍體A基因組草棉和阿非利加棉等4個(gè)基因組（亞組）進(jìn)行PCRT增；采用篩選自陸地棉D(zhuǎn)亞組單染色體所對(duì)應(yīng)BACS隆的13對(duì)特異SSRSI物，分別對(duì)四倍體這兩個(gè)棉種D亞組以及二倍體D基因組瑟伯氏棉、三裂棉、克勞茨基棉、戴維遜氏棉、辣根棉、旱地棉和雷蒙德氏棉等9個(gè)基因組（亞組）進(jìn)行PCRT增，以檢測(cè)這兩套SSR標(biāo)記對(duì)于這13個(gè)基因組（亞組）的有效性。盡管PCRT增產(chǎn)物出現(xiàn)了一些大小不一致

3、的片段和非特異性片段,但總的結(jié)果證實(shí)了這些標(biāo)記在相應(yīng)的棉種基因組（亞組）中的存在,大部分標(biāo)記能擴(kuò)增出與預(yù)期對(duì)應(yīng)的目的片段。這也說(shuō)明了陸地棉A和D亞組兩套BACS?。ˋh01-Ah13和Dh01-Dh13）可以用作FISH標(biāo)記，用來(lái)探討四倍體海島棉和達(dá)爾文氏棉A與D兩個(gè)亞組，以及二倍體A與D兩個(gè)基因組的單染色體鑒別。2、在有絲分裂中期，采用BAC-FISH(BAC克隆做探針的熒光原位雜交)分別鑒別了海島棉和達(dá)爾文氏棉,以及瑟伯氏棉、三裂棉、克勞茨基棉、戴維遜氏棉、辣根棉、旱地棉和雷蒙德氏棉、草棉和阿非利加棉等11個(gè)棉種的全套單染色體。結(jié)果顯示,Ah的13個(gè)特異BACS隆都很好地定位在四倍體棉A亞

4、組或A基因組棉種單染色體上，Dh的13個(gè)特異BACS隆也都很好地定位在四倍體棉D(zhuǎn)亞組或D基因組棉種染色體上。在所鑒別的11個(gè)棉種中,雷蒙德氏棉比較特殊,有3個(gè)BACS隆(48F11、78G20和78O17心多對(duì)染色體上出現(xiàn)雜交信號(hào)。因此，這兩套陸地棉染色體特異BACS：隆作為上述棉種(雷蒙德氏棉除外)的單染色體鑒別標(biāo)記是可靠的。通過(guò)四倍體A亞組間及其與A基因組問(wèn)、D亞組問(wèn)及其與D基因組間的同源轉(zhuǎn)化關(guān)系，確定了這些棉種單染色體的命名：四倍體棉A(D)亞組At(Dt)染色體為At01-At13(Dt01-Dt13);，海島棉A(D)亞組染色體分別為Ab01-Ab13(Db01-Db13);達(dá)爾文氏

5、棉A(D)亞組染色體分別為Ad01-Ad13(Dd01-Ddl3);A基因組(Ag)染色體為Ag01-Ag13;草棉(A1)染色體為A101-A113;阿非利加棉(Ala)染色體為Ala01-A1a13;D基因組(Dg)染色體為Dg01-Dg13;瑟伯氏棉(D1)染色體為D101-D113;三裂棉(D8)染色體為D801-D813;克勞茨基棉(D3k)染色體為D3k01-D3k13;戴維遜氏棉(D3d)染色體為D3d01-D3d13;辣根棉(D2-1)染色體為D2-101-D2-113;旱地棉(D4)染色體為D401-D413和雷蒙德氏棉(D5)染色體為D501-D5133、在有絲分裂中期，采

6、用BAC-FISH以染色體Ah07；Ah09Dh07和Dh09特異BAC克隆鑒別了毛棉白部分單染色體，以及以染色體Ah0SAh07、Ah09Dh03Dh07；Dh09和Dh12特異BACffi別了黃褐棉的部分染色體。結(jié)果顯示這些BACE隆都很好地定位在毛棉和黃褐棉染色體上。以染色體Ah0SAh07和Ah09特異BAC隆鑒別了亞洲棉的部分單染色體。以染色體Dh05Dh0ZDh09和Dhl2特異BAC隆分別鑒別了松散棉、施溫迪茫氏棉和擬似棉的部分單染色體。結(jié)果顯示這4個(gè)Dh特異BAC克隆都很好地定位在這3個(gè)D基因組棉種染色體上。通過(guò)四倍體D亞組間及其與D基因組間的同源轉(zhuǎn)化關(guān)系，確定了這些棉種部分單

7、染色體命名：毛棉A和D兩個(gè)亞組染色體分別為Ato07、Ato09、Dto07和Dto09;黃褐棉A和D兩個(gè)亞組染色體分別為Am05Am07Am09Dm03Dm07Dm09ffiDm12亞洲棉（A2）染色體為A20SA207和A209;松散棉（D9）染色體為D905D907；D909和D912;施溫迪茫氏棉（D11）染色體為D1105D110ZD1109和D1112;擬似棉（D6）染色體為D605D60ZD609和D6124、基于單染色體鑒別,完成了棉屬四倍體及其供體基因組共18個(gè)棉種的45S和5s兩種rDNA的染色體及其臂位的鑒別分析。總體上，兩種rDNA在所檢測(cè)的棉種的位點(diǎn)數(shù)目、拷貝數(shù)、染色

8、體位置和線性關(guān)系等有很多的一致性,也有多態(tài)性。四倍體棉基因組的45SrDNATB是3對(duì)，黃褐棉的都分布在A亞組染色體上（其中兩對(duì)在染色體Am07ffiAm09±）,其它4個(gè)四倍體棉種的染色體定位相同，都分別A與D兩個(gè)亞組染色體上（At09、Dt07和Dt09）。二倍體A基因組3個(gè)棉種的45SrDNA,都是3對(duì),在第5、7和9號(hào)染色體上（Ag05、Ag07和Ag09）。二倍體D基因組的45SrDNA,除了擬似棉只有2對(duì)（分布于染色體D607和D609）外,9個(gè)棉種都有3或4對(duì)，且大多數(shù)主要分布在第5、7、9和12號(hào)染色體上（Dg05、Dg07.Dg09和Dg12）。45SrDNA的拷貝

9、數(shù)，在同一棉種的不同染色體上或不同棉種間相同序號(hào)的染色體上都存在差異。5srDNA的拷貝數(shù)，除二倍體D基因組（Dg）明顯多于四倍體D亞組（Dt）以外,在所研究棉種中在位點(diǎn)數(shù)目、拷貝數(shù)和染色體位置等高度保守,即都是只有一對(duì)位于第9號(hào)染色體上（At09/Dt09和Ag09/Dg09）。45S和5s兩種rDNA的線性關(guān)系,在所檢測(cè)的二倍體A、D基因組和四倍體A、D亞組上明顯存在,僅黃褐棉D(zhuǎn)亞組特殊，不存在線性關(guān)系（黃褐棉D(zhuǎn)亞組上沒(méi)有檢測(cè)到45SrDNA）。5、本文研究了18個(gè)棉種rDNA定位，綜合分析的結(jié)果支持四倍體D亞組為多起源的論點(diǎn),認(rèn)為黃褐棉與其它4個(gè)四倍體棉種的供體種不同。黃褐棉的供體種可能

10、已經(jīng)滅絕或未發(fā)現(xiàn),而其它4個(gè)四倍體棉種的供體種可能是擬似棉、戴維遜氏棉、克勞茨基棉、辣根棉、旱地棉、松散棉和施溫迪茫氏棉,可能不是雷蒙德氏棉、瑟伯氏棉和三裂棉。四倍體A亞組的供體種可能是阿非利加棉。6、BAC克隆在不同棉種間（雷蒙德氏棉除外）的定位存在保守的共線性關(guān)系，說(shuō)明了D基因組與四倍體D亞組問(wèn)、A基因組與四倍體A亞組間分別存在大片段的染色體同源區(qū)段。通過(guò)遺傳圖與物理圖的對(duì)比分析，調(diào)整了四倍體棉種D亞組的遺傳圖（Dt03、04、06、09、10和12）的排列方向，并發(fā)現(xiàn)盡管染色體Dt04上的SSRB記存在于連鎖群的中間，但相應(yīng)的BAC卻由FISH定位到了對(duì)應(yīng)染色體的近末端。7、有3個(gè)單染色體特異BAC（48F1178G2訴口78017）在雷蒙德氏棉染色體上沒(méi)有出現(xiàn)預(yù)期的單染色體特異雜交