亞洲韌皮桿菌在單株臍橙病樹的分布情況

1、亞洲切皮桿菌在單株臍橙病樹的分布情況組織CLas含量差異較明顯，其中果實(shí)隔膜W中柱的病原菌含量最高?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】HLB病原菌早期檢測最常用的是PCR技術(shù)，包括PCR和實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）,其中qPCR實(shí)時收集熒光信號，耗時短，靈敏度比常規(guī)PCR高兩極量級（Tatinenietal.,2008目前，運(yùn)用qPCR相對定量法（2-AACt）研究柑橘黃龍病菌在病樹中含量差異的研究鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以田間13個枝條表現(xiàn)葉片斑駁黃化的整株紐荷爾臍橙病樹為主要研究對象,分別運(yùn)用PCR和qPCR進(jìn)行檢測，分析亞洲韌皮桿菌（CLas）在病樹中的含量分布;合贛州章貢區(qū)一失管果園大量果樹表

2、現(xiàn)的同一枝條上出現(xiàn)無癥狀葉片和有癥狀果實(shí)的現(xiàn)象,采用常規(guī)PCR分別檢測典型病果和相應(yīng)葉片，以掌握CLas在病樹、病果及相應(yīng)無癥狀葉片中的分布情況，探索更佳的取樣和檢測方法，為柑橘黃龍病早期檢測和防控提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1 試驗材料試驗于2014年11月在國家臍橙工程技術(shù)研究中心進(jìn)行，陰、陽性對照均取自國家臍橙工程技術(shù)研究中心玻璃溫室。感病臍橙葉片樣品采集：樣品取自贛州市章貢區(qū)儀豐果園，樹齡4年。田間選取初期觀察到僅13個枝條出現(xiàn)典型斑駁黃化葉片的紐荷爾臍橙果樹，病樹主干發(fā)出5個主枝分別編號A、B、C、D、E（圖1）,取同一分支的葉片為1個樣品，其中A（44份樣品1B（26份樣品C（2

3、4份條樣品）為斑駁黃化葉片主枝，D（30份樣品1E（30份樣品）為無癥狀葉片主枝，共取樣154份。HLB病果和無癥狀葉片樣品采集：田間選取贛州章貢區(qū)某失管果園不同果樹表現(xiàn)典型HLB病果但葉片無癥狀的結(jié)果枝，每枝條取56個葉片作為1個樣品，共取樣96份，同時采集相應(yīng)結(jié)果枝的病果96份(圖211.2 PCR及qPCR檢測樣品總DNA提取采用改良CTAB-Triton法(蘇華楠等，2014PCR檢測引物為Las606/LSS,序列見表1。PCR反應(yīng)體系25.0pL:DNA模板1.0pL,10xBuffer緩沖液2.5pL,10mmol/LdNTPs0.5pL,10pmol/L上、下游引物各0.5pL

4、,5U/pLrTaqDNA聚合酶0.3yL,ddH2O,19.7pL0擴(kuò)增程序:95預(yù)變性3min;9530s,55°C30s,7230s,進(jìn)行30個循環(huán);72延伸7min0qPCR檢測引物和內(nèi)參引物分別為f-rpILAs/r-rpILAs和UPL7-F/UPL7-R,序列見表1,檢測基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率基本一致。每個樣品重復(fù)3次，每次反應(yīng)均設(shè)置內(nèi)對照和無模板混合液對照，以國家臍橙工程技術(shù)研究中心玻璃溫室保存的陽性樣品為內(nèi)對照。qPCR反應(yīng)體系15.0pL:iTaqTMUniversalSYBRPremix(2xcone.)7.5pL,ddH2O5.3pL,10pmol/L上、下

5、游引物各0.6pL,模板1.0口1_。擴(kuò)增程序：95預(yù)變性30s;95°C5s,6430s,采集熒光信號，進(jìn)行40個循環(huán)；鬲懈曲線：95°C10s,675s,每加0.55s,9515s。反應(yīng)在ABIStep-One儀器上運(yùn)行。1.3 CLas相對定量分析qPCR數(shù)據(jù)運(yùn)用2-AACt法分析。3個重復(fù)達(dá)到設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)即Ct差距在1以內(nèi)的取平均值；若3個重復(fù)均無擴(kuò)增或兩次未擴(kuò)增，一次Ct>35,均視為陰性；否則重新進(jìn)行試驗。以CLas含量最低的樣品為參照用Excel2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理參照Livak和Schmittgen(2001)對qPCR分析基因表達(dá)的相對定量采用2

6、-AACt進(jìn)行分析，為使結(jié)果更直觀取Ig2（-AACt）為縱坐標(biāo)表示各檢測樣品的相對含菌量制圖，即縱坐梯由的數(shù)值n相當(dāng)于病原菌CLas相對含量為10n,并用AdobeIllustratorCC繪制各枝條葉片病菌分布圖。1.4病果與無癥狀葉片CLas檢測運(yùn)用PCR封96份病果和相應(yīng)的96份無癥狀葉片進(jìn)行檢測，引物為Las606/LSS,反應(yīng)程序和體系同1.2。2結(jié)果與分析2.1PCR和qPCR對病樹樣品的檢測效果比較PCR對A、B、C3個斑駁黃化枝條陽性檢出率分別為88.57%、61.11%和54.17%，而qPCR對A、B、C3個枝條的陽性檢出率均為100.00%;PCR對D、E2個枝條的陽性

7、檢出率分另U為6.67%和0,而qPCR對二者的陽性檢出率分別為40.00%和13.33%。此夕卜，qPCR檢測結(jié)果覆蓋了PCR的檢測結(jié)果,如樣品C1C21,PCR檢測結(jié)果僅Cl、C2、C7、C13、C17C21呈陽性（圖3）,而qPCR檢測結(jié)果為ClC21均呈陽性（圖5）,說明qPCR較PCR更靈敏。2.2感病樹體CLas相對含量分析由圖4可知，A、B和C枝條所有樣品中均能檢測到CLas存在，A枝條葉片整體相對含菌量高于B和C枝條，D、E枝條只有部分葉片檢出有CLas存在，其中E枝條30個樣品中僅有4個檢測到CLas,各枝條的CLas最高含菌量與最低含菌量相差1041010倍。說明CLas主

8、要分布在下部有斑駁黃化枝條樣品中，在上部無癥狀枝條樣品中分布較少。對照圖4和圖5中各枝條的采樣點(diǎn)整體上分析，發(fā)現(xiàn)主枝A、B近主干端的樣品CLas相對含量更高，樹冠外圍含量稍低，主枝C中C17C24所在側(cè)枝的整體CLas相對含量高于該主枝的其他樣品，主枝D、E也有部分樣品檢測到CLas，說明CLas普遍存在于感病樹體內(nèi)。2.3病果及無癥狀葉片感病情況經(jīng)PCR檢測發(fā)現(xiàn)，HLB病果陽性檢出率為100.00%,無癥狀葉片陽性檢出率為60.40%。HLB病果陽性率高于無癥狀葉片，且看似無癥狀的葉片，實(shí)則已感染HLB03討論（1）斑駁黃化樣品病原菌含量比無癥狀樣品高。斑駁黃化枝條A、B、C病原菌相對含量比

9、無癥狀枝條D、E相對含量高，同一結(jié)果枝上的病果比無癥狀葉片陽性檢出率約高40.00%。由此可見，表現(xiàn)典型癥狀樣品的病原菌相對含量和陽性檢出率均高于無癥狀樣品,與Teixeira等（2008）的研究結(jié)果一致。本研究將整株樹分為5個部分，A、B、C為近地面枝條,D、E為遠(yuǎn)地面枝條，前者斑駁黃化癥狀明顯，后者無癥狀,熒光定量檢測表明前者樣品全部感病，后者樣品部分感病,前者的整體病原菌相對含量高于后者。（2）病原菌分布不均勻。病樹樣品病原菌相對含量相差達(dá)1041010倍，與Li等（2009）的研究結(jié)果相似。Li等（2009）發(fā)現(xiàn)田間自然感染CLas的果樹地上部分和根部組織病原菌相對含量可達(dá)1010個/

10、g,同一樹體的不同組織含量差異較明顯。本研究中，D、E枝條有少部分樣品感病，其中D22和E21的病原菌相對含量甚至高于A、B、C中的大部分樣品，說明CLas在病樹體內(nèi)分布不均勻,與Tatineni等（2008）的研究結(jié)果一致。分析A、B、C的病原菌相對含量發(fā)現(xiàn)，近主干端比遠(yuǎn)主干端含量更高,推測這些枝條的病原菌可能由根部移動而來。Johnson等（2014）發(fā)現(xiàn)樹體經(jīng)帶菌木虱刺吸取食后會在根部有相對較高的病原菌含量，在HLB癥狀嚴(yán)重的病樹上發(fā)現(xiàn)根部組織已大部分死亡,因此推測CLas由根部傳向其他部位。但Ding等（2015）用DTBIA方法研究了CLas在柑橘和長春花中的含量,結(jié)果表明葉柄含菌量

11、最高、根部圖氐，與陳傳武等（2015）的研究結(jié)果一致。因此，CLas在同一樹體不同組織或不同部位含量差異很明顯,且分布不均勻，而關(guān)于根部病原菌含量高低及傳播機(jī)制等問題尚有待進(jìn)一步探索。(3)對未顯癥葉片原因的探討。2014年臍橙采摘期，在贛南地區(qū)的果園發(fā)現(xiàn)一些果樹葉片無HLB癥狀，但果實(shí)表現(xiàn)典型癥狀現(xiàn)象。對兼有HLB病果和無癥狀葉片的結(jié)果枝的研究發(fā)現(xiàn),無癥狀葉片有高達(dá)60.40%的陽性檢出率，無癥狀葉片陽性葉片可能早期已經(jīng)感病，但處于潛伏期，直到果實(shí)成熟后才在果實(shí)表現(xiàn)癥狀。Faghihi等(2009)和Garcia-Perez等(2013)的研究結(jié)果表明,HLB在田間卻大樹后，潛伏期可能長達(dá)5

12、年以上,通過柑橘木虱傳播的CLas潛伏期階段存在很大不確定性。因此，葉片是否表現(xiàn)癥狀與潛伏期長短有關(guān),但CLas普遍存在于染病樹體內(nèi)。在柑橘生產(chǎn)中，對于病樹不能只砍病枝，應(yīng)完全砍除病株銷毀，以絕后患。(4)病原菌含量隨季節(jié)而變化。有關(guān)CLas含量隨季節(jié)變化的研究也有報道，不同月份病樹體內(nèi)CLas含量變化較大，一年中CLas含量最高的季節(jié)是秋季，此時Ct最低,斑駁癥狀最明顯(Saueretal.,20151胡浩(2007)的研究結(jié)果表明，CLas在病樹體內(nèi)10月含量最高，之后隨時間的推移而降低，推測冬季低溫對CLas的繁殖和木虱的傳播有明顯的抑制作用。4結(jié)論本研究結(jié)果表明,HLB侵染臍橙果樹后病

13、原菌普遍存在于病樹體內(nèi)，但分布不均勻，在有癥狀的樣品中病原菌相對含量整體上比無癥狀的樣品高。在早期檢測時，應(yīng)選取典型或疑似癥狀樣品采用qPCR進(jìn)行檢測，若檢測結(jié)果為感染HLB,則應(yīng)將病株整株銷毀。參考文獻(xiàn)：陳傳武，付慧敏，鄧崇嶺，李賢良，鄧光宙，婁兵海.2015.柑橘和黃皮中黃龍病菌含量動態(tài)變化J.南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，46(6):1024-1028.ChenCW,FuHM,DengCL,LiXL,DengGZ,LouBH.2015.Dynamicvariationof Huanglongbing pathogen content in citrus and wampeeJ. Journal of S

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