實(shí)驗(yàn)四--蛋白質(zhì)純化---鹽析沉淀法

1、實(shí)驗(yàn)四 蛋白質(zhì)純化 鹽析沉淀法【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹坎捎昧蛩徜@鹽析法將日本血吸蟲(chóng)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶融合蛋白從大腸桿菌BL21（DE3）pGEX-NS53細(xì)胞裂解液中分離出來(lái)，使學(xué)生學(xué)習(xí)掌握制備細(xì)胞裂解液的技術(shù)和采用鹽析法從中分離目的蛋白質(zhì)的技術(shù)?！緦?shí)驗(yàn)原理】用鹽析法從成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)溶液（如細(xì)胞裂解液）中提取目的蛋白質(zhì)是一種傳統(tǒng)的目前仍被廣泛使用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)。此種技術(shù)的工作原理如下：蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，其溶解度會(huì)隨鹽濃度的升高而增加，此種現(xiàn)象被稱作鹽溶。但是當(dāng)鹽的濃度繼續(xù)增高時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度又以不同程度地下降并先后從溶液中析出，此種現(xiàn)象被稱為鹽析。上述現(xiàn)象 是由于蛋白質(zhì)分子中極性基團(tuán)之間存在靜電

2、力。在低鹽濃度下，蛋白質(zhì)分子中極性基團(tuán)之間的靜電力受鹽離子的影響而被消除，蛋白質(zhì)在水中的極性基團(tuán)的電荷被中和，水化膜被破壞，于是蛋白質(zhì)分子之間相互聚集并從溶液中析出。鹽析法就是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在一定濃度的鹽溶液中溶解度降低程度的不同而達(dá)到彼此分離的方法。 鹽析的一般操作步驟是，選擇一定濃度范圍的鹽溶液（如0-25%飽和度的硫酸銨）使部分雜質(zhì)呈“鹽析”狀態(tài)從溶液中沉淀出來(lái)，經(jīng)離心法去除。而目的蛋白質(zhì)呈鹽溶狀態(tài)，存在于上清中。增加鹽濃度（如25-60%飽和度的NH4SO4）使目的蛋白質(zhì)呈鹽析狀態(tài)，而從溶液中分離出來(lái)。在鹽析時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度與溶液中離子強(qiáng)度的關(guān)系，可用下式表示： Slg = -Ks&

3、#215;I S0式中的S為蛋白質(zhì)在離子強(qiáng)度為I的溶解度，S0蛋白質(zhì)在純水（離強(qiáng)度為0）中的溶解度；KS為鹽析常數(shù)。離子強(qiáng)度I可用下式表示：I=1/2Z2式中，M-溶液中各種離子克分子濃度 Z-各種離子所帶的電荷數(shù)在溫度恒定時(shí)，S0對(duì)于某一種蛋白質(zhì)在某一溶液中的溶解度是一個(gè)常數(shù)，lgS0也為一常數(shù)，以代替，故式（1）可以改寫(xiě)為：lgS=b-Ks×I （3）值主要與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，鹽離子的平均半徑以及鹽離子的電荷數(shù)有關(guān)，也受溶液中的氫離子濃度（PH值）和溫度影響。一般來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)在某一鹽溶液中的鹽析系數(shù)-KS越大，鹽析效果越好。由于蛋白質(zhì)含有許多親水基團(tuán)，需要在較高的I植下才能從溶液中析

4、出。由式（3）可以看出，在一定的溫度和PH值下，改變鹽的離子強(qiáng)度（I）可以把不同的蛋白質(zhì)從溶液中沉淀出來(lái)。此種方法稱為“KS分段鹽析法”,常用于蛋白質(zhì)的初步提純。在一定的的I值下，改變溫度及PH值，使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀出來(lái)，稱為“分段鹽析法”，常用蛋白質(zhì)純化過(guò)程的后期，特別是某些蛋白質(zhì)結(jié)晶析出時(shí)。蛋白質(zhì)鹽析常用硫酸銨等中性鹽。硫酸銨因其溶解度大（25時(shí)的飽和硫酸銨溶液的摩爾濃度為4.1M，即767克/升，0時(shí)為3.9M，676克/升），溫度系數(shù)小而被廣泛使用。硫酸銨價(jià)格便宜，不易引起蛋白質(zhì)變性并具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用，分段效果比其他鹽類(lèi)好，廢液可以作肥料，對(duì)環(huán)境無(wú)污染。其缺點(diǎn)是，其N(xiāo)H+4對(duì)用凱

5、氏定氮測(cè)定蛋白質(zhì)含量有干擾，硫酸銨溶液的PH常在4.5-5.5之間,其緩沖能力比較差。有時(shí)用硫酸鈉.。蛋白質(zhì)鹽析時(shí),鹽的濃度一般以飽和度表示，飽和溶液的飽和度定為100%。用硫酸銨鹽析時(shí)，溶液飽和度調(diào)度方法有三種，一是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液體積不大，需調(diào)正的濃度不高時(shí)，可以向蛋白質(zhì)溶液中添加飽和鹽溶液。另一種方法是向蛋白質(zhì)溶液中直接添加磨碎的鹽結(jié)晶粉末，此種方法用于需要的鹽濃度高，而且蛋白質(zhì)溶液體積不宜過(guò)分增加時(shí)。第三種方法是將待鹽析蛋白質(zhì)的溶液裝于透析裝內(nèi)對(duì)飽和硫酸銨進(jìn)行透析，此法鹽濃度變化比較連續(xù)平穩(wěn)，不會(huì)出現(xiàn)局部過(guò)高現(xiàn)象。但是鹽析時(shí)需要測(cè)定鹽的飽和度，過(guò)程復(fù)雜，較少應(yīng)用。采用方法一時(shí)，所需添加的飽

6、和鹽溶液的體積可按下式計(jì)算： S2-S1V=V0 1-S2式中，V飽和鹽溶液的體積 V0原溶液的體積 S1原溶液的飽和度 S2要達(dá)到的飽和度采用第二種方法時(shí)，可從附表一中選擇要達(dá)到某一濃度時(shí)所需添加的固體硫酸銨量。影響蛋白質(zhì)鹽析的因素：（1）蛋白質(zhì)溶液中鹽的濃度。不同蛋白質(zhì)的鹽析要求鹽的飽和度不同。從成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)溶液中分離蛋白質(zhì)時(shí)，鹽的飽和度應(yīng)由稀到濃漸次增加。每出現(xiàn)一種蛋白質(zhì)沉淀就應(yīng)將其分離除去后，再繼續(xù)增加鹽的飽和度，使第二種蛋白質(zhì)沉淀出來(lái)；（2）蛋白質(zhì)溶液的PH值。在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小而容易沉淀出來(lái)，因此鹽析時(shí)應(yīng)將PH值調(diào)節(jié)在目的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近；（3）蛋白質(zhì)濃度

7、。在相同鹽析條件下，蛋白質(zhì)濃度越大越易被鹽析沉淀。但是濃度太高時(shí)，易使雜蛋白共沉淀；（4）溫度。濃鹽溶液對(duì)蛋白質(zhì)有一定的保護(hù)作用，因此一般的鹽析操作可以在室溫下進(jìn)行?！緦?shí)驗(yàn)器材】 100ml燒杯，50ml離心管，高速冷凍離心機(jī),微量離心管(1.5ml)10支,聚丙烯酰胺凝膠電泳儀一臺(tái),1ml,200l,20l移液器各1把,1ml,200l和20l槍各1支,微量離心管支架,磁力攪拌器及攪拌磁棒?！緦?shí)驗(yàn)材料】1大腸桿菌BL21（DE3）pGEXNS53細(xì)胞裂解液，由上一實(shí)驗(yàn)提供2分析純硫酸銨：用干凈的磁研缽研成細(xì)粉末。330%三氯乙酸4SDS-PAGE所需試劑【實(shí)驗(yàn)方法】1 鹽析曲線的測(cè)定對(duì)于一求

8、知鹽析特性的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，用鹽析作為一純化步驟時(shí)，應(yīng)首先用實(shí)驗(yàn)確定使此種蛋白質(zhì)鹽析沉淀出來(lái)的最佳飽和度，其測(cè)定方法如下： （1）取7支微量離心管，用記號(hào)筆在管帽上標(biāo)記20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%；（2）以上述離心管作容器分別稱取磨細(xì)的硫酸銨晶體末0.057克、0.088克、0.122克、0.156克、0159克、0.235克和0.281克；（3）分別向上述裝有（NH4）2SO4粉末的離心管中添加0.5ml細(xì)胞裂解液，充分振蕩使（NH4）2SO4溶解后，在室溫下靜置2小時(shí)；（4）將離心管放置于離心機(jī)中，以1000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速離心5分鐘后，傾去上清，倒立離心管，以便盡可能多地

9、去除上清；（5）添加0.5ml蒸餾水及8l30%三氯乙酸混勻,靜置10分鐘后,離心,盡量去除上清；(因此步會(huì)造成蛋白質(zhì)不溶影響后續(xù)工作，所以省略)（6）將離心管置于快速干燥器中干燥30分鐘；（7）向離心管中添加100ISDS-PAGE上樣緩沖液懸浮沉淀后，在沸水浴中煮沸3分鐘，取出置-20冰箱中備用；（8）制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠；按下列上樣順序向加樣孔中添加10l 樣品：樣孔 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10包涵體樣20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 包涵體 空白對(duì)照電泳分離后，染色、脫色、觀察目的蛋白質(zhì)出現(xiàn)在何種濃度的（NH4）2SO4鹽析樣孔中，以確定最佳的鹽析條件。2鹽析（1）將50ml細(xì)胞裂解液置于100ml燒杯中，加入攪拌磁棒后放置在磁力攪拌器上（2）在攪拌狀態(tài)下緩緩加入研細(xì)的（NH4）2SO4末至最佳飽和度之前的一級(jí)飽和度，靜置2小時(shí)后,離心得上清（3）在攪拌下向上清中添加研細(xì)的（NH4）2SO4粉末，使終濃度達(dá)最佳飽和度，靜置2小時(shí)后離心收集目的蛋白沉淀（4）將沉淀的蛋白質(zhì)溶解于盡量小體積的磷酸鹽緩沖的生理鹽水中，用Bradford試劑測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，