中藥復(fù)方促使Ｔ淋巴細(xì)胞增殖實驗

1、中藥復(fù)方促使淋巴細(xì)胞增殖實驗    【摘要】 目的 研究中藥復(fù)方促使T淋巴細(xì)胞增殖。方法 從SD大鼠血液里分離淋巴細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)。設(shè)正常細(xì)胞對照組、陽性藥物對照組、轉(zhuǎn)移因子組、復(fù)方中藥高劑量組、中劑量組、低劑量組。培養(yǎng)1 d后把藥加入培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)2 d，加Am-Blue細(xì)胞增殖與活性檢測試劑，避光培養(yǎng)4 h后，通過酶標(biāo)儀檢測，分析淋巴細(xì)胞的增值情況。結(jié)果 中藥復(fù)方高、中、低劑量組OD值均明顯增高，與空白組比較P0.01；與陽性藥物對照組比較，P0.01；高劑量組與中、低劑量組比較P0.01；轉(zhuǎn)移因子組與空白組比較P0.01。結(jié)論 中藥復(fù)方能促使

2、T淋巴細(xì)胞增殖，且與劑量有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 中藥復(fù)方；T淋巴細(xì)胞；增殖 【Abstract】Objective Study of compound traditional Chinese medicine can promote to T-lymphocyte proliferation. Methods Separate T-lymphocyte from blood of SD rat, culture in vitro. Install normal cell control group, active-drug control group, transfer factor group,

3、 compound traditional Chinese medicinehigh dose group、middle dose group，low dose group. Give the medicine to culture medium after culture one day. Continue to culture 2 days and take Am-Blue into 96 orifice plate, culture 4 hours in dark. Use enzyme-labelling measuring instrument to measure after th

4、ree days. Analyse proliferation of T-lymphocyte. Results OD of compound traditional Chinese medicine high dose group、middle dose group、low dose groupcan improve obviously. Theirs compare to blank control group P0.01; theirs compare to Active-drug control group P0.01; compound traditional Chinese med

5、icinehigh dose group compare to middle dose group、low dose group P0.01. transfer factor group compare to blank control group P0.01. Conclusion Compound traditional Chinese medicine can promote to T-lymphocyte proliferation, and relation to dosage. 【Key words】Compound traditional Chinese medicine; T-

6、lymphocyte; Proliferation 轉(zhuǎn)移因子(Transfer factor TF)是從致敏動物的白細(xì)胞或脾臟、淋巴結(jié)等免疫器官中提取的一種低分子量多肽核苷酸復(fù)合物，因其能將供體某種特定的細(xì)胞免疫功能特異地轉(zhuǎn)移給受體，故稱為轉(zhuǎn)移因子。目前對轉(zhuǎn)移因子的研究很多，本研究通過轉(zhuǎn)移因子與中藥的復(fù)方來研究中藥復(fù)方對體外培養(yǎng)的大鼠淋巴細(xì)胞的影響作用，分析復(fù)方轉(zhuǎn)移因子各種組別對細(xì)胞增殖的影響及與劑量的關(guān)系，為后續(xù)的體內(nèi)試驗提供參考依據(jù)，探討復(fù)方中藥免疫增強(qiáng)作用和對復(fù)方轉(zhuǎn)移因子的臨床應(yīng)用開發(fā)奠定基礎(chǔ)。 1材料與方法 1.1 實驗材料 1.1.1 動物SD大鼠，雄性，體質(zhì)量（180±1

7、0）g，清潔級動物，中科院上海實驗動物中心提供。 1.1.2實驗室氣象條件溫度2225，濕度40%70%。 1.1.3試劑與儀器 1.1.3.1試劑 淋巴細(xì)胞分離液（Sigma公司）、RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清（FCS）、Am-Blue細(xì)胞增殖與活性檢測試劑（SunBioTM公司）、PHA（植物凝集素）、IL-2（Sigma公司）；復(fù)方轉(zhuǎn)移因子，本實驗室制備。健康豬脾，用超濾儀超濾，得轉(zhuǎn)移因子溶液（10 mg/ml左右）。中藥（ 紫花地丁、野菊花、甘草等）煎煮2次，濃縮后加食用酒精提取。二者按一定的比例混合，得復(fù)方中藥。復(fù)方中藥中的轉(zhuǎn)移因子含量為0.05g/10ml和中藥生藥含量為5 g

8、/10 ml。 1.1.3.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱（RSBiotech公司）、Elx800酶標(biāo)儀（美國BIO-TEK公司）。 1.2方法 1.2.1 采血 每次試驗均先麻醉SD大鼠，用5 ml注射器（預(yù)先抽取0.2 ml肝素）從大鼠腹主動脈抽血 3 ml。 1.2.2分離 將血液緩慢加入預(yù)先已加入淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，血液與分離液的比例為11。以 4、2000 r/min 離心20 min，液相分為三層，上層為自體血清層，中層為淋巴細(xì)胞層（乳白色云霧狀），下層為分離液和紅細(xì)胞層。用微量進(jìn)樣器抽取淋巴細(xì)胞放入無菌的離心管中。 1.2.3 洗滌 將收集到的淋巴細(xì)胞集中于一支離心管中用PBS洗滌

9、2次，均以2000r/min離心10 min，棄上清。 1.2.4 培養(yǎng) 洗滌后得到的淋巴細(xì)胞團(tuán)用少量RPIM1640培養(yǎng)液(含10血清)打散，用血細(xì)胞計數(shù)板統(tǒng)計調(diào)節(jié)細(xì)胞初始濃度至1×105，取160 µl轉(zhuǎn)入96孔培養(yǎng)板，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，條件為37、5CO2、飽和濕度。 1.2.5 分組 在96孔板中設(shè)置正常細(xì)胞組，陽性藥物對照組（含和），轉(zhuǎn)移因子組（TF組）復(fù)方中藥高劑量組、中劑量組、低劑量組，同時設(shè)置空白對照孔（含培養(yǎng)液和Am-Blue試劑）。 1.2.6 加藥 培養(yǎng)一天后在正常細(xì)胞組中加入40 µl無菌生理鹽水，在陽性藥物對照組中加入40 µ

10、;l PHA（100µg/ml）和IL-2，在TF組中加入40 µl TF，在復(fù)方中藥高劑量組中加入40 µl藥物，中劑量組中加入20 µl藥物和20 µl生理鹽水，低劑量組中加入5 µl藥物和35 µl生理鹽水。培養(yǎng)72 h后加入Am-Blue檢測試劑20 µl/孔。 1.2.7 檢測 培養(yǎng)4 h后，可見無熒光的靛青藍(lán)變?yōu)橛袩晒獾姆奂t色，上酶標(biāo)儀檢測。以570 nm波長檢測各孔OD值。 1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差( ±s)表示,用統(tǒng)計軟件SPSS13.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計

11、方法用單因素方差分析。 2 結(jié)果 2.1 藥物組與正常細(xì)胞組比較對淋巴細(xì)胞增值的影響（見表1）。 由表1可知，陽性藥物對照組，轉(zhuǎn)移因子組，復(fù)方中藥高、中、低劑量組均極顯著地促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增值，P0.01。6個藥物組促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的強(qiáng)弱順序依次為復(fù)方中藥高劑量組復(fù)方中藥中劑量組復(fù)方中藥低劑量組TF組陽性藥物對照組。 2.2 復(fù)方中藥組、TF組與陽性藥物組比較對淋巴細(xì)胞增殖的影響（見表1） 由表1可知，復(fù)方中藥高、中、低劑量組與陽性藥物組比較P0.01；TF組與陽性藥物組比較P0.01。 2.3復(fù)方中藥組高、中、低劑量組比較對淋巴細(xì)胞增殖的影響（見表1） 由表1可知，復(fù)方中藥高、中劑量組與低劑量

12、組比較P0.01。 可見復(fù)方中藥對淋巴細(xì)胞的增值作用與劑量關(guān)系密切。 3 討論 機(jī)體免疫系統(tǒng)中淋巴細(xì)胞增殖是機(jī)體對非己抗原刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答過程中的重要事件。淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果表現(xiàn)為產(chǎn)生效應(yīng)淋巴細(xì)胞。清除非己抗原，維護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。T細(xì)胞活化是細(xì)胞免疫應(yīng)答早期的重要變1,化淋巴細(xì)胞增殖效果決定效應(yīng)淋巴細(xì)胞的數(shù)量，決定了機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)的強(qiáng)度，反映機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)2。因此，淋巴細(xì)胞增殖實驗的結(jié)果是細(xì)胞免疫的一個測定指標(biāo)。 轉(zhuǎn)移因子(Transfer factor，TF)是存在于人和動物免疫淋巴細(xì)胞內(nèi)的可透析的小分子物質(zhì)，屬于多肽和多核苷酸類，分子質(zhì)量大約為315 ku。TF成分復(fù)雜，它能夠特異性

13、將供體細(xì)胞免疫力傳遞到受體細(xì)胞內(nèi)，特異性地增強(qiáng)受體免疫功能，是一種新型免疫激發(fā)劑，且具有傳遞免疫信息、激發(fā)免疫細(xì)胞活性、調(diào)節(jié)免疫功能、增強(qiáng)機(jī)體非特異性細(xì)胞免疫功能等作用，被譽為T細(xì)胞活性的觸發(fā)劑，細(xì)胞免疫的增強(qiáng)劑、細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)劑及干擾素產(chǎn)生啟動劑3。轉(zhuǎn)移因子自1953被Sherwood Lawrence4發(fā)現(xiàn)以來,作為具有特異和非特異性免疫活性的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子,免疫增強(qiáng)劑已顯示出其廣闊的應(yīng)用前景,也吸引著大批國內(nèi)外科學(xué)工作者從事轉(zhuǎn)移因子實驗及臨床研究。轉(zhuǎn)移因子對各類疾病的治療機(jī)理的報道也日趨增多。目前很多學(xué)者將TF應(yīng)用于特種經(jīng)濟(jì)動物傳染病的治療，取得較大的進(jìn)展5。 PHA和IL-2能促使體外淋巴

14、細(xì)胞增殖，IL-2是淋巴細(xì)胞體外增殖的必備條件。本實驗PHA和IL-的用量分別是100 µg/ml、100 µg/ml。本實驗使用Am-Blue 細(xì)胞增殖與活性檢測試劑來替換MTT。Am- Blue 細(xì)胞增殖與活性檢測試劑是一種能簡便、迅速、可靠地定量檢測多種動物細(xì)胞系、細(xì)菌、真菌增值與活性的試劑。與MTT相比有以下優(yōu)點：1，操作簡捷，一步到位；2，無細(xì)胞毒，后續(xù)可用；3，應(yīng)用廣泛，用途多樣；4，雙色檢測，靈敏度高；兼容性強(qiáng)，穩(wěn)定性好。如今在國外使用頻繁。 本實驗結(jié)果顯示，8個組均能不同程度低促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增值，復(fù)方中藥組明顯優(yōu)于其他組，尤以復(fù)方中藥組促進(jìn)淋巴細(xì)胞增值的作用最佳，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01）。提示復(fù)方中藥可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增值，且效果明顯，中藥與轉(zhuǎn)移因子組成的復(fù)方不是簡單的相加，它們在發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能時具有協(xié)同促進(jìn)作用。這為進(jìn)一步探討復(fù)方中藥的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 參考文獻(xiàn) 1 侯會娜,曾耀英，等. 金銀花提取物對小鼠淋巴細(xì)胞體外活化與增殖的影響.免疫學(xué)雜志，2008，24（2）：183. 2 趙潔，王曦鳴，李繼祥. MTT法檢測淋巴細(xì)胞增殖能力的影響因素.畜禽業(yè)，2008，226（2）：28. 3孫衛(wèi)民，王惠琴細(xì)胞因子研究方法學(xué).人民衛(wèi)生出版社，20