分子生物學(xué)第3章_可移動的遺傳因子張敏2

1、可移動的遺傳因子可移動的遺傳因子( (轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子) )和染色體外遺傳因子和染色體外遺傳因子DNA transposable elementTSTransposase geneTSIRIR插入序列（插入序列（insertion sequence，IS）轉(zhuǎn)座酶基因 在染色體和質(zhì)粒（包括在染色體和質(zhì)粒（包括F F因子）中，都含有因子）中，都含有這類較小的轉(zhuǎn)座子，長度為這類較小的轉(zhuǎn)座子，長度為7507501500bp1500bp，只帶，只帶有與其轉(zhuǎn)座作用相關(guān)的基因。有與其轉(zhuǎn)座作用相關(guān)的基因。 由耐藥基因和兩個(gè)相同的由耐藥基因和兩個(gè)相同的ISIS序列組成復(fù)合序列組成復(fù)合轉(zhuǎn)座子構(gòu)型轉(zhuǎn)座子構(gòu)型( (倒轉(zhuǎn)重

2、復(fù)或正向重復(fù)倒轉(zhuǎn)重復(fù)或正向重復(fù)) )。倒轉(zhuǎn)重復(fù)正向重復(fù)IS1IS1IS1IS1抗生素抗性基因抗生素抗性基因2022-2-9 202022-2-9 21 它是一種溶菌和溶源周期性交替方式生成的噬菌它是一種溶菌和溶源周期性交替方式生成的噬菌體，可誘發(fā)大腸桿菌突變。如體，可誘發(fā)大腸桿菌突變。如Mu噬菌體。噬菌體。 侵入的侵入的MuMu可在溶源化過程插入寄主可在溶源化過程插入寄主DNADNA任意部位，任意部位，造成靶點(diǎn)倍生，造成靶點(diǎn)倍生，原噬菌體原噬菌體兩側(cè)各有一個(gè)兩側(cè)各有一個(gè)5bp5bp的靶點(diǎn)的靶點(diǎn)重復(fù)序列重復(fù)序列 2022-2-9 22 MuMu噬菌體的右末端由噬菌體的右末端由3kb3kb組成的組

3、成的G G片段（可倒轉(zhuǎn)片段）片段（可倒轉(zhuǎn)片段） 在不同的噬菌體的在不同的噬菌體的DNADNA取向不同。取向不同。 G G（+ +）時(shí)，基因）時(shí)，基因S S和和U U表達(dá)，產(chǎn)物使之能夠吸附大腸桿菌表達(dá)，產(chǎn)物使之能夠吸附大腸桿菌k12k12 G(-)G(-)時(shí)，基因時(shí)，基因SS和和UU表達(dá)，產(chǎn)物使之能夠吸附大腸桿菌表達(dá)，產(chǎn)物使之能夠吸附大腸桿菌C CBar = 50 nanometers 原噬菌體原噬菌體: prophage,整合整合入宿主入宿主DNA中的噬菌體中的噬菌體 2022-2-9 23真核生物轉(zhuǎn)座子（了解）真核生物轉(zhuǎn)座子（了解） 真核細(xì)胞內(nèi)只要存在轉(zhuǎn)座酶，任何序列片段具真核細(xì)胞內(nèi)只要存在

4、轉(zhuǎn)座酶，任何序列片段具有該酶識別的反向重復(fù)末端均可發(fā)生轉(zhuǎn)移有該酶識別的反向重復(fù)末端均可發(fā)生轉(zhuǎn)移 最早發(fā)現(xiàn)的是玉米轉(zhuǎn)座子，稱為控制因子最早發(fā)現(xiàn)的是玉米轉(zhuǎn)座子，稱為控制因子 通常以非復(fù)制方式轉(zhuǎn)座通常以非復(fù)制方式轉(zhuǎn)座 所有的轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)制很相似，可所有的轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)制很相似，可以歸納為以歸納為兩步反應(yīng)：兩步反應(yīng)： 轉(zhuǎn)座子本身的復(fù)制（非復(fù)制型轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)座子本身的復(fù)制（非復(fù)制型轉(zhuǎn)座子沒有此步）；座子沒有此步）； 靶序列的斷裂及倍生。靶序列的斷裂及倍生。2022-2-9 25基因靶序列的斷裂及倍生基因靶序列的斷裂及倍生. .ATGCATACGT內(nèi)切酶在靶序列內(nèi)切酶在靶序列兩邊切出切口兩邊切出切口靶序列靶序列

5、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子ATGCATACGT轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子ATGCATACGT1.復(fù)制型轉(zhuǎn)座復(fù)制型轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子復(fù)制轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)座子保留在原位點(diǎn)，另外一個(gè)拷貝轉(zhuǎn)座子復(fù)制轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)座子保留在原位點(diǎn)，另外一個(gè)拷貝插入到新位點(diǎn)。與轉(zhuǎn)座酶和解離酶相關(guān)。插入到新位點(diǎn)。與轉(zhuǎn)座酶和解離酶相關(guān)。共聯(lián)體生成和解離，靶序列的切割與復(fù)制。共聯(lián)體生成和解離，靶序列的切割與復(fù)制。將供體將供體DNADNA轉(zhuǎn)座因子兩側(cè)各切斷一條單鏈并與靶序列的兩個(gè)游轉(zhuǎn)座因子兩側(cè)各切斷一條單鏈并與靶序列的兩個(gè)游離末端連接，離末端連接，隨后并沒有復(fù)制過程，而是由轉(zhuǎn)座酶將供體隨后并沒有復(fù)制過程，而是由轉(zhuǎn)座酶將供體DNADNA轉(zhuǎn)座因子的另轉(zhuǎn)座因子的另一端也切斷，因此在供體一

6、端也切斷，因此在供體DNADNA留下一個(gè)致死性缺口。留下一個(gè)致死性缺口。轉(zhuǎn)座子的兩條游離單鏈在靶位點(diǎn)退火接合，轉(zhuǎn)座子的兩條游離單鏈在靶位點(diǎn)退火接合，DNADNA聚合酶填平缺聚合酶填平缺口。口。一種非復(fù)制型轉(zhuǎn)座，轉(zhuǎn)座子從供體位點(diǎn)上切下來然后插入靶一種非復(fù)制型轉(zhuǎn)座，轉(zhuǎn)座子從供體位點(diǎn)上切下來然后插入靶位點(diǎn)，供體位點(diǎn)恢復(fù)原狀。這種機(jī)制不僅可以轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)座子本位點(diǎn)，供體位點(diǎn)恢復(fù)原狀。這種機(jī)制不僅可以轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)座子本身，還可以將供體的身，還可以將供體的DNA從一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)細(xì)菌。從一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)細(xì)菌。與與噬菌體的整合過程相似。噬菌體的整合過程相似。質(zhì)粒質(zhì)粒A A質(zhì)粒質(zhì)粒B B質(zhì)粒質(zhì)粒A A質(zhì)粒質(zhì)粒

7、B B細(xì)菌細(xì)菌轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子A+B非復(fù)制型轉(zhuǎn)座需鏈的斷裂和重排非復(fù)制型轉(zhuǎn)座需鏈的斷裂和重排 交叉結(jié)構(gòu)切斷交叉結(jié)構(gòu)切斷后，釋放出來時(shí)發(fā)后，釋放出來時(shí)發(fā)生非復(fù)制型轉(zhuǎn)座，生非復(fù)制型轉(zhuǎn)座，它將轉(zhuǎn)座子插入到它將轉(zhuǎn)座子插入到靶靶DNA，轉(zhuǎn)座子，轉(zhuǎn)座子的兩側(cè)為正向重復(fù)的兩側(cè)為正向重復(fù)序列，供體留下斷序列，供體留下斷裂的雙鏈。轉(zhuǎn)座子裂的雙鏈。轉(zhuǎn)座子不與靶不與靶DNA形成形成共同體。共同體。Tn10轉(zhuǎn)座需要的酶和轉(zhuǎn)座頻率的控制轉(zhuǎn)座需要的酶和轉(zhuǎn)座頻率的控制 轉(zhuǎn)座酶與轉(zhuǎn)座的頻率相關(guān)，且可能通過同時(shí)識別末端反向重復(fù)序列和靶序列才發(fā)揮作用。 轉(zhuǎn)座頻率對細(xì)胞和轉(zhuǎn)座子都十分重要。 甲基化酶在GATC中6-0-G引入甲基，可以

8、抑制轉(zhuǎn)座酶基因的轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)座酶與IS10R的結(jié)合。多拷貝抑制多拷貝抑制 定義：定義：IS10R插入到多拷貝質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到插入到多拷貝質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到細(xì)菌時(shí)，細(xì)菌染色體上的細(xì)菌時(shí)，細(xì)菌染色體上的Tn10轉(zhuǎn)座率下轉(zhuǎn)座率下降。降。 機(jī)制：過量的機(jī)制：過量的OUT RNA確保在核糖體結(jié)確保在核糖體結(jié)合合IN RNA之前與之前與IN RNA互補(bǔ)配對，使互補(bǔ)配對，使其不能翻譯。其不能翻譯。 順式偏愛性順式偏愛性 定義：只有編碼轉(zhuǎn)座酶的定義：只有編碼轉(zhuǎn)座酶的DNA模板存在時(shí)，模板存在時(shí)，IS10R開放讀碼框才會有效地轉(zhuǎn)錄并翻譯轉(zhuǎn)座開放讀碼框才會有效地轉(zhuǎn)錄并翻譯轉(zhuǎn)座酶。是酶。是IS編碼轉(zhuǎn)座酶的普遍現(xiàn)象。編碼轉(zhuǎn)座酶的

9、普遍現(xiàn)象。 機(jī)制：機(jī)制：一、蛋白質(zhì)合成后（甚至在翻譯過程中），轉(zhuǎn)座一、蛋白質(zhì)合成后（甚至在翻譯過程中），轉(zhuǎn)座酶與酶與DNA緊密結(jié)合，以至于轉(zhuǎn)座酶不可能會分緊密結(jié)合，以至于轉(zhuǎn)座酶不可能會分散的別處。散的別處。二、轉(zhuǎn)座酶未與二、轉(zhuǎn)座酶未與DNA結(jié)合時(shí)，可能不穩(wěn)定。結(jié)合時(shí)，可能不穩(wěn)定。順式偏愛性和多拷貝抑制是順式偏愛性和多拷貝抑制是Tn10的拷貝增加了但有不引的拷貝增加了但有不引起轉(zhuǎn)座頻率的增加，避免造成不應(yīng)有的損傷。起轉(zhuǎn)座頻率的增加，避免造成不應(yīng)有的損傷。指減低蛋白質(zhì)合成速度的基因突變 造成插入位點(diǎn)靶造成插入位點(diǎn)靶DNA的少量堿基對重復(fù)的少量堿基對重復(fù)IS1、Tn10： 造成造成9bp的重復(fù)。的重

10、復(fù)。 IS3： 造成造成3或或4bp的重復(fù)。的重復(fù)。 IS4： 造成造成11bp的重復(fù)。的重復(fù)。插入位點(diǎn)出現(xiàn)新基因插入位點(diǎn)出現(xiàn)新基因 復(fù)合轉(zhuǎn)座子帶有抗性基因（如抗藥性基因復(fù)合轉(zhuǎn)座子帶有抗性基因（如抗藥性基因ampc)，可產(chǎn)生兩方面效應(yīng)：一個(gè)基因的插入突，可產(chǎn)生兩方面效應(yīng)：一個(gè)基因的插入突變；出現(xiàn)抗藥基因。變；出現(xiàn)抗藥基因。 引起染色體畸變引起染色體畸變 在一個(gè)染色體上（甚至不同染色體上）若有同一轉(zhuǎn)座在一個(gè)染色體上（甚至不同染色體上）若有同一轉(zhuǎn)座子的兩個(gè)拷貝，其提供的相同重組位點(diǎn)，可導(dǎo)致缺失、倒子的兩個(gè)拷貝，其提供的相同重組位點(diǎn)，可導(dǎo)致缺失、倒位、插入。位、插入。 方向相同：產(chǎn)生缺失。方向相同：

11、產(chǎn)生缺失。 方向相反：發(fā)生倒位。方向相反：發(fā)生倒位。通過轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的姐妹染色單體間的染色體內(nèi)異位交換通過轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的姐妹染色單體間的染色體內(nèi)異位交換 轉(zhuǎn)座子切離所造成的序列變異 外顯子改組外顯子改組 當(dāng)兩個(gè)近似的轉(zhuǎn)座子被同一轉(zhuǎn)座酶識別而整合到染色當(dāng)兩個(gè)近似的轉(zhuǎn)座子被同一轉(zhuǎn)座酶識別而整合到染色體的鄰近位置時(shí)，則位于它們體的鄰近位置時(shí)，則位于它們之間的序列之間的序列有可能被轉(zhuǎn)座酶有可能被轉(zhuǎn)座酶作用而作用而轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座，如果這，如果這DNA序列中含有外顯子，則被切離并序列中含有外顯子，則被切離并可能插入另一基因中，這種效應(yīng)稱為外顯子改組可能插入另一基因中，這種效應(yīng)稱為外顯子改組(exon shuffli

12、ng)( 圖圖)。 外顯子改組將導(dǎo)致基因組中外顯子改組將導(dǎo)致基因組中新基因的產(chǎn)生新基因的產(chǎn)生。 雙轉(zhuǎn)座子插入所引起的外顯子改組示意圖雙轉(zhuǎn)座子插入所引起的外顯子改組示意圖 （1） 可使原來相距較遠(yuǎn)的基因組合在一起，形成一個(gè)操縱子?？墒乖瓉硐嗑噍^遠(yuǎn)的基因組合在一起，形成一個(gè)操縱子。（2） 把原來兩段分離的把原來兩段分離的DNA序列連在一序列連在一 起，產(chǎn)生一個(gè)新蛋白。起，產(chǎn)生一個(gè)新蛋白。（3） 啟動子部位的插入可使基因打開或關(guān)閉。啟動子部位的插入可使基因打開或關(guān)閉。（4）過多轉(zhuǎn)座（頻率過高）對細(xì)胞不利，細(xì)胞在長期進(jìn)化中形成）過多轉(zhuǎn)座（頻率過高）對細(xì)胞不利，細(xì)胞在長期進(jìn)化中形成 了一些不利于轉(zhuǎn)座的代

13、謝途徑，可與轉(zhuǎn)座過程平衡。了一些不利于轉(zhuǎn)座的代謝途徑，可與轉(zhuǎn)座過程平衡。（5） 轉(zhuǎn)座基因插入時(shí)，大多數(shù)受體基因均被鈍化，但也有基因被轉(zhuǎn)座基因插入時(shí)，大多數(shù)受體基因均被鈍化，但也有基因被 激活。（這是因?yàn)檗D(zhuǎn)座子有自己的啟動子，在使轉(zhuǎn)位酶轉(zhuǎn)錄激活。（這是因?yàn)檗D(zhuǎn)座子有自己的啟動子，在使轉(zhuǎn)位酶轉(zhuǎn)錄 的同時(shí)，也可使相鄰基因轉(zhuǎn)錄）。的同時(shí)，也可使相鄰基因轉(zhuǎn)錄）。轉(zhuǎn)座子效應(yīng)的意義轉(zhuǎn)座子效應(yīng)的意義 2. 轉(zhuǎn)座子作為研究工具轉(zhuǎn)座子作為研究工具 1）基因傳遞載體；）基因傳遞載體； 2）結(jié)構(gòu)重組）結(jié)構(gòu)重組 3）基因突變）基因突變 4）基因表達(dá)）基因表達(dá) 5）克?。┛寺?6）基因作圖）基因作圖四、逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)

14、座子四、逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是真核生物轉(zhuǎn)座子的重要類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是真核生物轉(zhuǎn)座子的重要類型，以型，以RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座只發(fā)現(xiàn)在真核生物中，介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座只發(fā)現(xiàn)在真核生物中，它是由它是由逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒以其以其RNA的基因組的的基因組的DNA拷拷貝序列貝序列插入插入到宿主細(xì)胞的染色體中而產(chǎn)生。逆到宿主細(xì)胞的染色體中而產(chǎn)生。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是宿主轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是宿主DNA基因組的組分，可在基因組的組分，可在基基因組內(nèi)轉(zhuǎn)座因組內(nèi)轉(zhuǎn)座，它在插入位點(diǎn)上產(chǎn)生，它在插入位點(diǎn)上產(chǎn)生正向重復(fù)短正向重復(fù)短序列。序列。 逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與逆轉(zhuǎn)錄病毒相似，但是逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與逆轉(zhuǎn)錄病毒相似，但是env基因基因通常被

15、破壞。通常被破壞。 2. 逆轉(zhuǎn)錄病毒與轉(zhuǎn)座逆轉(zhuǎn)錄病毒與轉(zhuǎn)座結(jié)果有：1）原病毒像溶源性噬菌體DNA，成為宿主基因組的一部分；2）細(xì)胞DNA序列可能與病毒序列重組 ，并經(jīng)過轉(zhuǎn)座作用插入性位點(diǎn)而改變細(xì)胞的性質(zhì)。質(zhì)粒的復(fù)制主要是通過質(zhì)粒的復(fù)制主要是通過型復(fù)型復(fù)制和滾環(huán)復(fù)制兩種方式之一進(jìn)制和滾環(huán)復(fù)制兩種方式之一進(jìn)行的，其中以行的，其中以型復(fù)制為主。型復(fù)制為主。在在型復(fù)制中，有單向復(fù)制和型復(fù)制中，有單向復(fù)制和雙向復(fù)制兩種類型。雙向復(fù)制兩種類型。革蘭氏陰性細(xì)菌中多數(shù)質(zhì)粒是革蘭氏陰性細(xì)菌中多數(shù)質(zhì)粒是以以型方式復(fù)制，型方式復(fù)制，R1、R100等等是單向復(fù)制，是單向復(fù)制，F(xiàn)、R6k等是雙等是雙向復(fù)制類型。向復(fù)制類

16、型。質(zhì)粒復(fù)制的方式質(zhì)粒復(fù)制的方式 質(zhì)粒滾環(huán)復(fù)制示意圖質(zhì)粒滾環(huán)復(fù)制示意圖 在革蘭氏陽性在革蘭氏陽性細(xì)菌中大多數(shù)細(xì)菌中大多數(shù)質(zhì)粒是以滾環(huán)質(zhì)粒是以滾環(huán)方式復(fù)制。方式復(fù)制。 1、ampr：編碼：編碼-內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶 ，可使氨芐青霉素的抗，可使氨芐青霉素的抗菌作用消失菌作用消失2、tetr：編碼：編碼399aa的膜結(jié)合蛋白，阻止四環(huán)素進(jìn)入的膜結(jié)合蛋白，阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)。細(xì)菌內(nèi)。3、camr ：編碼四聚體細(xì)胞質(zhì)蛋白，該蛋白催化氯：編碼四聚體細(xì)胞質(zhì)蛋白，該蛋白催化氯霉素羥乙酰氧基衍生物的生成，此產(chǎn)物不能與核霉素羥乙酰氧基衍生物的生成，此產(chǎn)物不能與核糖體糖體50S亞基結(jié)合。亞基結(jié)合。真核生物的真核生物的

17、DNA質(zhì)粒質(zhì)粒 環(huán)狀DNA質(zhì)粒：酵母2mm質(zhì)粒，植物線立體中的環(huán)狀DNA質(zhì)粒，人和動物的核DNA質(zhì)粒等，它們都是不知其功能的隱蔽質(zhì)粒。 線狀DNA質(zhì)粒：乳酸克魯維酵母的嗜殺線狀DNA質(zhì)粒，植物線粒體中與雄性不育有關(guān)的線狀DNA質(zhì)粒。真核生物的真核生物的RNA質(zhì)粒質(zhì)粒 有殼體的dsRNA質(zhì)粒：由蛋白質(zhì)殼體包裹，存在于某些真菌和植物細(xì)胞中，由于它們酷似病毒，所以也常被稱作真菌病毒和植物隱蔽病毒，或稱類病毒顆粒，典型代表是釀酒酵母的嗜殺dsRNA質(zhì)粒。與RNA病毒的主要區(qū)別是它們不具有感染性 無殼體的dsRNA質(zhì)粒：存在于脂質(zhì)小囊中的栗疫菌減毒dsRNA質(zhì)粒，玉米線粒體中與雄性不育有關(guān)的dsRNA質(zhì)

18、粒。 姊妹染色體姊妹染色體 一一條染色體有兩條染色單體，這兩條染色單體稱為姊妹染色體 等位基因等位基因 等位基因是指在體細(xì)胞內(nèi)位于同源染色體相同位置上的基因u單倍體單倍體(haploid)、二倍體二倍體(diploid) 含有配子染色體數(shù)的生物稱含有配子染色體數(shù)的生物稱單倍體單倍體(n)，它具有正，它具有正常常體細(xì)胞染色體數(shù)的一半。體細(xì)胞染色體數(shù)的一半。二倍體二倍體(2n)是指細(xì)胞含有兩組是指細(xì)胞含有兩組染色體的個(gè)體染色體的個(gè)體 遺傳重組的含義 廣義：廣義：指任何產(chǎn)生新的基因組合，造指任何產(chǎn)生新的基因組合，造成基因型變化的過程，包括獨(dú)立分配和交成基因型變化的過程，包括獨(dú)立分配和交換。（減數(shù)分裂

19、）換。（減數(shù)分裂） 狹義：狹義：指涉及指涉及DNA分子內(nèi)的斷裂并重分子內(nèi)的斷裂并重新連接而造成基因重新組合的過程，即基新連接而造成基因重新組合的過程，即基因交換。因交換。廣義和狹義廣義和狹義遺傳重組的類型1. 同源重組（同源重組（homologous recombination）2. 位點(diǎn)特異性重組（位點(diǎn)特異性重組（site-specific recombination）3. 轉(zhuǎn)座作用（轉(zhuǎn)座作用（transposition）4. 異常重組（異常重組（illegitimate recombination） 一、同源重組一、同源重組(homologous recombination)1.1. 同源

20、重組的產(chǎn)生 同源重組指發(fā)生DNADNA的同源序列之的同源序列之 間，涉及的是大片段同源間，涉及的是大片段同源DNADNA序列的交換。序列的交換。2.2. 同源重組的機(jī)制 目前，大家比較公認(rèn)的是HollidayHolliday 模型。模型。3.3. 同源重組的主要途徑 根據(jù)涉及的蛋白質(zhì)不同，在大 腸桿菌的同源重組分為四種類型：RecBCDRecBCD途徑、RecERecE 途徑、RecFRecF途徑和RedRed途徑內(nèi)切酶內(nèi)切酶內(nèi)切酶內(nèi)切酶( (recBCD)recBCD)DNADNA侵?jǐn)_侵?jǐn)_侵?jǐn)_侵?jǐn)_( (recA)recA)分支遷移分支遷移分支遷移分支遷移( (recA)recA)內(nèi)切酶內(nèi)切酶

21、內(nèi)切酶內(nèi)切酶( (recBCD)recBCD)DNADNA連接酶連接酶連接酶連接酶553355335533553355335533553355335533553355335533553355335533553355333355553355335533HolidayHoliday中間體中間體中間體中間體5533553355335533HolidayHoliday中間體中間體中間體中間體553355335533553355335555553333335555555533333333555555553333333355555555333333335555555533333333內(nèi)切酶內(nèi)切酶內(nèi)切酶內(nèi)切

22、酶( (ruvC)ruvC)內(nèi)切酶內(nèi)切酶內(nèi)切酶內(nèi)切酶( (ruvC)ruvC)DNADNA連接酶連接酶連接酶連接酶DNADNA連接酶連接酶連接酶連接酶二、位點(diǎn)特異性重組二、位點(diǎn)特異性重組(site specific recombination)概念概念 指不依賴于指不依賴于DNADNA序列的同源性，而依賴于能與序列的同源性，而依賴于能與某些某些 酶相結(jié)合的特異酶相結(jié)合的特異DNADNA序列序列間存在的基因重組；這間存在的基因重組；這 些酶能催化特異的些酶能催化特異的DNADNA鏈斷裂和重新連接，發(fā)動鏈斷裂和重新連接，發(fā)動 位點(diǎn)特異性重組。位點(diǎn)特異性重組。 特點(diǎn)特點(diǎn) 1 1）位點(diǎn)特異性重組是在某

23、些特異）位點(diǎn)特異性重組是在某些特異DNADNA序列（位點(diǎn)）序列（位點(diǎn)） 發(fā)生的重組；發(fā)生的重組；2 2）重組中）重組中DNADNA序列發(fā)生了重排。序列發(fā)生了重排。例如：例如： 噬菌體的整合酶識別噬菌體噬菌體的整合酶識別噬菌體DNA和宿主染色和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)，而后發(fā)生的選擇性整合。體的特異靶位點(diǎn)，而后發(fā)生的選擇性整合。2022-2-9 89( (二二) ) 抗體抗體VDJVDJ重排重排利根川進(jìn)揭示了抗體基因重排機(jī)制，獲利根川進(jìn)揭示了抗體基因重排機(jī)制，獲19871987年年NobelNobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)3-D結(jié)構(gòu)2022-2-9 90抗體背景知識抗體背景知識針對上百萬或上

24、億萬的外來抗原，人體免疫細(xì)胞能產(chǎn)生相應(yīng)于針對上百萬或上億萬的外來抗原，人體免疫細(xì)胞能產(chǎn)生相應(yīng)于每種抗原的抗體，按照一個(gè)基因一條多肽連的說法是否說人類每種抗原的抗體，按照一個(gè)基因一條多肽連的說法是否說人類細(xì)胞有如此多的抗體基因呢？細(xì)胞有如此多的抗體基因呢？2022-2-9 91IgGIgAIgMIgDIgE人體含量人體含量最多的抗最多的抗體尤其存體尤其存在于對抗在于對抗微生物及微生物及其毒素的其毒素的細(xì)胞外液細(xì)胞外液人體上皮人體上皮黏液漿液黏液漿液性分泌物性分泌物中的主要中的主要抗體抗體IgM是最是最早出現(xiàn)的早出現(xiàn)的免疫球蛋免疫球蛋白白,是抵御是抵御細(xì)菌的第細(xì)菌的第一道防線一道防線主要表達(dá)主要表

25、達(dá)在淋巴細(xì)在淋巴細(xì)胞表面胞表面體表保護(hù)體表保護(hù)性抗體，性抗體，早期抗微早期抗微生物抗體，生物抗體，與變態(tài)反與變態(tài)反應(yīng)癥狀密應(yīng)癥狀密切相關(guān)切相關(guān)各類免疫球蛋白的生物學(xué)的生物學(xué)特征各類免疫球蛋白的生物學(xué)的生物學(xué)特征2022-2-9 92基因工程抗體藥物基因工程抗體藥物2022-2-9抗體抗體(antibody),(antibody),又叫免疫又叫免疫球蛋白球蛋白(Immunoglobulin),(Immunoglobulin),由四條鏈組成：由四條鏈組成：兩條重鏈，兩條輕鏈兩條重鏈，兩條輕鏈. .輕鏈輕鏈有兩種有兩種: :鏈鏈和和鏈鏈抗體與外來抗原結(jié)合位點(diǎn)稱抗體與外來抗原結(jié)合位點(diǎn)稱為可變區(qū)（為可變

26、區(qū)（V V區(qū)），決定抗區(qū)），決定抗體特異性和多樣性體特異性和多樣性. .其他部其他部分稱為恒定區(qū)（分稱為恒定區(qū)（C C區(qū)），對區(qū)），對同一類抗體同一類抗體C C區(qū)是不變的區(qū)是不變的抗體的蛋白序列抗體的蛋白序列2022-2-9 94人體有人體有5種主要的重鏈，形成種主要的重鏈，形成5類免疫球蛋白類免疫球蛋白2022-2-9 95抗體基因是多基因片段編碼的抗體基因是多基因片段編碼的: : V V區(qū)區(qū) 抗體輕鏈中主要由抗體輕鏈中主要由V V基因編碼，基因編碼，J J基因編碼最基因編碼最后后1212個(gè)氨基酸；抗體重鏈中個(gè)氨基酸；抗體重鏈中V V和和J J之間還有一些之間還有一些D D（diversit

27、ydiversity）基因片段）基因片段 C C區(qū)區(qū) 由由C C基因編碼基因編碼1.1.抗體的基因抗體的基因2022-2-9 96抗體基因片段在基因組中的分布抗體基因片段在基因組中的分布FamilyV GenesC GenesManMouseManMouseLambda64Kappa100098 Each immunoglobulin family consists of a cluster of V genes linked to its C gene(s).2022-2-9 97The lambda family consists of V gene segments linked to

28、a small number of J-C gene segments.輕鏈基因多樣性輕鏈基因多樣性胚系胚系DNA中中 The human and mouse kappa families consist of V gene segments linked to 5 J segments connected to a single C gene segment.輕鏈基因多樣性輕鏈基因多樣性胚系胚系DNADNA中中2022-2-9 98A single gene cluster in man contains all the information for heavy-chain gene as

29、sembly.抗體重鏈基因多樣性抗體重鏈基因多樣性胚系胚系DNA中中2022-2-9 99 那么，抗體基因何時(shí)發(fā)生重排那么，抗體基因何時(shí)發(fā)生重排? ? 如何重排如何重排? ? 有無規(guī)律可循有無規(guī)律可循? ?2022-2-9 1002.2.抗體的重排機(jī)制抗體的重排機(jī)制 胚系胚系DNADNA中并不存在每條中并不存在每條H H鏈和每條鏈和每條L L鏈的完整基因鏈的完整基因, ,而是在而是在B B細(xì)胞的早期發(fā)育過程中細(xì)胞的早期發(fā)育過程中, ,通過小段的基因通過小段的基因片段拼接而成片段拼接而成. .如如輕鏈輕鏈: :一個(gè)一個(gè)VV和一個(gè)和一個(gè)JJ連接連接成成V-J,V-J,當(dāng)當(dāng)B B細(xì)胞抗體基因被轉(zhuǎn)錄后

30、細(xì)胞抗體基因被轉(zhuǎn)錄后, ,細(xì)胞核細(xì)胞核RNARNA的剪接使得的剪接使得V-JV-J與與CC相連接相連接. .(1)(1)、可變區(qū)重排特點(diǎn)、可變區(qū)重排特點(diǎn) 輕鏈重排特點(diǎn)輕鏈重排特點(diǎn) V-JV-J 輕鏈有兩大家族：輕鏈有兩大家族：和和(大部分抗體是大部分抗體是輕鏈輕鏈) ) 重鏈重排特點(diǎn)重鏈重排特點(diǎn) V-D-JV-D-J2022-2-9 101抗體抗體、輕鏈可變區(qū)重排過程輕鏈可變區(qū)重排過程2022-2-9 102D-JV-DV-D-J抗體重鏈可變區(qū)重排過程抗體重鏈可變區(qū)重排過程2022-2-9 103a. a. 基因兩旁有保守的共有序列基因兩旁有保守的共有序列7 7聚體、聚體、9 9聚體聚體（co

31、nsensus sequenceconsensus sequence） b. 7b. 7聚體和聚體和9 9聚體間有非保守的重排信號序列聚體間有非保守的重排信號序列(recombination signal sequence,RSS)(recombination signal sequence,RSS)，12bp12bp或或23bp23bpc. c. 重排規(guī)則重排規(guī)則:12/23:12/23規(guī)則，即規(guī)則，即12bp12bp的信號序列總是與的信號序列總是與23bp23bp的信號序列連接，從而保證重鏈與輕鏈的正確的信號序列連接，從而保證重鏈與輕鏈的正確連接連接(2)(2)、重排及重排信號、重排及重排

32、信號2022-2-9 104232323121212蘭色：蘭色：7聚體聚體綠色：綠色：9聚體聚體重鏈可變區(qū)的重鏈可變區(qū)的VDJVDJ重排重排2022-2-9 105(3).(3).重組酶重組酶 a. a. 重組激活基因，重組激活基因，RAGRAG（recombination activating gensrecombination activating gens）基因編）基因編碼的重組酶碼的重組酶: :識別識別RSSsRSSs和切斷七聚體和基因片和切斷七聚體和基因片段。段。RAG-1RAG-1和和RAG-2RAG-2在在Pre-T Pre-T 和和Pre-BPre-B細(xì)胞表達(dá)，細(xì)胞表達(dá)，因此成

33、熟的淋巴細(xì)胞不再進(jìn)行抗原受體基因的因此成熟的淋巴細(xì)胞不再進(jìn)行抗原受體基因的重排。重排。 b. TdTb. TdT（末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶）：（末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶）：不需要模板將核苷酸加到不需要模板將核苷酸加到DNADNA單鏈斷裂處。單鏈斷裂處。2022-2-9 106關(guān)于關(guān)于VDJVDJ重排的總結(jié)重排的總結(jié): :抗體的多樣性和抗原結(jié)合的特異性由其可變區(qū)抗體的多樣性和抗原結(jié)合的特異性由其可變區(qū)決定決定, ,因此重排是指因此重排是指H H鏈和鏈和L L鏈可變區(qū)的重排鏈可變區(qū)的重排, ,重重排產(chǎn)生堿基的丟失和增加；排產(chǎn)生堿基的丟失和增加；重排發(fā)生在重排發(fā)生在DNADNA水平水平, ,而剪接發(fā)生在而剪

34、接發(fā)生在RNARNA水平；水平；L L鏈可變區(qū)發(fā)生鏈可變區(qū)發(fā)生V-JV-J重排重排,H,H鏈發(fā)生鏈發(fā)生V-D-JV-D-J重排；重排；抗體多樣性產(chǎn)生的原因一方面是抗體多樣性產(chǎn)生的原因一方面是B B細(xì)胞成熟前發(fā)細(xì)胞成熟前發(fā)生的重排，另一方面是體細(xì)胞突變。當(dāng)一個(gè)產(chǎn)生的重排，另一方面是體細(xì)胞突變。當(dāng)一個(gè)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞克隆增殖時(shí)，如果遇到外來抗原，生抗體的細(xì)胞克隆增殖時(shí)，如果遇到外來抗原，將產(chǎn)生抗體基因的突變，從而提供更多種類的將產(chǎn)生抗體基因的突變，從而提供更多種類的抗體，與更多抗原作用。抗體，與更多抗原作用。三、遺傳重組在分子生物學(xué)中的應(yīng)用三、遺傳重組在分子生物學(xué)中的應(yīng)用1. 1. 轉(zhuǎn)基因與基因敲除

35、轉(zhuǎn)基因與基因敲除 通過該技術(shù)可將外源基因精確整通過該技術(shù)可將外源基因精確整 合到宿主細(xì)胞某一特定染色體位點(diǎn)上，也可對某一位合到宿主細(xì)胞某一特定染色體位點(diǎn)上，也可對某一位 點(diǎn)的基因進(jìn)行精確的修飾、加工和剔除，在不影響愿點(diǎn)的基因進(jìn)行精確的修飾、加工和剔除，在不影響愿 基因結(jié)構(gòu)元件的情況下，可使外源基因得以正確表達(dá)，基因結(jié)構(gòu)元件的情況下，可使外源基因得以正確表達(dá)， 從而使生物具有某種性的性狀，并能遺傳給后代，如從而使生物具有某種性的性狀，并能遺傳給后代，如 轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)。轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)。2. 2. 轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用 1 1）生產(chǎn)藥用蛋白；）生產(chǎn)藥用蛋白；2 2）建立人類）建立人類 疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型；疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型；3 3）生產(chǎn)可用于人體器官移）生產(chǎn)可用于人體器官移 植的動物器官；植的動物器官；4 4）提高家蓄產(chǎn)量。）提高家蓄產(chǎn)量。3. 3. 轉(zhuǎn)基因技術(shù)用于疾病的治療轉(zhuǎn)基因技術(shù)用于疾病的治療 應(yīng)用基因工程技術(shù)將外源性應(yīng)用基因工程技術(shù)將外源性 基因或特定核酸序列