外泌體最新研究進(jìn)展 成像流式的新發(fā)現(xiàn)

1、外泌體最新研究進(jìn)展 成像流式的新發(fā)現(xiàn)外泌體是一種直徑為30-100nm的納米級(jí)脂質(zhì)包裹體結(jié)構(gòu)，內(nèi)部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物質(zhì)。包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的幾乎所有類型的細(xì)胞，都可以產(chǎn)生并釋放外泌體。外泌體由細(xì)胞分泌釋放出來，在血液等體液內(nèi)傳播，最后又可被其他細(xì)胞吞噬，是細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)。越來越多的證據(jù)表明，宿主細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體參與了腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間通過外泌體進(jìn)行信息交換，這種通訊方式在調(diào)節(jié)腫瘤免疫中發(fā)揮了雙重作用。外泌體既可以通過抑制免疫細(xì)胞（DCs、NK細(xì)胞、CD4+ 和CD8+ T細(xì)胞等）引發(fā)的抗腫瘤反應(yīng)，以及誘導(dǎo)免疫抑制或調(diào)節(jié)細(xì)胞群

2、（MDSCs、Tregs和Bregs）的免疫抑制。外泌體產(chǎn)生過程的示意圖：Ectosomes and exosomes: shedding the confusion between extracellular vesiclesEmanuele Cocucci and Jacopo Meldolesi, Trends in Cell Biology, June 2015. Vol. 25. No.6過去研究外泌體的主要工具包括Nanosight、Apogee、confocal和傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀。這幾種工具各有優(yōu)點(diǎn)，也都具有其局限性，如Nanosight、Apogee和傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀只能檢測(cè)外泌體

3、顆粒，測(cè)量外泌體的濃度，對(duì)外泌體進(jìn)行定量。無法研究細(xì)胞與外泌體的相互作用以及外泌體功能；confocal可以拍攝到細(xì)胞分泌和吞噬外泌體，但是因?yàn)槿狈线m的量化參數(shù)，無法對(duì)吞噬過程進(jìn)行量化分析，也無法定量產(chǎn)生的外泌體。而且confocal的通量太低，結(jié)果也可能存在人為偏倚性而不夠客觀。，很好地解決了上述研究手段存在的問題，是目前為止研究外泌體產(chǎn)生機(jī)理及外泌體功能的最佳方法。Amnis能夠同時(shí)采集12個(gè)檢測(cè)通道中的細(xì)胞和顆粒物圖像，其中包括明場(chǎng)、暗場(chǎng)，以及10個(gè)熒光通道。Amnis每個(gè)檢測(cè)通道都有100余種量化參數(shù)，如面積、直徑、長(zhǎng)度、厚度、細(xì)胞短軸與長(zhǎng)軸比值、熒光強(qiáng)度等等，這些參數(shù)可以提供傳統(tǒng)流

4、式和顯微成像設(shè)備都不具備的量化統(tǒng)計(jì)學(xué)功能，獲得全新的細(xì)胞或顆粒物量化統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)。Amnis采用最先進(jìn)的用于航空遙拍的TDI CCD（Time Delay Integrated CCD）收集熒光信號(hào)，可以采集到液流中快速移動(dòng)的細(xì)胞和小顆粒物的清晰圖像，對(duì)數(shù)萬乃至數(shù)以十萬的細(xì)胞或小顆粒物的熒光信號(hào)進(jìn)行量化分析。Amnis既具有顯微成像的功能，可以呈現(xiàn)細(xì)胞和小顆粒物的細(xì)節(jié)，又具有對(duì)海量數(shù)據(jù)進(jìn)行快速分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)功能。因此，Amnis量化成像流式細(xì)胞分析技術(shù)可以為外泌體的研究提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。一， 定量檢測(cè)樣本中的外泌體過去十年間，外泌體研究成為新的研究熱點(diǎn)，人們意識(shí)到微小的外泌體在生物體中扮演了非

5、常重要的角色，例如外泌體參與了從凝血到細(xì)胞間信息交流等各種生理過程，而且外泌體與動(dòng)脈硬化、風(fēng)濕和腫瘤等疾病相關(guān)。因此外泌體有望成為疾病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)估或者臨床診斷的工具。由于外泌體的直徑只有幾十納米，而且產(chǎn)生外泌體的樣本復(fù)雜多樣，因此迫切需要開發(fā)一種可以精確定量檢測(cè)樣本中外泌體的技術(shù)。量化成像流式細(xì)胞技術(shù)因其靈敏度高、通量高、檢測(cè)樣本量低，并且適合檢測(cè)全血、血漿、白細(xì)胞上清液等復(fù)雜的樣本，成為定量檢測(cè)細(xì)胞分泌產(chǎn)生外泌體的最佳研究工具?！癈utting-Edge Analysis of ExtracellularMicroparticles using ImageStreamX Imaging Flow

6、 Cytometry”文章中報(bào)道了利用Amnis檢測(cè)到了直徑20nm微珠的熒光信號(hào)，并拍攝到了直徑為100nm的微珠的圖像。這個(gè)結(jié)果也證明了Amnis的靈敏度和圖像分辨率足夠檢測(cè)直徑范圍在30-100nm的外泌體。此外，文章中還定量檢測(cè)了嗜中性粒細(xì)胞受到TNF-刺激后產(chǎn)生的微囊泡，以及隨著TNF-刺激時(shí)間延長(zhǎng)，微囊泡生成的動(dòng)力學(xué)曲線。這些微囊泡中就包含了外泌體。利用熒光抗體標(biāo)記母體細(xì)胞，可以通過微囊泡攜帶的熒光標(biāo)記，定量分析微囊泡的來源。文章中檢測(cè)了6個(gè)健康供體血漿中的微囊泡，并對(duì)這些不同來源的微囊泡進(jìn)行了定量分析。二， 研究外泌體與腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的互作外泌體因其來源不同而功能各異，有

7、些可以刺激免疫反應(yīng)，有些可以抑制免疫反應(yīng)，有些具有誘導(dǎo)免疫耐受的作用?！癊xosomes Containing Glycoprotein 350 Released by EBV-Transformed B Cells Selectively Target B Cells through CD21 and Block EBV Infection In Vitro”主要研究了來源不同的外泌體是否可以選擇性地被人類外周血中不同的免疫細(xì)胞吞噬。文章中分別富集了來源于DC細(xì)胞、LCL1細(xì)胞以及人奶中的外泌體，并把這些不同來源的外泌體用PKH67標(biāo)記后，與人外周血單個(gè)核細(xì)胞孵育。Amnis具有100多種量

8、化參數(shù)，可以定量分析許多顯微成像設(shè)備無法定量分析的內(nèi)容，例如細(xì)胞的形態(tài)變化、細(xì)胞內(nèi)吞等。Amnis的內(nèi)吞參數(shù)（Internalization）主要用來測(cè)量細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞外的熒光比值，內(nèi)吞參數(shù)值越大，代表細(xì)胞吞噬了更多的顆粒物。如上圖所示，綠色標(biāo)記的外泌體主要被HLA-DR+ CD14+單核細(xì)胞吞噬，有些外泌體粘附在細(xì)胞膜表面，有些外泌體進(jìn)入細(xì)胞后移動(dòng)到細(xì)胞中心位置，Amnis可以準(zhǔn)確區(qū)分上述兩種情況。通過統(tǒng)計(jì)分析不同來源的外泌體被單核細(xì)胞吞噬的情況，作者發(fā)現(xiàn)DC細(xì)胞和人奶來源的外泌體更容易被單核細(xì)胞吞噬，而LCL1來源的外泌體則與單核細(xì)胞親和度不高。三， 研究腫瘤細(xì)胞對(duì)外泌體吞噬功能膀胱癌是常見

9、的非皮膚源性惡性腫瘤，近年來膀胱癌的發(fā)病率呈現(xiàn)穩(wěn)步上升態(tài)勢(shì)，可是對(duì)于膀胱癌的早期檢測(cè)以及風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)方面的研究卻進(jìn)展緩慢。此外，膀胱癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移也是威脅患者生命的重要因素。因此，迫切需要確認(rèn)新的生物標(biāo)志物，研究膀胱癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制，可以為膀胱癌的治療指明方向。有文獻(xiàn)報(bào)道膀胱癌細(xì)胞可以產(chǎn)生外泌體，這些外泌體中含有對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移起到重要作用的蛋白?！癈haracterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells”文章中利用Amnis檢測(cè)了膀胱癌細(xì)胞對(duì)外泌體的內(nèi)吞，證明了內(nèi)吞作用是隨著外泌體的數(shù)量增加和時(shí)間

10、延長(zhǎng)而增多，而且文章還發(fā)現(xiàn)內(nèi)吞作用受到到肝素鈉的阻斷。圖中黃色的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)是PKH26標(biāo)記的外泌體，Amnis的計(jì)點(diǎn)（spot count）模塊可以自動(dòng)統(tǒng)計(jì)特定區(qū)域內(nèi)的點(diǎn)狀熒光信號(hào)的數(shù)量，這些點(diǎn)狀熒光信號(hào)即可代表外泌體的信號(hào)。利用計(jì)點(diǎn)模塊可以定量膀胱癌細(xì)胞中吞入的外泌體的數(shù)量。三， 研究吞噬外泌體后細(xì)胞形態(tài)功能等方面的變化除了前文中介紹的Amnis量化成像流式細(xì)胞技術(shù)的內(nèi)吞模塊、計(jì)點(diǎn)模塊以外，還具有細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞形變、蛋白轉(zhuǎn)位、共定位等智能模塊。這些模塊可以用于研究外泌體與細(xì)胞間的相互作用、細(xì)胞形態(tài)功能等方面的變化，有利于進(jìn)一步探索外泌體的作用機(jī)理和功能。以細(xì)胞周期模塊為例，Amnis

11、在研究細(xì)胞周期變化時(shí)，不僅可以提供G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞的百分比，還可以通過遺傳物質(zhì)在細(xì)胞核內(nèi)形態(tài)的變化，根據(jù)細(xì)胞核面積以及最大熒光強(qiáng)度等特殊的量化參數(shù)，分析細(xì)胞分裂前期、中期、后期及末期等幾個(gè)亞期。當(dāng)分析細(xì)胞健康狀態(tài)時(shí)，Amnis可以通過細(xì)胞核大小和形態(tài)的變化，區(qū)分凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。另外Amnis還可以通過蛋白轉(zhuǎn)位模塊研究NFkB等蛋白從細(xì)胞胞漿到細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)情況，從而幫助科學(xué)家研究外泌體與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)之間的關(guān)系。細(xì)胞周期的細(xì)化分析：G1=47%S=32%G2/M=19%ProphaseMetaphaseAnaphaseTelophase關(guān)于Amnis量化成像流式細(xì)胞分析技術(shù)

12、:流式細(xì)胞技術(shù)在過去的30年中，實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)足的發(fā)展，已成為生命科學(xué)研究不可或缺的研究手段。然而，科學(xué)家們不難發(fā)現(xiàn)，流式技術(shù)的數(shù)據(jù)結(jié)果始終無法突破散點(diǎn)圖和直方圖的固定數(shù)據(jù)模式，除了圈門和計(jì)數(shù)，用戶無法探究細(xì)胞散點(diǎn)數(shù)據(jù)背后的更深層次的內(nèi)涵。全新的®Amnis量化成像分析流式細(xì)胞技術(shù)將流式細(xì)胞技術(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)力量，和熒光顯微鏡在細(xì)胞功能及形態(tài)學(xué)研究中的細(xì)節(jié)展現(xiàn)能力與豐富內(nèi)涵完美結(jié)合，特別是其圖形量化分析技術(shù)，將流式細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用范圍推至了全新的高度，使其可以完成上述兩項(xiàng)技術(shù)單獨(dú)無法實(shí)現(xiàn)的諸多應(yīng)用。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各個(gè)研究領(lǐng)域，包括生物化學(xué)、藥物研發(fā)、血液、免疫、微生物、海洋、腫瘤、寄生蟲、

13、干細(xì)胞、毒理、病毒等等，已發(fā)表超過300篇高水平文章。更多詳情>>Reference paper:1. Ectosomes and exosomes: shedding the confusion between extracellular vesiclesEmanuele Cocucci and Jacopo MeldolesiTrends in Cell Biology, June 2015. Vol. 25. No.62. Cutting-Edge Analysis of Extracellular Microparticles using ImageStreamX Imag

14、ing Flow CytometrySarah E. Headland, Helin R. Jones, Adelina S.V.DSa, Mauro Perretti &Lucy V. NorlingSCIENTIFIC REPORTS | 4 : 5237 | DOI: 10.1038/srep052373. Exosomes Containing Glycoprotein 350 Released by EBV-Transformed B Cells Selectively Target B Cellsthrough CD21 and Block EBV Infection In VitroHelen Vallhov, Cindy Gutzeit, Sara M. Johansson, Noémi Nagy, Mandira Paul, Qin Li, Sherree friend, ThaddeusC. George, Eva Klein, Annika Scheynius and Susanne GabrielssonJ Immunol 2011; 186:73-824. Characterization of Uptake and Internalization of Exosom