SNP分型技術ppt課件

1、 SNP分型技術簡介分型技術簡介1SNP概念概念 單核苷酸多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)序列多態(tài)性。性。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每在人類基因組中廣泛存在，平均每5001000個堿基對個堿基對中就有中就有1個，估計其總數可達個，估計其總數可達300萬個甚至更多。萬個甚至更多。 2包括單個堿基的轉換、顛換、插入和缺失等轉換：同型堿基之間 A-G 腺嘌呤-鳥嘌呤 T-C 胸腺嘧啶-胞嘧啶顛換：嘌呤與嘧啶之間A-T、A-

2、C、C-G、G-T插入的圖片3人體許多表型差異、對藥物或疾病的易感性等等都可人體許多表型差異、對藥物或疾病的易感性等等都可能與能與SNP有關。有關。心臟病、癌癥、糖尿病、精神病等復雜性疾病是心臟病、癌癥、糖尿病、精神病等復雜性疾病是遺傳遺傳和環(huán)境綜合作用和環(huán)境綜合作用的結果。目前，發(fā)現這些多基因疾病的結果。目前，發(fā)現這些多基因疾病微效基因最有力的方法是對病例組和對照組等位基因微效基因最有力的方法是對病例組和對照組等位基因頻率進行統(tǒng)計學比較，頻率進行統(tǒng)計學比較，SNP是這種分析很好的一種標是這種分析很好的一種標記。記。456789SNP分型技術分型技術4其他檢測方法其他檢測方法質譜分析質譜分析S

3、NaPshotLDR2基基于熒光定量于熒光定量PCR 的檢測方法的檢測方法TaqMan探針法探針法HRM3直接測序法直接測序法1基于電泳的檢測方法基于電泳的檢測方法PCR-RFLPPCR-SSCPAS-PCR10PCR- RFLP由于堿基的變異可能導致酶切點的消失或新的切點出現，從由于堿基的變異可能導致酶切點的消失或新的切點出現，從而引起不同個體在用同一限制酶切時，而引起不同個體在用同一限制酶切時，DNA片段長度出現差片段長度出現差異，這種因內切酶切點變化所導致的異，這種因內切酶切點變化所導致的DNA片段長度的差異，片段長度的差異，稱限制性片段長度多態(tài)性稱限制性片段長度多態(tài)性（restrict

4、ion fragment length polymporphism, RFLP）。）。該技術應用的前提是該技術應用的前提是SNP的位點必須含有該限制內切酶的識的位點必須含有該限制內切酶的識別位點，它是別位點，它是SNP篩查中最經典的方法之一。篩查中最經典的方法之一。11PCR- RFLPv原理：原理：v利用限制性內切酶的酶切位點的特異性，用限制利用限制性內切酶的酶切位點的特異性，用限制性內切酶作用于同一性內切酶作用于同一DNA片斷，如果存在片斷，如果存在SNP位位點，酶切片斷的長度和數量則會出現差異，根據點，酶切片斷的長度和數量則會出現差異，根據電泳的結果就可以判斷是否電泳的結果就可以判斷是否

5、SNP位點。位點。PCR擴增擴增目目的片的片段段限制性內切酶限制性內切酶酶切目酶切目的片的片段段電泳分離電泳分離12rs180062913PCR- RFLP分析14rs1800629 RFLP 結果結果15單鏈構象多態(tài)性法單鏈構象多態(tài)性法 PCR- SSCP原理：原理：單鏈單鏈DNA在中性條件下會形成二級結構，不同的二在中性條件下會形成二級結構，不同的二級結構在電泳中會出現不同的遷移率。級結構在電泳中會出現不同的遷移率。這種二級結構依賴于堿基的組成，單個堿基的改變這種二級結構依賴于堿基的組成，單個堿基的改變也會影響其構象，最終會導致在凝膠上遷移速度的也會影響其構象，最終會導致在凝膠上遷移速度的

6、改變。改變。經經PCR擴增的目的片段在單鏈狀態(tài)下，因其單個堿擴增的目的片段在單鏈狀態(tài)下，因其單個堿基差異，所形成的空間構象不同，其在非變性聚丙基差異，所形成的空間構象不同，其在非變性聚丙稀酰胺凝膠中泳動速度不一樣，從而顯示出帶型的稀酰胺凝膠中泳動速度不一樣，從而顯示出帶型的差異，即多態(tài)型差異，即多態(tài)型16保持在保持在單鏈狀態(tài)單鏈狀態(tài)非變性非變性凝膠電泳凝膠電泳構象不同構象不同呈現多態(tài)呈現多態(tài)性性單鏈構象多態(tài)性法單鏈構象多態(tài)性法 PCR- SSCP17單鏈構象多態(tài)性單鏈構象多態(tài)性(SSCP)分析分析14、79：野生型基因片段；5、6：兩例Val384Asp攜帶者的樣本，顯示變異的SSCP帶型18

7、等位基因特異等位基因特異 PCR ( AS-PCR)原理：原理：根據根據 SNP位點設計特異位點設計特異性性引物引物。其中特異鏈的其中特異鏈的3末末端與端與 SNP位點的堿基互補位點的堿基互補(或相同或相同) ，另一條普通另一條普通鏈按常規(guī)方法進行設計鏈按常規(guī)方法進行設計。因為特異引物在一種基因型中有擴增產物因為特異引物在一種基因型中有擴增產物，在另一在另一種基因型中沒有擴增產物種基因型中沒有擴增產物，用凝膠電泳就能夠很容用凝膠電泳就能夠很容易地分辨出擴增產物的有無易地分辨出擴增產物的有無，從而確定從而確定基因型?；蛐汀?9等位基因特異等位基因特異 PCR ( AS-PCR)20TaqMan

8、 技術技術原理：原理：TaqMan 熒光探針是一種寡核苷酸探針，報告基團在探針的熒光探針是一種寡核苷酸探針，報告基團在探針的5末端，淬滅基團在末端，淬滅基團在3末端。末端。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針。針。PCR擴增時，探針酶切降解，報告基團和淬滅基團分離，擴增時，探針酶切降解，報告基團和淬滅基團分離，發(fā)出熒光信號。每擴增一條發(fā)出熒光信號。每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。產物形成完全同步。如果探針與目標序列中存在錯配

9、堿基，就會影響其釋放熒光如果探針與目標序列中存在錯配堿基，就會影響其釋放熒光的強度，可以通過檢測反應液中的熒光強度確定基因型的強度，可以通過檢測反應液中的熒光強度確定基因型21TaqMan 技術技術22HRMHRM的主要原理是根據的主要原理是根據DNA序列的長度、序列的長度、GC含量以及堿基含量以及堿基互補性差異，應用高分辨率熔解曲線對樣品進行分析，其互補性差異，應用高分辨率熔解曲線對樣品進行分析，其極高的溫度均一性和溫度分辨率使分辨精度可以達到對單個極高的溫度均一性和溫度分辨率使分辨精度可以達到對單個堿基差異的區(qū)分。堿基差異的區(qū)分。231、核酸提取與均一化、核酸提取與均一化2、PCR設計與優(yōu)化設計與優(yōu)化 （引物、條件）（引物、條件）3、qRT-PCR4、Sample Melt(結果檢結果檢 查，查，HRM數據收集數據收集)5、數據分析、數據分析The HRM Analysis Workflow