分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)4h

1、 羅建新第一章 序論 第一節(jié) 概述分子診斷學(xué)的形成在分子生物學(xué)及生物化學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，以研究核酸和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能等生命本質(zhì)的學(xué)科，在核酸、蛋白質(zhì)分子水平研究疾病的發(fā)病、診斷、治療和預(yù)后的機(jī)制。其中基因工程是目前分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，這些技術(shù)可以改造或擴(kuò)增基因和基因產(chǎn)物，使微量的研究對(duì)象達(dá)到分析水平，是研究基因表達(dá)和調(diào)控的方法，也是在分子水平研究疾病發(fā)生機(jī)制、基因診斷和基因治療的方法。 主要內(nèi)容1.內(nèi)源基因異常的檢驗(yàn)和診斷自身基因結(jié)構(gòu)異常 基因功能異常表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能異常 致病基因調(diào)控異常 致病如 腫瘤 遺傳病2.外源基因侵入體內(nèi)檢測(cè)及診斷病原微生物 B ,V 依核心部分基因DN

2、A, RNA不同檢測(cè)及病原學(xué)分類(lèi)如 HBV HIV等核酸是生命的存在形式蛋白質(zhì)是生命表現(xiàn)形式3. 分子診斷學(xué)與以往醫(yī)學(xué)診斷的關(guān)系DNARNA臨床表現(xiàn)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄翻譯基因診斷生化檢驗(yàn)臨床診斷HGP完成完成第二節(jié) 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ) 一、基本概念核酸（ ）結(jié)構(gòu) 理化性質(zhì)復(fù)性 變性 Tm值蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 理化性質(zhì) 基因重組(Genetic recombination) 基因重組是自然界常見(jiàn)到現(xiàn)象，指的是整段DNA在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間、甚至在不同物種之間進(jìn)行交換，并能在新的位置上復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。 它在進(jìn)化、繁殖、病毒感染、基因表達(dá)以及癌基因激活等過(guò)程中起著重要作用。也可以認(rèn)為是一種自然突變現(xiàn)象。 基因重

3、組的方式轉(zhuǎn)化(Transformation) 外來(lái)基因引起細(xì)胞生物性狀改變的過(guò)程或?qū)①|(zhì)?；蛞再|(zhì)粒為載體的重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程。 轉(zhuǎn)染（Transfection） 以噬菌體或病毒或以之為載體所構(gòu)建的重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過(guò)程。 轉(zhuǎn)導(dǎo)（Transduction） 利用載體把遺傳物質(zhì)從一種宿主傳給另一宿主的過(guò)程。轉(zhuǎn)位（Transposition） 一個(gè)或一組基因從一處轉(zhuǎn)移到基因組的另一位 置 的 過(guò) 程 ， 這 些 游 動(dòng) 的 基 因 稱(chēng) 為 轉(zhuǎn) 位 子(Transposon)。 遺傳工程遺傳工程廣義廣義: 整體水平整體水平 細(xì)胞水平細(xì)胞水平 染色體水平染色體水平 分子水平分子水平

4、狹義狹義: 指分子水平指分子水平 基因工程基因工程 基因克隆基因克隆 DNA克隆克隆 重組重組DNA技術(shù)相關(guān)概念技術(shù)相關(guān)概念 DNA克隆克隆克?。寺。╟lone）：）： 來(lái)自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。來(lái)自同一始祖的相同副本或拷貝的集合?？寺』寺』╟loning）：）： 獲取同一拷貝的過(guò)程，即無(wú)性繁殖。獲取同一拷貝的過(guò)程，即無(wú)性繁殖。分子克?。ǚ肿涌寺。―NA克?。┛寺。┘?xì)胞克隆細(xì)胞克隆個(gè)體克?。▌?dòng)物或植物）個(gè)體克隆（動(dòng)物或植物）基因工程（Gene engineering） 定義定義 指在體外將外源核酸分子插入質(zhì)粒、病毒或指在體外將外源核酸分子插入質(zhì)粒、病毒或其它載體分子，構(gòu)成遺傳

5、物質(zhì)的新組合，并使之其它載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之參入到原先沒(méi)有這類(lèi)分子的寄主細(xì)胞內(nèi)，并且能參入到原先沒(méi)有這類(lèi)分子的寄主細(xì)胞內(nèi)，并且能持續(xù)穩(wěn)定地繁殖。持續(xù)穩(wěn)定地繁殖。v 基因克?。℅ene cloning）v 體外重組DNA技術(shù)（in vitro recombinant DNA technology）DNA克?。嚎寺。?應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的 DNA與載體與載體DNA結(jié)合成具有自我復(fù)制能力的結(jié)合成具有自我復(fù)制能力的 DNA分子，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，分子，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞， 篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行篩選出含

6、有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行 擴(kuò)增、提取獲得大量同一擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子。又稱(chēng)基分子。又稱(chēng)基 因克隆或重組因克隆或重組DNA。1972年 P.Berg etc首次用EcoRI切.接SV40和phageDNA構(gòu)建第一個(gè)人工DNA分子.獲1981年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)1973年 Cohens.etc用 EcoRI 切.體外連接質(zhì)粒Tc-pSC101和 Neo-R6-5導(dǎo)入大腸桿菌,使其具有四環(huán)素和新酶素抗性.完成第一分子克隆全過(guò)程. 重組重組DNADNA技術(shù)基本原理技術(shù)基本原理分離純化或人工合成帶有目的基因的DNA片段； 在體外將目的基因與載體DNA結(jié)合，成為重組 DNA分子； 將重組DNA

7、導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞，并與之一起增殖；同時(shí)篩選出帶有重組DNA分子的受體細(xì)胞克??； 從篩選出來(lái)的受體細(xì)胞克隆中，提取目的基因供進(jìn)一步分析研究使用； 將目的基因克隆到表達(dá)載體并導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下，實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)。二、基因工程的常用工具、基因工程的常用工具1. 定義 指能把外源DNA（目的基因）導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并使之傳代、擴(kuò)增、表達(dá)的工具。 （一）載體（Vector） 能夠獨(dú)立自主的復(fù)制，且目的基因的插入不影 響載體的復(fù)制能力； 具有至少一個(gè)單一酶切位點(diǎn)； 具有顯著的遺傳標(biāo)記，便于篩選； 供插入外源基因的片段范圍大，且能穩(wěn)定存在； 載體本身分子量小，拷貝量高； 安全。 2. 條件按來(lái)源

8、分v 質(zhì)粒（plasmid）v 噬菌體（phage） 病毒（virus） 3.分類(lèi)按用途分v 克隆載體 表達(dá)載體4、質(zhì)粒(1)定義 是一種存在于細(xì)菌中，獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外的遺傳因子，能夠自主穩(wěn)定獨(dú)立復(fù)制的共價(jià)閉環(huán)的雙鏈DNA，一般對(duì)細(xì)菌的生存無(wú)影響。 (2)分類(lèi)：根據(jù)拷貝數(shù)可將質(zhì)粒分成兩種不同的復(fù)制型 “嚴(yán)緊型”質(zhì)粒（stringent plasmid） “松弛型”質(zhì)粒（relaxed plasmid）(3)命名命名 eg：pBR322“P”-表示是一種質(zhì)粒plasmid“BR”-分別取自該質(zhì)粒的兩位主要構(gòu)建者 F.Bolivar和R.L.Rodriguez姓氏的第一個(gè) 字母 322-指實(shí)驗(yàn)

9、編號(hào)，以與其它質(zhì)粒載體如： PBR325、PBR327等相區(qū)別(4)舉例舉例 pBV220 優(yōu)點(diǎn)： 1. 個(gè)體較?。◣讉€(gè)kb），易于獲得； 2. 含有顯著的遺傳標(biāo)記通常有2個(gè)以上； 3. 拷貝數(shù)高； 4. 易于導(dǎo)入外源基因，易于進(jìn)入宿主細(xì) 胞并穩(wěn)定存在； 缺點(diǎn)：可插入的外源片段小10kb以下。特點(diǎn)5、噬菌體載體、噬菌體載體 噬菌體及其衍生物 單鏈?zhǔn)删wM13 粘尾質(zhì)粒（cosmid）等 猴多瘤病毒40（SV40） 腺病毒 逆轉(zhuǎn)錄病毒等 6、病毒載體、病毒載體. .噬菌體（噬菌體（phagephage）DNADNA 噬菌體噬菌體DNADNA改造系統(tǒng)改造系統(tǒng) gt gt 系列（插入型，適用系列（插

10、入型，適用cDNAcDNA克?。┛寺。?EMBLEMBL系列（置換型，適用基因組克隆）系列（置換型，適用基因組克?。㎝13M13噬菌體噬菌體DNADNA改造系統(tǒng)改造系統(tǒng)（含（含lac Zlac Z基因）基因） M13mpM13mp系列系列 pUCpUC系列系列 柯斯質(zhì)粒（柯斯質(zhì)粒（cosmid）酵母人工染色體載體酵母人工染色體載體 （yeast artificial chromosome, YAC）細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體 （bacterial artificial chromosome, BAC）動(dòng)物病毒動(dòng)物病毒DNA改造的載體改造的載體 （如腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄（如腺病毒、腺

11、病毒相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒）病毒）（二）工具酶 基因的分離和重組，涉及到一系列相互關(guān)聯(lián)的酶促反應(yīng)，已知道有許多重要的核酸酶（如限制性核酸內(nèi)切酶、連接酶、聚合酶、末端轉(zhuǎn)移酶等等）在基因克隆實(shí)驗(yàn)中有著廣泛的用途。而其中限制性核酸內(nèi)切酶和連接酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，才真正使DNA分子的體外切割與連接成為可能，是DNA重組技術(shù)賴(lài)以創(chuàng)立的重要酶學(xué)基礎(chǔ)。1、限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease） 定義 是一類(lèi)能識(shí)別雙鏈DNA分子中某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。常形象地稱(chēng)之為核酸分子的“手術(shù)刀” 。命名 eg：EcoRI 、Hind 分型 識(shí)別識(shí)別DNA的特異

12、序列，并在識(shí)別位的特異序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周?chē)懈铍p鏈點(diǎn)或其周?chē)懈铍p鏈DNA的一類(lèi)內(nèi)切酶。的一類(lèi)內(nèi)切酶。 是細(xì)菌內(nèi)存在的保護(hù)性酶。分為是細(xì)菌內(nèi)存在的保護(hù)性酶。分為I、II、III三類(lèi)。三類(lèi)。II類(lèi)酶識(shí)別序列特點(diǎn)為類(lèi)酶識(shí)別序列特點(diǎn)為回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)。 GGATCC CCTAGG 特性 型 型 型限制和修飾活性 同時(shí)具有內(nèi)切酶、 核酸內(nèi)切酶 類(lèi)似I，多功能酶 甲基化酶活性 酶的蛋白結(jié)構(gòu) 3種不同的亞基 單一的成分 2種不同的亞基 所需的輔助因子 ATP、Mg2 、 Mg2 ATP、Mg2 、 S-腺苷甲硫氨酸 S-腺苷甲硫氨酸切割位點(diǎn) 在距特異性位點(diǎn)至少 位于特異性位點(diǎn) 距特異性位點(diǎn)3端 10

13、00bp的地方可能隨 或其附近 2426bp處 機(jī)地切割 序列特異的切割 否 是 是在DNA克隆中的 無(wú)用 十分有用 用處不大 用處 核酸內(nèi)切限制酶的類(lèi)型及其主要特性 活性單位 在一定的反應(yīng)條件下（pH、溫度、離子濃度等）和時(shí)間內(nèi)(60分鐘)能夠完全酶解1g的DNA分子底物所需的酶量 識(shí)別、切割序列 能識(shí)別由48個(gè)核苷酸組成的特定的核苷酸序列（稱(chēng)為核酸內(nèi)切限制酶的識(shí)別序列） 兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)的、但又是對(duì)稱(chēng)地圍繞著一個(gè)對(duì)稱(chēng)軸排列，形成所謂粘性末端DNA片段 EcoRI 5GAATT C3 5G AATTC3 3C TTAAG5 3C TTAA G5 PstI 5C TGCAG3 5C T

14、GCA G3 3GACGT C5 3G ACGTC5 斷裂類(lèi)型 兩條鏈的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)的中心，形成平末端的DNA片段。 Hae 5G-GC-C3 5G-G 3 5 C-C3 3C-CG-G5 3C-C 3 5 G-G5 5 -端突出端突出粘性末端粘性末端 3 -端突出端突出限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列長(zhǎng)度為限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列長(zhǎng)度為48個(gè)個(gè)bp。不同酶切產(chǎn)生的相同粘性末端稱(chēng)不同酶切產(chǎn)生的相同粘性末端稱(chēng)配伍配伍末端末端（compatible end），），可用連接酶連接。可用連接酶連接。限制性核酸內(nèi)切酶作用后產(chǎn)生兩種末端：限制性核酸內(nèi)切酶作用后產(chǎn)生兩種末端： 鈍性末端鈍性末端( (b

15、lunt end) blunt end) 粘性末端粘性末端( (sticky end)sticky end)Hind IIIBamH IGCCTAGGATCCG+GTCCAGGACCTG+GTCGACCAGCTGGGATCCCCTAGG星號(hào)活力（star activity） 在一些非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，限制性核酸內(nèi)切酶能夠識(shí)別和切割與其特異性識(shí)別序列相類(lèi)似的序列，使切割的特異性下降。 導(dǎo)致星號(hào)活力的產(chǎn)生因素v 高濃度的限制性核酸內(nèi)切酶； v 高濃度的甘油； v 低離子強(qiáng)度； v 用Mn2取代Mg2以及高pH值等等；2.核酸修飾酶核酸修飾酶(1)連接酶連接酶(2)聚合酶 三三.目的基因目的基因應(yīng)用重

16、組應(yīng)用重組DNA技術(shù)所要分離、獲得的基因技術(shù)所要分離、獲得的基因(已知已知及未知及未知)1. cDNA(complementary DNA):是指經(jīng)反轉(zhuǎn)是指經(jīng)反轉(zhuǎn) 錄合成的，與錄合成的，與RNA互補(bǔ)的單鏈互補(bǔ)的單鏈DNA。以單鏈以單鏈cDNA為模板，經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈為模板，經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈cDNA。2. 基因組基因組DNA（genomic DNA）：）：是指代是指代 表一個(gè)細(xì)胞或生物體整套遺傳信息（染色體表一個(gè)細(xì)胞或生物體整套遺傳信息（染色體及線粒體）的所有及線粒體）的所有DNA序列。序列。 目的基因的獲取目的基因的獲取1.化學(xué)合成法化學(xué)合成法用于已知序列，或可推導(dǎo)出序列的基因用于已知

17、序列，或可推導(dǎo)出序列的基因2.基因組基因組DNA基因組基因組DNA文庫(kù)（文庫(kù)（genomic DNA library）3.cDNAcDNA文庫(kù)（文庫(kù)（cDNA library）4.聚合酶鏈反應(yīng)（聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）基因組基因組DNADNA文庫(kù)文庫(kù)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌內(nèi)，存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌內(nèi)，由克隆載體所攜帶的所由克隆載體所攜帶的所有基因組有基因組DNADNA的集合。的集合。簡(jiǎn)稱(chēng)簡(jiǎn)稱(chēng)G G文庫(kù)。文庫(kù)。組組織織或或細(xì)細(xì)胞胞染染色色體體D DN NA A限制性?xún)?nèi)切酶基因片段克隆載體重重組組D DN NA A分分子子受體菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌 cDNAcDN

18、A文庫(kù)文庫(kù)用細(xì)胞總用細(xì)胞總mRNAmRNA制備全套雙鏈制備全套雙鏈cDNAcDNA后，后，建立的基因文庫(kù)。簡(jiǎn)稱(chēng)建立的基因文庫(kù)。簡(jiǎn)稱(chēng)c c文庫(kù)。文庫(kù)。mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶cDNA復(fù)制雙雙鏈鏈c cD DN NA A載體重重組組D DN NA A分分子子受體菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌 四四.基因克隆的全過(guò)程基因克隆的全過(guò)程 (一一) 制備目的基因制備目的基因（二）克隆載體的選擇（二）克隆載體的選擇 （三）外源基因與載體的連接（三）外源基因與載體的連接1. 粘性末端連接粘性末端連接GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCGGCCTAGGATCCGD DN NA A連連接接酶酶GC

19、CTAGGATCCG 2. 平端連接平端連接限制性?xún)?nèi)切酶作用產(chǎn)生的平端限制性?xún)?nèi)切酶作用產(chǎn)生的平端粘端經(jīng)特殊酶處理變?yōu)槠蕉苏扯私?jīng)特殊酶處理變?yōu)槠蕉?. 同聚物加尾連接同聚物加尾連接 由末端轉(zhuǎn)移酶作用，在由末端轉(zhuǎn)移酶作用，在DNADNA片段末端加片段末端加 上同聚物序列，制造出粘性末端再連接。上同聚物序列，制造出粘性末端再連接。4. 人工接頭人工接頭 由平端加上帶有新的酶切位點(diǎn)的寡核苷由平端加上帶有新的酶切位點(diǎn)的寡核苷 酸，再用限制酶切產(chǎn)生粘性末端，進(jìn)行連接。酸，再用限制酶切產(chǎn)生粘性末端，進(jìn)行連接。 （四）重組（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌導(dǎo)入受體菌受體菌條件：受體菌條件：安全宿主菌安全宿主菌 限制酶

20、和重組酶缺陷限制酶和重組酶缺陷 處于感受態(tài)處于感受態(tài)導(dǎo)入方式：導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化(transformation) 轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染（transfaction） 感染（感染（infection） （五）重組體的篩選（五）重組體的篩選重組重組DNA導(dǎo)入受體菌后，經(jīng)過(guò)培導(dǎo)入受體菌后，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)使其大量繁殖，再設(shè)法將含有目的養(yǎng)使其大量繁殖，再設(shè)法將含有目的基因的菌落區(qū)分鑒定出來(lái)，這一過(guò)程基因的菌落區(qū)分鑒定出來(lái)，這一過(guò)程即為篩選（即為篩選（screening）或選擇或選擇（selection）。）。 1. 直接選擇法：直接選擇法：針對(duì)載體攜帶某種或某些標(biāo)志基因針對(duì)載體攜帶某種或某些標(biāo)志基因 和目的基因而設(shè)計(jì)的篩

21、選方法。其特和目的基因而設(shè)計(jì)的篩選方法。其特 點(diǎn)是直接測(cè)定基因或基因表型。點(diǎn)是直接測(cè)定基因或基因表型。 抗藥性標(biāo)記選擇（插入失活法）：抗藥性標(biāo)記選擇（插入失活法）： 將目的基因插入帶將目的基因插入帶ampampr r和和tettetr r基因載基因載體的體的tettetr r基因中，則基因中，則tettetr r基因失活。在分別基因失活。在分別含有氨芐青霉素和含四環(huán)素的兩個(gè)培養(yǎng)基中含有氨芐青霉素和含四環(huán)素的兩個(gè)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)行篩選。培養(yǎng)，進(jìn)行篩選。 標(biāo)志補(bǔ)救（標(biāo)志補(bǔ)救（marker rescue）若目的基因能夠在宿主菌表達(dá)，且表達(dá)若目的基因能夠在宿主菌表達(dá)，且表達(dá) 產(chǎn)物與宿主菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)

22、，就可利用對(duì)產(chǎn)物與宿主菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)，就可利用對(duì) 營(yíng)養(yǎng)素的依賴(lài)表型來(lái)篩選。營(yíng)養(yǎng)素的依賴(lài)表型來(lái)篩選。 分子雜交法：分子雜交法：利用利用3232P P標(biāo)記的探針與轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素標(biāo)記的探針與轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素 膜上的轉(zhuǎn)化子膜上的轉(zhuǎn)化子DNADNA或克隆的或克隆的DNADNA片段進(jìn)行分子片段進(jìn)行分子 雜交，直接選擇并鑒定目的基因。雜交，直接選擇并鑒定目的基因。 原位雜交原位雜交 SouthernSouthern印跡印跡 2.2. 非直接選擇法：非直接選擇法：免疫學(xué)方法：利用特異抗體與目的免疫學(xué)方法：利用特異抗體與目的 基因表達(dá)產(chǎn)物相互作用進(jìn)行篩選。包括：基因表達(dá)產(chǎn)物相互作用進(jìn)行篩選。包括：免疫化學(xué)方法免疫化學(xué)方法酶免檢測(cè)法酶免檢測(cè)法 （六）克隆基因的表達(dá)（