第十章：發(fā)酵過程優(yōu)化與放大概論

1、第十章第十章發(fā)酵過程優(yōu)化與放大發(fā)酵過程優(yōu)化與放大本章提要本章提要 發(fā)酵過程檢測與自控發(fā)酵過程檢測與自控 生物反應(yīng)器過程的多尺度理論生物反應(yīng)器過程的多尺度理論發(fā)酵發(fā)酵過程優(yōu)化與放大基礎(chǔ)過程優(yōu)化與放大基礎(chǔ) 發(fā)酵過程優(yōu)化控制中的方法和手段發(fā)酵過程優(yōu)化控制中的方法和手段 發(fā)酵過程優(yōu)化控制舉例發(fā)酵過程優(yōu)化控制舉例 第一部份發(fā)酵過程檢第一部份發(fā)酵過程檢測與自控測與自控( (簡介一些控制的基本常識）簡介一些控制的基本常識） 發(fā)酵過程的任務(wù)：發(fā)酵過程的任務(wù)：使菌株的生產(chǎn)能力高效表達(dá)，以較低的物料消耗獲得更多的發(fā)酵產(chǎn)品 發(fā)酵動力學(xué)提供了理論依據(jù) 工程學(xué)方面的實際問題：環(huán)境因素的檢測與自控問題 1.1 1.1 發(fā)

2、酵過程檢測發(fā)酵過程檢測 1.1.1 概述 測定發(fā)酵過程中數(shù)據(jù)，以便對此過程進(jìn)行有效的控制 具體目的：過程變量與預(yù)期是否一致，決定種子罐移種時間與放罐時間，對不可測變量進(jìn)行估計，手動或自動控制，計算機(jī)控制，收集數(shù)據(jù) 物理測量：溫度、壓力、體積、流量等溫度、壓力、體積、流量等 物理化學(xué)：pHpH、溶氧、溶、溶氧、溶CO2CO2、氧化還原、氧化還原 電位、氣相成分分析等電位、氣相成分分析等 化學(xué)測量：基質(zhì)、前體、產(chǎn)物等的濃度基質(zhì)、前體、產(chǎn)物等的濃度 生物生化：生物量、細(xì)胞形態(tài)、酶活性、生物量、細(xì)胞形態(tài)、酶活性、 胞內(nèi)成分等胞內(nèi)成分等, ,提供反映環(huán)境和細(xì)胞代謝生理變化提供反映環(huán)境和細(xì)胞代謝生理變化的

3、許多信息的許多信息連模：連續(xù)模擬間歇：間歇模擬 分批發(fā)酵過程檢測系統(tǒng)的配置 1.1.2 1.1.2 發(fā)酵傳感器發(fā)酵傳感器 傳感器（發(fā)酵罐）標(biāo)準(zhǔn)電信號儀表顯示或傳送給計算機(jī) 1.1.2.1 1.1.2.1 對傳感器的要求對傳感器的要求 可靠性，準(zhǔn)確性，精確度，響應(yīng)時間，分辨能力，靈敏度，測量范圍，特異性，可維修性，特殊要求（如是否能與發(fā)酵液同時進(jìn)行滅菌等） 1.1.2.2 1.1.2.2 發(fā)酵用傳感器的分類發(fā)酵用傳感器的分類 1. 按測量方式分按測量方式分 離線傳感器：離線傳感器：不安裝在發(fā)酵罐內(nèi)，人工取樣 在線傳感器：在線傳感器：自動測定，流動注射分析系統(tǒng)（FIA），（HPLC）或質(zhì)普儀等 原

4、位傳感器：原位傳感器：直接與發(fā)酵液接觸，給出連續(xù)的響應(yīng)信號，如溫度、壓力、pH、溶氧等 信號不受操作者干擾，直接輸入計算機(jī) 1.1.2.3 1.1.2.3 發(fā)酵過程的主要在線傳發(fā)酵過程的主要在線傳感器感器 1. pH 原位蒸汽滅菌的復(fù)合傳感器原位蒸汽滅菌的復(fù)合傳感器 玻璃電極玻璃電極 參比電極（與培養(yǎng)基連通）參比電極（與培養(yǎng)基連通） 裝在加壓護(hù)套內(nèi)裝在加壓護(hù)套內(nèi) 2. 溶氧溶氧 復(fù)膜溶氧探頭復(fù)膜溶氧探頭 銀陰極和鉛陽極組成的原電池銀陰極和鉛陽極組成的原電池 管狀銀陽極、鉑絲陰極、氯化銀電解液和極管狀銀陽極、鉑絲陰極、氯化銀電解液和極化電源組成的極譜型化電源組成的極譜型 產(chǎn)生的電流正比于通過膜擴(kuò)

5、散入探頭的氧量產(chǎn)生的電流正比于通過膜擴(kuò)散入探頭的氧量 復(fù)膜溶氧探頭實際測量的是氧分壓，與溶氧復(fù)膜溶氧探頭實際測量的是氧分壓，與溶氧濃度并不直接相關(guān)，結(jié)果用溶氧壓（濃度并不直接相關(guān)，結(jié)果用溶氧壓（DOTDOT）表示表示 一般以一般以空氣中氧飽和的百分度空氣中氧飽和的百分度表示表示 3. 氧化還原電位氧化還原電位 測定發(fā)酵液中氧化劑（電子供體）和還原劑（電子受體）之間平衡的信息 用一種由Pt電極和Ag/AgCl參比電極組成的復(fù)合電極與具有mV讀數(shù)的pH計連接 受溫度和溶氧壓的影響 發(fā)酵液中溶氧壓很低時，超出溶氧探頭超出溶氧探頭的極限，氧化還原電位可彌補(bǔ)的極限，氧化還原電位可彌補(bǔ)這一點這一點 4.

6、溶溶CO2 較高的分壓抑制微生物生長并降低次級代謝產(chǎn)物較高的分壓抑制微生物生長并降低次級代謝產(chǎn)物的量的量 由一支由一支pHpH探頭浸入被可穿透探頭浸入被可穿透COCO2 2的膜包裹的碳酸的膜包裹的碳酸氫鹽緩沖液中氫鹽緩沖液中 緩沖液與被測發(fā)酵液中的緩沖液與被測發(fā)酵液中的COCO2 2分壓保持平衡，緩分壓保持平衡，緩沖液的沖液的pHpH可間接表示發(fā)酵液中的可間接表示發(fā)酵液中的COCO2 2分壓分壓 1.1.2.4 1.1.2.4 發(fā)酵檢測用新型傳感器發(fā)酵檢測用新型傳感器 對生物反應(yīng)中重要的參數(shù)如生物量、基質(zhì)和產(chǎn)物對生物反應(yīng)中重要的參數(shù)如生物量、基質(zhì)和產(chǎn)物濃度的信息濃度的信息 1. 離子選擇電極離

7、子選擇電極 是對某種離子呈特異性反應(yīng)的電化學(xué)傳感器是對某種離子呈特異性反應(yīng)的電化學(xué)傳感器 由離子選擇膜、連通介質(zhì)和參比電極組成由離子選擇膜、連通介質(zhì)和參比電極組成 靈敏度高（靈敏度高（ppmppm），），但不能蒸汽滅菌但不能蒸汽滅菌 2. 生物傳感器生物傳感器 將生物學(xué)敏感材料固定化的傳感器，將生物信號將生物學(xué)敏感材料固定化的傳感器，將生物信號轉(zhuǎn)化為電信號轉(zhuǎn)化為電信號 生物學(xué)元件：生物學(xué)元件：由單酶、多酶體系、抗體、細(xì)胞由單酶、多酶體系、抗體、細(xì)胞器、細(xì)菌、動植物細(xì)胞或組織等生物材料通過表器、細(xì)菌、動植物細(xì)胞或組織等生物材料通過表面共價結(jié)合、物理吸附、包埋而固定面共價結(jié)合、物理吸附、包埋而固定

8、 轉(zhuǎn)換器：轉(zhuǎn)換器：電位計、安培計、量熱計、光度計電位計、安培計、量熱計、光度計 信號、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：信號、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：1.1.3 1.1.3 發(fā)酵過程其他重要檢測技術(shù)發(fā)酵過程其他重要檢測技術(shù) 1.1.3.1 1.1.3.1 生物量分析生物量分析1. 1. 干細(xì)胞濃度干細(xì)胞濃度2. DNA2. DNA含量含量3. 3. 沉降量或壓縮細(xì)胞體積沉降量或壓縮細(xì)胞體積4. 4. 粘度：絲狀菌生長和自溶，與生物量不直粘度：絲狀菌生長和自溶，與生物量不直 接相關(guān)，旋轉(zhuǎn)粘度計接相關(guān)，旋轉(zhuǎn)粘度計5. 5. 濁度濁度6. 6. 過濾探頭：過濾特性和細(xì)胞濃度及形態(tài)過濾探頭：過濾特性和細(xì)胞濃度及形態(tài)7. 7. 熒光

9、：熒光：NADHNADH反應(yīng)細(xì)胞的活性反應(yīng)細(xì)胞的活性 1.1.3.2 1.1.3.2 尾氣分析尾氣分析 分析尾氣中O2的減少和CO2的增加 1. 紅外CO2分析儀 2. 順磁O2分析儀 3. 質(zhì)普儀 1.1.3.3 1.1.3.3 發(fā)酵液成分分析發(fā)酵液成分分析 高效液相色普（HPLC） 選擇適當(dāng)?shù)膶游鲋?、操作溫度、溶劑系統(tǒng)等，樣品要要經(jīng)過亞微米級過濾 與自動取樣系統(tǒng)連接 1.2 1.2 發(fā)酵過程自控發(fā)酵過程自控 根據(jù)對發(fā)酵過程變量的測量和過程變化規(guī)根據(jù)對發(fā)酵過程變量的測量和過程變化規(guī)律的認(rèn)識，律的認(rèn)識，借助計算機(jī)等進(jìn)行控制借助計算機(jī)等進(jìn)行控制，使，使過程向著預(yù)期的方向進(jìn)行過程向著預(yù)期的方向進(jìn)行

10、 控制狀態(tài)目標(biāo)：控制狀態(tài)目標(biāo)：T T、pHpH、生物量、生物量濃度等濃度等 控制開關(guān)或伐門控制開關(guān)或伐門 預(yù)測控制模型預(yù)測控制模型1.2.1 1.2.1 基本自控系統(tǒng)基本自控系統(tǒng) 1.2.1.1 1.2.1.1 前饋控制前饋控制 被控對象反應(yīng)慢，測量反應(yīng)快的干擾量的變化來被控對象反應(yīng)慢，測量反應(yīng)快的干擾量的變化來對控制對象進(jìn)行控制對控制對象進(jìn)行控制 如溫度（控制對象如溫度（控制對象 ），冷卻水的壓力），冷卻水的壓力 1.2.1.2 1.2.1.2 反饋控制反饋控制 傳感器檢測被控輸出量，反饋到控制系統(tǒng)，控制傳感器檢測被控輸出量，反饋到控制系統(tǒng)，控制器根據(jù)與預(yù)定值的比較，得出偏差，進(jìn)而控制動器根

11、據(jù)與預(yù)定值的比較，得出偏差，進(jìn)而控制動作作 1. 開關(guān)控制開關(guān)控制 2. PID控制控制 當(dāng)控制負(fù)荷不穩(wěn)定時，可采用比例（當(dāng)控制負(fù)荷不穩(wěn)定時，可采用比例（P P）、積分）、積分（I I）、微分（）、微分（D D）控制算法，簡稱為）控制算法，簡稱為PIDPID控制控制 P P、I I、D D控制信號，分別正比于被控過程的輸出控制信號，分別正比于被控過程的輸出量與設(shè)定點的偏差、偏差相對于時間的積分和偏量與設(shè)定點的偏差、偏差相對于時間的積分和偏差變化速率差變化速率 只能在接近設(shè)定點的情況下有效工作只能在接近設(shè)定點的情況下有效工作 3. 串級反饋控制串級反饋控制 由兩個以上控制器對一種變量進(jìn)行聯(lián)合控制

12、的方法 4. 前饋前饋/反饋控制反饋控制 如廢水處理系統(tǒng)，分析懸浮固體含量如廢水處理系統(tǒng)，分析懸浮固體含量前饋到排前饋到排放控制器放控制器 根據(jù)排出懸浮固體含量對排放率進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)根據(jù)排出懸浮固體含量對排放率進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)1.2.2 1.2.2 發(fā)酵控制系統(tǒng)的硬件結(jié)構(gòu)發(fā)酵控制系統(tǒng)的硬件結(jié)構(gòu) 1. 傳感器傳感器 2. 變送器與過程接口變送器與過程接口 3. 執(zhí)行機(jī)構(gòu)和轉(zhuǎn)換器執(zhí)行機(jī)構(gòu)和轉(zhuǎn)換器 4. 監(jiān)控計算機(jī)監(jiān)控計算機(jī) 第二部分第二部分生物反應(yīng)器過程的多尺度理生物反應(yīng)器過程的多尺度理論論發(fā)酵過程優(yōu)化與放大發(fā)酵過程優(yōu)化與放大基礎(chǔ)基礎(chǔ) 利用微生物進(jìn)行產(chǎn)品生產(chǎn)利用微生物進(jìn)行產(chǎn)品生產(chǎn)抗生素、生物制藥、氨基酸

13、、核苷酸、有機(jī)酸、飼料添加劑、微生態(tài)制劑、生物農(nóng)藥、生物肥料等醫(yī)藥、化工、輕工、食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等行業(yè)醫(yī)藥、化工、輕工、食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等行業(yè)基因工程藥物、疫苗及抗體產(chǎn)品基因工程菌發(fā)酵基因工程菌發(fā)酵 提高產(chǎn)品的市場競爭能力，降低成本，提高產(chǎn)品的市場競爭能力，降低成本，提高質(zhì)量：提高質(zhì)量：過程優(yōu)化與小試放大過程優(yōu)化與小試放大 優(yōu)化：優(yōu)化：過分強(qiáng)調(diào)常規(guī)的菌種選育或基因過分強(qiáng)調(diào)常規(guī)的菌種選育或基因工程菌的構(gòu)建工程菌的構(gòu)建 放大：放大：采用化學(xué)工程常規(guī)的采用化學(xué)工程常規(guī)的靜態(tài)靜態(tài)方法方法 對于活體細(xì)胞調(diào)控來說，采用傳統(tǒng)的生對于活體細(xì)胞調(diào)控來說，采用傳統(tǒng)的生物學(xué)方法或化學(xué)工程的調(diào)控方法，存在很物學(xué)方法或

14、化學(xué)工程的調(diào)控方法，存在很大的問題，國內(nèi)外都沒有很好解決。大的問題，國內(nèi)外都沒有很好解決。生化工程工作者面前的任務(wù)：生化工程工作者面前的任務(wù)：* * 如何設(shè)法調(diào)節(jié)控制這種作用如何設(shè)法調(diào)節(jié)控制這種作用優(yōu)化優(yōu)化* * 按照經(jīng)濟(jì)原則將實驗室的控制結(jié)果擴(kuò)大到大型生產(chǎn)規(guī)模按照經(jīng)濟(jì)原則將實驗室的控制結(jié)果擴(kuò)大到大型生產(chǎn)規(guī)模放大放大 “發(fā)酵工程控制發(fā)酵工程控制”的出現(xiàn)的出現(xiàn) “內(nèi)部控制內(nèi)部控制”：如何可改變細(xì)胞的遺傳組成和細(xì)胞如何可改變細(xì)胞的遺傳組成和細(xì)胞“發(fā)酵工程控制發(fā)酵工程控制” 的代謝生理特性的代謝生理特性代謝工程代謝工程 “外部控制外部控制”：物理和化學(xué)環(huán)境條件控制物理和化學(xué)環(huán)境條件控制外部控制外部控

15、制是基于內(nèi)部控制調(diào)節(jié)，但是在研究和過渡的方法上又是基于內(nèi)部控制調(diào)節(jié)，但是在研究和過渡的方法上又是不同的，特別在抗生素類微生物次級代謝產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)上。是不同的，特別在抗生素類微生物次級代謝產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)上。 “發(fā)酵工程控制發(fā)酵工程控制”所面臨的任務(wù)之一，就是在已所面臨的任務(wù)之一，就是在已提供高產(chǎn)菌株的基礎(chǔ)上，如何把這些高產(chǎn)菌種在培養(yǎng)過程提供高產(chǎn)菌株的基礎(chǔ)上，如何把這些高產(chǎn)菌種在培養(yǎng)過程中進(jìn)一步中進(jìn)一步考察它的生理生化特性考察它的生理生化特性，穩(wěn)定或改進(jìn)，穩(wěn)定或改進(jìn)微生物反應(yīng)工藝過程，這里不僅要求對生物物性的動態(tài)有微生物反應(yīng)工藝過程，這里不僅要求對生物物性的動態(tài)有詳盡的了解，對生化反應(yīng)做詳盡的了

16、解，對生化反應(yīng)做定量的和動力學(xué)定量的和動力學(xué)方面方面的考察，還需具有的考察，還需具有工程學(xué)的技巧工程學(xué)的技巧，才能充分發(fā)掘和，才能充分發(fā)掘和利用生物體系的潛力。另一方面，計算機(jī)技術(shù)的高度發(fā)展利用生物體系的潛力。另一方面，計算機(jī)技術(shù)的高度發(fā)展也在客觀上為分析和優(yōu)化控制這種復(fù)雜的發(fā)酵過程提供基也在客觀上為分析和優(yōu)化控制這種復(fù)雜的發(fā)酵過程提供基礎(chǔ)，因此，借助于計算機(jī)系統(tǒng)對發(fā)酵過程進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，礎(chǔ)，因此，借助于計算機(jī)系統(tǒng)對發(fā)酵過程進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分析和控制就愈來愈成為人們的迫切要求。分析和控制就愈來愈成為人們的迫切要求。參數(shù)檢測技術(shù)要求越來越高：參數(shù)檢測技術(shù)要求越來越高：微生物學(xué)微生物學(xué)生物化學(xué)生物化學(xué)

17、分子生物學(xué)分子生物學(xué)發(fā)酵工藝學(xué)發(fā)酵工藝學(xué)化學(xué)工程化學(xué)工程現(xiàn)代控制理論現(xiàn)代控制理論各種工程開發(fā)各種工程開發(fā)參數(shù)檢測(自動或手工檢測)綜合性研究：綜合性研究：定性和定量的描述定性和定量的描述工業(yè)生產(chǎn)生化工程傳感器作為一個獨立的技術(shù)生化工程傳感器作為一個獨立的技術(shù)面被人們重視面被人們重視2.1 2.1 發(fā)酵過程對象與檢測特點發(fā)酵過程對象與檢測特點 發(fā)酵過程參數(shù)檢測的特點是與生物過程分不開的 生物反應(yīng)過程的基本特征是開放系統(tǒng)開放系統(tǒng) ，生物細(xì)胞不斷從外界環(huán)境中攝取物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，根據(jù)生命體固有的遺傳信息，在復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)節(jié)下進(jìn)行系列動態(tài)反應(yīng)，獲得生存所需的能量，并把代謝產(chǎn)物排出體外，從而生命得到維持。發(fā)

18、酵產(chǎn)物是在反應(yīng)過程中或終點產(chǎn)生的，作為物質(zhì)代謝綜合平衡的物質(zhì)。 微生物細(xì)胞代謝與環(huán)境過程示意圖微生物細(xì)胞代謝與環(huán)境過程示意圖 基因水平的信息流基因水平的信息流 細(xì)胞代謝流分布細(xì)胞代謝流分布的空間與時間特征的空間與時間特征 生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器 物料和能量供應(yīng)上對代物料和能量供應(yīng)上對代謝流產(chǎn)生影響謝流產(chǎn)生影響 當(dāng)前生物工程技術(shù)發(fā)展的特點是化學(xué)工程與生物技術(shù)的深度結(jié)合,微尺度的工程學(xué)觀點研究過程特性 宏觀宏觀 微觀微觀。生物細(xì)胞與環(huán)境之間的相互作用與適應(yīng)性生物細(xì)胞與環(huán)境之間的相互作用與適應(yīng)性工程水平工程水平細(xì)胞水平細(xì)胞水平分子水平分子水平工程水平級的問題：工程水平級的問題：化工過程中的三傳:熱量傳

19、遞、質(zhì)量傳遞、動量傳遞細(xì)胞水平級的問題：細(xì)胞水平級的問題：主要是胞內(nèi)酶系統(tǒng)及代謝過程的研究分子水平級的問題：分子水平級的問題：遺傳物質(zhì)的基因結(jié)構(gòu)及對蛋白質(zhì)、酶合成的調(diào)節(jié)機(jī)制，它們之間有著相互影響。過程檢測只能是環(huán)境中的狀態(tài)或操作量的變化值，通過進(jìn)一步分析，可以得到反應(yīng)細(xì)胞水平，乃至分子水平的生命變化的信息。隨時間而變化發(fā)酵過程動力學(xué)研究 建立數(shù)學(xué)模型（計算機(jī)輔助）檢測參數(shù)的特點 (1)只能測量環(huán)境（反應(yīng)器）中的狀態(tài)參數(shù)或操作變量 狀態(tài)參數(shù)（、氧化還原電位（、氧化還原電位 、 co2 co2 RedoxRedox, ,發(fā)酵液粘度、菌體量、基質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度等）發(fā)酵液粘度、菌體量、基質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃

20、度等） 直接影響菌體代謝 操作變量（功率輸入、通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速）（功率輸入、通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速） 間接影響菌體代謝 (2) 多樣性、時變性、相關(guān)耦合性、不確定性 (3)區(qū)分不同水平問題 工程水平問題工程水平問題 通氣攪拌與氧傳遞通氣攪拌與氧傳遞 KLa rpm , f Q KF(thtl) KLa KF 軸向流攪拌器軸向流攪拌器 富氧區(qū)、貧氧區(qū)、全釜混和與軸向流 空氣分布器與集流口空氣分布器與集流口 靜態(tài)混和、泰勒渦柱、強(qiáng)化軸向流、減少槳葉層數(shù)、減少槳葉直徑、降低功率消耗細(xì)胞水平細(xì)胞水平 代謝調(diào)節(jié)代謝調(diào)節(jié)* dc/dt =KLa( c*c)OUR* rpm KLa KLa ( c*-c) OUR

21、 dc/dt KLa( c*-c) dc /dt xC），菌的生產(chǎn)能力（q=比生產(chǎn)速率）降低，產(chǎn)物Q也不會高。5.3.1 比生長速率（）的控制 菌體生長動力學(xué) 生長速率與基質(zhì)濃度的關(guān)系 環(huán)境條件對生長的影響 細(xì)菌生長分裂繁殖方式 (C,P,N,DO,t) T,pH, 比生長速率概念： 在對數(shù)生長期，培養(yǎng)物的生物量（Biomass）是以恒定速率倍增，即在一定時間內(nèi)，細(xì)菌增加的速率是與單位體積中細(xì)胞數(shù)量或質(zhì)量或其它細(xì)胞成分的增加成比例的。 Dm/dt= mm m每毫升培養(yǎng)物中細(xì)胞質(zhì)量（g/ml) dN/dt= nN N-每毫升培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量（個/ml) dA/dt= aA A-每毫升培養(yǎng)物中任一

22、其它細(xì)胞成分的量（g/ml) m, n a 分別為細(xì)胞質(zhì)量、細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞某成分的比生長速率常數(shù)（1/t) 生長速率與基質(zhì)濃度的關(guān)系基質(zhì)為非限制性條件時，符合logist方程式： max(1-X/k)菌濃度x 各類微生物培增時間的分布 154590180360（分鐘）倍增時間td出現(xiàn)頻率細(xì)菌酵母霉菌原生動物 不同種類微生物生長速率不一樣，取決于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和生長機(jī)制。細(xì)胞結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，分裂所需時間越長。m也不同。 從logist方程式可看出，細(xì)胞濃度與比生長速率呈負(fù)相關(guān)現(xiàn)象，即細(xì)胞越多，細(xì)胞的生長越慢?？赡苁悄撤N毒副作用的代謝產(chǎn)物起作用?；|(zhì)為限制性條件時， 符合Monod等方程式: (營養(yǎng)

23、物質(zhì)濃度對生長速率的影響) m(S/Ks+S)Ks比生長速率為最大生長速率一半時勢底物濃度S限制生長的底物濃度 此公式類似于酶促反應(yīng)速率的米氏常數(shù)公式。一般來說，多數(shù)生長底物的Ks值是很低的，這表示微生物對底物的吸收有較高的親和力。當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r，即SKs，Ks+S=Ks, 則： mS/Ks 與S成正比，生長速率隨底物濃度增加而提高。 當(dāng)?shù)孜餄舛群芨邥r，則KS，得 mS/（KsS），此時生長速率等于最大生長速率。 mSm/2Ks微生物生長速率與限制性營養(yǎng)物濃度的關(guān)系生物過程的混沌現(xiàn)象 在發(fā)酵初期菌體處于logist菌群增殖函數(shù)生長時，由于引入階數(shù)的增加，菌體濃度隨著滯后時間的增大已經(jīng)有了明顯

24、的振蕩，不再是單純指數(shù)型單純指數(shù)型了，如果在發(fā)酵過程發(fā)生底物或產(chǎn)物抑制底物或產(chǎn)物抑制，以及代謝途徑的改變，那么發(fā)生在不同水平的調(diào)控，更可能表現(xiàn)出過程的多態(tài)性和不穩(wěn)定性多態(tài)性和不穩(wěn)定性，振蕩表現(xiàn)出來的非線性已不能用Monod方程描述。當(dāng)當(dāng)環(huán)境條件發(fā)生變化環(huán)境條件發(fā)生變化時，發(fā)酵過程將會發(fā)生時，發(fā)酵過程將會發(fā)生周期、倍周期、倍周期周期分岔直至混沌。分岔直至混沌。即輸入的初始條件極細(xì)微小的差別會產(chǎn)生模擬結(jié)果的巨大變化 控制混純可以得到我們所需要的細(xì)胞生理狀態(tài)。由于混沌系控制混純可以得到我們所需要的細(xì)胞生理狀態(tài)。由于混沌系統(tǒng)對初值的敏感性，只應(yīng)用較小的控制信號就可以駕駛系統(tǒng)按照統(tǒng)對初值的敏感性，只應(yīng)用

25、較小的控制信號就可以駕駛系統(tǒng)按照預(yù)期的方向發(fā)展預(yù)期的方向發(fā)展 混沌混沌是非線性系統(tǒng)所特有的一種運動形態(tài)。它是確定性系統(tǒng)里由于內(nèi)稟隨機(jī)性而產(chǎn)生的貌似無序的復(fù)雜運動 由細(xì)胞代謝物質(zhì)流所引起的一系列變化，生物反應(yīng)器的物料流變化的參數(shù)相關(guān)特性。 當(dāng)前生化工程技術(shù)發(fā)展特點是化學(xué)工程與生物技術(shù)的深度結(jié)合，由宏觀推向微觀。強(qiáng)調(diào)在生物技術(shù)深入發(fā)展的認(rèn)識基礎(chǔ)上，以工程學(xué)的觀點研究過程特點。 微尺度的局部過量：T、gln、pH、PCO2 ，基因工程E.Col2,高密度高表達(dá)gln物料流、DO 細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的工程學(xué)觀點： 代謝工程化學(xué)工程，生物反應(yīng)器工程 紅霉素發(fā)酵優(yōu)化生物合成發(fā)酵工藝控制第四部分第四部分發(fā)酵過程

26、優(yōu)化控制舉例發(fā)酵過程優(yōu)化控制舉例鳥苷發(fā)酵過程優(yōu)化與多尺度研究鳥苷發(fā)酵過程優(yōu)化與多尺度研究 鳥苷是呈味核苷酸二鈉鳥苷是呈味核苷酸二鈉“I+GI+G”的重要原料，的重要原料，七十年代上海工業(yè)微生物研究所開始研究七十年代上海工業(yè)微生物研究所開始研究 發(fā)酵水平：發(fā)酵水平：7 7克克/ /升升 1212克克/ /升升 沒有形成產(chǎn)業(yè)沒有形成產(chǎn)業(yè) 廣東星湖公司從工微所購買上述菌株，經(jīng)廣東星湖公司從工微所購買上述菌株，經(jīng)過多年研究開發(fā)：過多年研究開發(fā)： 發(fā)酵水平：發(fā)酵水平： 1212克克/ /升升 1616克克/ /升升16g/L 25g/L （盈虧持平）（盈虧持平）參數(shù)相關(guān)分析與狀態(tài)方程建立參數(shù)相關(guān)分析與狀

27、態(tài)方程建立 通過鳥苷發(fā)酵過程的數(shù)據(jù)采集發(fā)現(xiàn)：通過鳥苷發(fā)酵過程的數(shù)據(jù)采集發(fā)現(xiàn)： 4040小時小時OUROUR下降，補(bǔ)糖速率不變，下降，補(bǔ)糖速率不變， 鳥苷產(chǎn)率迅速下降鳥苷產(chǎn)率迅速下降代謝流遷移代謝流遷移狀態(tài)方程建立與系統(tǒng)識別狀態(tài)方程建立與系統(tǒng)識別 生物反應(yīng)器：測量觀察值生物反應(yīng)器：測量觀察值多尺度：細(xì)胞代謝流多尺度：細(xì)胞代謝流17 種氨基酸的時序變化種氨基酸的時序變化 紙層析分析紙層析分析有機(jī)酸的積累有機(jī)酸的積累 35小時：丙酮酸、丙氨酸積累小時：丙酮酸、丙氨酸積累 代謝途徑遷移的酶學(xué)測試代謝途徑遷移的酶學(xué)測試 HMPHMP途經(jīng)途經(jīng)EMPEMP途經(jīng)途經(jīng)磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶 磷酸葡萄糖脫氫酶磷

28、酸葡萄糖脫氫酶 丙酮酸激酶丙酮酸激酶 檸檬酸合成酶檸檬酸合成酶 丙氨酸脫氫酶丙氨酸脫氫酶 化學(xué)計量學(xué)方法的代謝流研究化學(xué)計量學(xué)方法的代謝流研究代謝網(wǎng)絡(luò)的代謝反應(yīng)式代謝網(wǎng)絡(luò)的代謝反應(yīng)式 代謝方程組代謝方程組 在線檢測通氣流量、發(fā)酵液體積、排氣氧和二氧在線檢測通氣流量、發(fā)酵液體積、排氣氧和二氧化碳濃度化碳濃度離線常規(guī)分析菌體、葡萄糖和產(chǎn)物濃度離線常規(guī)分析菌體、葡萄糖和產(chǎn)物濃度HPLC測定乙酸、檸檬酸和丙酮酸等有機(jī)酸濃度測定乙酸、檸檬酸和丙酮酸等有機(jī)酸濃度HPLC測定丙氨酸等測定丙氨酸等17種氨基酸濃度種氨基酸濃度代謝網(wǎng)絡(luò)的代謝反應(yīng)式代謝網(wǎng)絡(luò)的代謝反應(yīng)式 檸檬酸草酰乙酸丙酮酸核酮糖5P鳥苷磷酸甘油酸

29、磷酸烯醇丙酮酸磷酸甘油醛蘋果酸酮戊二酸代謝方程組代謝方程組 6磷酸葡萄糖酸脫氫酶核酮糖5P鳥苷酮戊二酸不同時間代謝流分布不同時間代謝流分布 HMPEMP丙氨酸丙氨酸代謝代謝流：流：HMPEMP丙氨酸丙氨酸HMP葡萄糖六磷酸葡萄糖脫氫酶EMP葡萄糖磷酸果糖激酶丙氨酸丙氨酸葡萄糖菌體生理形態(tài)變異與代謝流遷移的相關(guān)性菌體生理形態(tài)變異與代謝流遷移的相關(guān)性生理特性的狀態(tài)估計生理特性的狀態(tài)估計 菌體形態(tài)變化菌體形態(tài)變化 菌體變異的定量分析與研究菌體變異的定量分析與研究圖像采集與處理圖像采集與處理彎度大于彎度大于0.5 彎度大于彎度大于1.0 鳥苷生產(chǎn)菌中嘌呤核苷合成途徑三段鳥苷生產(chǎn)菌中嘌呤核苷合成途徑三段

30、基因序列的分析基因序列的分析 嘌呤核苷生物合成與對應(yīng)的基因操縱子嘌呤核苷生物合成與對應(yīng)的基因操縱子 IMP環(huán)水解酶IMP脫氫酶磷酸核糖焦磷酸甲酰甘氨酰胺核苷酸天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶5氨基4氨甲酰咪唑核苷酸肌苷肌苷酸鳥苷酸生產(chǎn)菌的遺傳背景研究生產(chǎn)菌的遺傳背景研究 對編碼肌苷鳥苷生物合成途徑中關(guān)鍵酶的對編碼肌苷鳥苷生物合成途徑中關(guān)鍵酶的基因進(jìn)行研究：基因進(jìn)行研究： purpur操縱子的啟動子部分序列（操縱子的啟動子部分序列（purpur操縱子包操縱子包含嘌呤生物合成途徑中有關(guān)的含嘌呤生物合成途徑中有關(guān)的1212個基因）個基因） purApurA基因（編碼基因（編碼AMPAMP支路的支路的sAMPsAM

31、P合成酶）合成酶） guaAguaA基因（編碼基因（編碼GMPGMP支路的支路的GMPGMP合成酶）合成酶） guaBguaB基因（編碼基因（編碼GMPGMP支路的支路的IMPIMP脫氫酶）脫氫酶） 根據(jù)根據(jù)GenebankGenebank中已公布的枯草桿菌基因組中已公布的枯草桿菌基因組序列，針對所要研究的四段序列，設(shè)計適當(dāng)序列，針對所要研究的四段序列，設(shè)計適當(dāng)?shù)囊锖铣苫?。的引物合成基因?分別從下列四個菌株中用分別從下列四個菌株中用PCRPCR拉出上述序列：拉出上述序列：野生型枯草桿菌（野生型枯草桿菌（160160）低產(chǎn)型肌苷生產(chǎn)菌低產(chǎn)型肌苷生產(chǎn)菌71917191（161161）目前肌苷

32、生產(chǎn)菌（目前肌苷生產(chǎn)菌（162162）目前鳥苷生產(chǎn)菌（目前鳥苷生產(chǎn)菌（163163）Genebank研究結(jié)果研究結(jié)果 肌苷和鳥苷生產(chǎn)菌在肌苷和鳥苷生產(chǎn)菌在5454位（以翻譯起始位（以翻譯起始點為點為1 1計）缺失了一個計）缺失了一個A A，因此將導(dǎo)致以下，因此將導(dǎo)致以下的所有的所有序列序列發(fā)生移碼突變，所編碼的發(fā)生移碼突變，所編碼的sAMPsAMP合成酶失活合成酶失活，致使致使AMPAMP合成支路受阻，有利合成支路受阻，有利于肌苷和鳥苷的積累。這可能是導(dǎo)致生產(chǎn)于肌苷和鳥苷的積累。這可能是導(dǎo)致生產(chǎn)菌株產(chǎn)苷水平升高的一個重要原因。菌株產(chǎn)苷水平升高的一個重要原因。結(jié)結(jié) 論論 從鳥苷生產(chǎn)菌的基因比較研

33、究結(jié)果，鳥從鳥苷生產(chǎn)菌的基因比較研究結(jié)果，鳥苷生產(chǎn)菌株苷生產(chǎn)菌株已具有高產(chǎn)菌的基因結(jié)構(gòu)已具有高產(chǎn)菌的基因結(jié)構(gòu)，而發(fā)，而發(fā)酵過程中菌體細(xì)胞的酵過程中菌體細(xì)胞的主流代謝流的遷移是提主流代謝流的遷移是提高生產(chǎn)能力的主要矛盾。高生產(chǎn)能力的主要矛盾?？绯叨确治雠c工藝改進(jìn)跨尺度分析與工藝改進(jìn) 確定以代謝流由確定以代謝流由EMPEMP向向HMPHMP途徑途徑回復(fù)遷移為回復(fù)遷移為目標(biāo)進(jìn)行過程工藝優(yōu)化，并以目標(biāo)進(jìn)行過程工藝優(yōu)化，并以O(shè)UROUR的下降的下降作為作為跨尺度操作的相關(guān)因子跨尺度操作的相關(guān)因子 發(fā)現(xiàn)調(diào)控因子加入后短期內(nèi)發(fā)現(xiàn)調(diào)控因子加入后短期內(nèi)OUROUR的下降速度的下降速度就開始放慢，到就開始放慢，到

34、4848小時開始維持穩(wěn)定直至放罐，小時開始維持穩(wěn)定直至放罐，并且發(fā)酵后期的糖耗速率也變慢并且發(fā)酵后期的糖耗速率也變慢 代謝流控制代謝流控制工藝改進(jìn)前后的酶活時序變化工藝改進(jìn)前后的酶活時序變化 工藝改進(jìn)前后葡萄糖激酶時序變化00.020.040.060.080.10.1212h24h36h40h44h48ht / hA/min原工藝新工藝工藝改進(jìn)前后磷酸果糖激酶的時序變化00.0050.010.0150.020.0250.030.0350.040.0450.0512h24h36h40h44h48ht / hA/min原 工 藝新 工 藝工藝改進(jìn)前后6-磷酸葡萄糖脫氫酶的時序變化00.0050.0

35、10.0150.020.0250.030.0350.040.0450.0512h24h36h40h44h48ht / hA/min原 工 藝新 工 藝工藝改進(jìn)前后丙氨酸脫氫酶的時序變化00.10.20.30.412h24h36h40h44h48ht / h酶活力原 工 藝新 工 藝工藝改進(jìn)前后的代謝流時序變化工藝改進(jìn)前后的代謝流時序變化 HMPEMP丙氨酸丙氨酸結(jié)結(jié) 果果創(chuàng)建了全新的補(bǔ)料控制工藝創(chuàng)建了全新的補(bǔ)料控制工藝 50L50L發(fā)酵罐：發(fā)酵罐： 17.217.2克克/L 32/L 32克克/L(60/L(60小時小時) )菌體細(xì)胞主流代謝流遷移問題是過程優(yōu)化的關(guān)鍵。菌體細(xì)胞主流代謝流遷移問

36、題是過程優(yōu)化的關(guān)鍵?；蚬こ倘搜灏椎鞍谆蚬こ倘搜灏椎鞍?rh-SA)(rh-SA)趨勢曲線圖趨勢曲線圖 50L實驗室：700mg/L-7g/L，放大到500L基因工程瘧疾疫苗高密度高表達(dá)基因工程瘧疾疫苗高密度高表達(dá)70mg/L-2.6g/L華蒙金河生物技術(shù)有限公司的生產(chǎn)車間現(xiàn)場（50L放大到120M3），從2000年9月至2001年3月間，飼料金霉素發(fā)酵從16000u/ml提高到21000u/ml，新增利潤1176萬元，新增創(chuàng)匯883萬元。遠(yuǎn)程通訊與異地數(shù)據(jù)傳送與分析遠(yuǎn)程通訊與異地數(shù)據(jù)傳送與分析 DO-發(fā)酵液中溶解氧濃度、OUR-菌體代謝耗氧速率、CER-二氧化碳釋放速率、RQ-呼吸商-

37、代謝途徑、KLa-生物反應(yīng)器中氧傳遞速率、pH酸堿度、菌體濃度、等40多個參數(shù)9-25小時之間 RQ呈低谷狀 必需限制補(bǔ)葡萄糖推廣應(yīng)用0-8小時 : OUR、CER、DO、pH、RQ、F 不同水平8.9小時 : OUR與CER繼續(xù)上升呈分枝態(tài)； pH迅速上升 RQ呈低谷狀 非葡萄糖碳源利用； 25小時前: 必需限制補(bǔ)加葡萄糖速率(RGLU) 5000 u/ml 基因水平基因水平(Science,2001,293(5530):614)嚴(yán)緊響應(yīng)嚴(yán)緊響應(yīng) (stringent response)營養(yǎng)缺乏起動營養(yǎng)缺乏起動 終止RNA在胞內(nèi)積累， (p)ppGpp的啟動表達(dá)合成(p)ppGpp合成酶（嚴(yán)緊響應(yīng)因子）合成酶（嚴(yán)緊響應(yīng)因子）ppGpp pppGpp抗生素抗生素 菌絲分化菌絲分化DNAmRNA核糖體空載空載 tRNAtRNA(氨基酸缺乏)5黃豆餅粉的