乳酸菌的分離、純化與鑒定

1、乳酸菌的別離、純化與鑒定第一局部：乳殿菌的別離、純化一、實(shí)馳H林:1實(shí)驗(yàn)藥品 新勢(shì)乳酸伏料市售、骯脂妍粉、糖、1.6%渓甲酗綠乙醇落液 （渙甲酗綠、無(wú)水乙醇）、6?母音、竦脂、革蘭氏染液給晶紫染液、盧戈氏碘液、 95%乙醇、沙黃、75%乙醇、香柏油、1mol/LNaOH. 1mol/LHCk碳酸鈣；0.4gNaOH 固體、4.2ml 濃 HCL（分析純）、20gCaC03 固體、»BS20g、尿脂 30g香柏油、股脂100g、蔗糖10g；2. 儀器與毀備高壓蒸汽滅菌錯(cuò)、光學(xué)顯攢鏡、培養(yǎng)箱、PH試奴、KfLJIE培 養(yǎng)DD （p9或02、試管、300ml三角）帶玻珠、務(wù)液管、天平、50

2、0ml 錐形期、250ml «形敗、250ml燒杯。二、實(shí)驗(yàn)步1. 培養(yǎng)基配制（BCG牛乳培養(yǎng)基:A濬液:取臟脂乳粉100g,水500ml,參UH 1.6%澳甲酚氯乙諄落液1ml,混合均勻后分裝人三角筋于高壓蒸汽滅菌錯(cuò)80Y滅菌20min； 1.6%渙甲苯酚 綠BCG）乙醇濬液用1.6。澳甲酚綠參HD 20ml無(wú)水乙醉中，再加水至100ml 成B濬液：S?St 10g,水 500ml, CaC0310g,球脂 20g,加熱濬解,用精細(xì)pH試址隅節(jié)pH到6.&分裝人三角瓶后在103kPa121t高壓蒸汽滅菌20Min。 以無(wú)菌操作趁熱將（A）濬液均勻混合。2. 藥品配胃2.1結(jié)

3、晶紫：結(jié)晶紫乙醇飽和液結(jié)晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中20ml, 1%草 酸氨水濬液80mlo將兩液混勻,故置24小時(shí)后過(guò)濾即可。2.2盧哥氏碘液：» 1g,碘化押2g,蒸錨水300mlo先將碘化卻溶于少量蒸耀水 中,然后參加碘使之完全溶解，再參加藪耀水300mll!|l成。2.3蕃紅溶液：番紅2.5g, 95%乙g? 100ml, 解后存于密閑的棕色毗中。用時(shí) ® 20ml 80ml蒸耀水混勻即可。2.4 0.1% 的呂氏美藍(lán)染液：A 液:美 1 0.3g, 95% 乙 ® 300ml； B 液：0.01% KOH 100mlo混合A和B液即成，按1： 10

4、0SS®可。2.4生理鹽水：稱(chēng)取9。氯化鈉,溶解在少量蒸18水中，髀51 1000毫升。3. 菌懸叛的配胃取1干淨(jìng)三角眥，盛U 225ml生理鹽水；7只干淨(jìng)試管，各盛9ml的生理鹽 水；加塞色扎于在103kPa121t高壓蒸汽滅菌20Min,得對(duì)無(wú)菌生理鹽水。將酸妍樣晶攪拌均勻，用無(wú)菌務(wù)液管吸取樣品25ml參加盛有225ml無(wú)菌生理鹽 水的三角毗中，在旋渦均勻器上充分振搖，使樣晶均勻分散，即為10-1 m樣晶 稀釋液;將7只裝9ml生理鹽水的無(wú)菌試管，依次標(biāo)記10-2. 10-3. 10-4. 10-5.10-6. 10-7,再用無(wú)菌務(wù)液管吸10-1的菌懸液1ml赦人依次裝有9ml無(wú)

5、菌水的 試管中，秸牌混勻便得到10-2榆釋液，如此重夏依次制1§ 10-310-7的榆釋液。4. 倒平板取無(wú)菌平W12個(gè)，編號(hào)標(biāo)明10-1. 10-5. 10-6. 10-7各三套；將經(jīng)高淚消 毒的培養(yǎng)基冷卻到50丫左右，按無(wú)菌操作法fill 12只平板，每Ml約15ml；平置使培養(yǎng)基血?jiǎng)蚍植荚贗D1IK,侍甜固。5.別離方法A. 平極則線接種壞挑取10-1菌液，按無(wú)菌操作對(duì)標(biāo)有"10-1"的3個(gè)平板進(jìn)展劃操作; 劃線完畢后，蓋上ID1蓋，制置朋在40T恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。B. 平板涂布用三支1ml無(wú)菌楊液管分別吸®I 10-5. 10-6和10-

6、7的柿釋菌懸液各1ml, 對(duì)號(hào)接種于與之對(duì)應(yīng)的3個(gè)無(wú)菌平板中,毎個(gè)平0.1ml；盡快用無(wú)菌玻璃涂 棒將菌液在平極上涂布均勻，平笊干試驗(yàn)臺(tái)上20Min；然后刮置干40Y恒溫箱 中培養(yǎng)48小時(shí)。6.|»脂乳試管的8!制與滅菌直接選用骯脂乳液或按St脂妍粉10克與鷹糖5克，水95克蔗糖與水的比 例在1： 10M圍的比例配制，裝量以試菅的1/3為宜,115T滅a 15mino7. 菌落現(xiàn)察恒淚培養(yǎng)48小時(shí)U后，取岀培養(yǎng)平極；選擇菌落分布較好的平極，先對(duì)其 菌落形態(tài)進(jìn)展觀察，初步找岀乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，大約 園形隆起，外表光滑或ffifflliS,呈乳白色、灰白色或略黃色；在產(chǎn)戲菌落

7、周?chē)€ 能產(chǎn)生CaCO3的溶解圈。40（培養(yǎng)48h, ftO岀觀冏形ffi扁平的黃色菌落員其周?chē)?培養(yǎng)基變?yōu)辄S色者初步定為乳酸菌。8. 乳酸菌的別離純化選取乳酸菌萸型菌落轉(zhuǎn)致腕脂乳試管中，40咒培養(yǎng)824h假設(shè)牛乳岀現(xiàn)甜 固，無(wú)氣泡，顯酸性，涂片鏡檢細(xì)胞H狀或璉球狀，革蘭氏染色顯訊性，那么可 將其連續(xù)傳代3次，最終選擇岀在36h能凝同的牛乳管，作菌種侍用。9. 乳酸發(fā)醉及檢査發(fā)醉：觀察BCG培養(yǎng)基巾乳酸菌菌落特征，選取長(zhǎng)矜比好的菌落無(wú)菌操 作下將乳酸菌接種于裝有骯脂乳的試管中，4042t靜止培養(yǎng)。取干淨(jìng)載玻片一塊，在載玻片中央加一漓生理鹽水，無(wú)菌操作法取少量菌休 涂片；箱晶紫初染碘液媒染-乙B

8、HR色一 番紅夏染，枯煤后用油饋觀察，菌體 被染成藍(lán)紫色的是乳酸菌；其中保加利亞乳桿菌呈桿狀，成單桿、雙桿或長(zhǎng)絲狀; 瞰熱!ft球菌，呈球狀，成對(duì)或姬犍或長(zhǎng)璉狀。革蘭氏Bill,無(wú)芽胞的球菌或桿 菌可定為乳酸菌，記錄測(cè)定結(jié)果。第二局部：乳殿菌鑒定一、實(shí)1蛋白隊(duì)水培養(yǎng)基：蛋白味10g,氯化抽5g,水1000 ml, PH : 7.2 7.4121攝氏度濕熱滅菌20 min2糖發(fā)8?培養(yǎng)基：蛋白麻水培養(yǎng)基1000 ml,1.6%S!甲酚紫乙filiS® V2 ml ,PH : 7.6,另配20%糖溶液葡萄糖，臆糖各10ml.3有關(guān)試劑1.6%渙甲酗紫乙醇落液：渙甲酚紫1.6g i

9、7;T 100 ml乙醇中，貯存于棕 色瓶中保存?zhèn)溆?。昭咪試劑：?duì)二甲基氨基苯甲廉8 g , 95 %乙醉760 ml,濃鹽酸160 ml.10% SK, 2%高鐳酸卻含氨的備酸鹽濬液:稱(chēng)BMKfg 2g,蒸Jg水100 ml,侍琦酸銀溶解后， 取出10 ml備用，向其余的90 ml中滴加氨水，即可形成很厚的沉淀，抵續(xù)湎加氨水至沉淀IO濬解成為澄渭濬液為止，再將備用的WK5E慢慢滴人，影 么溶液岀觀薄霧，但輕輕搖動(dòng)后，薄霧狀的沉淀Q消失，繼續(xù)滴入伸酸!E,直到 搖動(dòng)后的呈現(xiàn)輕攢而隱定的湧霧狀沉淀為止。二、簽定試驗(yàn)1形態(tài)利培養(yǎng)特征現(xiàn)察果用牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基用已純化后的甘油菌種活化后于37T下培養(yǎng)

10、20 24h,并進(jìn)展革蘭氏染色員菌體形態(tài)和菌落特征的觀察。染色方法：涂片固定；草酸錢(qián)給晶紫染1分押；自來(lái)水沖洗；加碘液股蓋涂 面染約1分鉀；水洗，用吸水奴吸去水分；JD 95%酒精數(shù)湎，并輕輕搖動(dòng)進(jìn)展IS 色，20枚后水洗，吸去水分；蕃紅染色液柿染2分抑后，自來(lái)水沖洗?？?«, ft檢。2. 生長(zhǎng)條件試駿耐鹽性試驗(yàn)(NaCI 濃 g:0. 85、1.20 ffi 1.71) (mol/L);(2) 耐酸陵試驗(yàn)(pH:4.3、5.7、6.8、8.4、8.6 和 8. 7);(3) 溫度梯度試驗(yàn)(溫度：10°C、30°C、40咒、50°C、55°C

11、、60°C 和 65t)。分別將參試菌接種于以上處理的液It培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h,記錄生長(zhǎng)狀況。3. 厭氧生長(zhǎng)劇定將菌種接人營(yíng)養(yǎng)肉湯平柿后，用密封帶包好放入C 0 2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)2天后，觀察 生長(zhǎng)悄況,生長(zhǎng)那么為皿性。含Kiff的營(yíng)養(yǎng)肉旳參M 2g M K i¥人營(yíng)養(yǎng)肉湯4. 生理生化試驗(yàn)11氧化氫爾滇定將實(shí)醴菌接種于PGY培養(yǎng)基斜面上,37t培養(yǎng)20h-24h,取一環(huán)接種的培養(yǎng)物, 涂于干淨(jìng)的載玻片上，然后在其上滴DD 3%-15%的過(guò)氧化氮有氣泡期么為陽(yáng)性 反響,無(wú)氣泡為陰性反哨。蛋白陳、倫蔔糖PGY培養(yǎng)基：蛋白KlOg, fi?St 5g ,葡葡糖1g

12、, 蒸耀水1L o (2)甲基虹(M.R)試驗(yàn)接種實(shí)豔細(xì)菌TPYG培養(yǎng)基，于37丫培養(yǎng)2天后，干培養(yǎng)物中參加幾滴甲 基纟I酒精溶液，如呈紅色，表示Ufltlo(3) 月必試驗(yàn)1試管標(biāo)記：取裝有蛋白陳水培養(yǎng)基的試管2支,分別標(biāo)記乳酸菌和空白對(duì) 照。2接種培養(yǎng)：以無(wú)菌操作分別接種少量菌苔到標(biāo)記乳酸菌的試管中,標(biāo)記有 空白對(duì)照的不接種,置37 «氏度恒ia箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)。3.觀察記錄：在培養(yǎng)基中參加乙M12 ml,經(jīng)充分振葫，使昭賒萃取至乙皿 中，靜置片刻后乙皿層浮于培養(yǎng)液的上面，此時(shí)沿管壁緩慢參加5J0漓昭咪試 劑，如有唧«!存在,乙曲層呈玫魂色，此為昭賒試驗(yàn)皿性反哨，

13、否那么為陰性反(4) .糖發(fā)靜試驗(yàn)1.試管標(biāo)記：取分別裝有葡萄糖，蔗糖發(fā)B?培養(yǎng)液試管各2支，毎種糖發(fā)8?試菅中分別標(biāo)記乳酸菌和空白對(duì)照。2.接種培養(yǎng)：以無(wú)菌操作分別接種少量菌苔至以上各相應(yīng)試管巾，毎種糖發(fā)6?培養(yǎng)液的空白對(duì)照均不接菌。將裝有培養(yǎng)液的杜氏小管別置試管中，置37攝 氏BISiB培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí),觀察結(jié)果。3.觀察記錄：匂對(duì)照管比假設(shè)接種培養(yǎng)浪保持原由顧色，其反映結(jié)果為 陰性；如果培養(yǎng)液呈黃色，反映給果為bTltto培養(yǎng)液中的杜氏小管有氣泡為Bill 反響，杜氏小管沒(méi)有氣泡為陰性反響。（5）. as的檢劇選用已經(jīng)別離的菌種做小塑發(fā)酔實(shí)騎，取發(fā)醉液的上清液約10 ml干試管巾,

14、參加10%«K 1ml,BUD 2%高岳酸卽1ml,此時(shí)乳酸轉(zhuǎn)化為乙廉，把事先在含氨 的琦酸銀溶浪中侵泡的濾IK條搭在試管口中，徹火加熱試菅至沸，觀察濾纟K變化。 6乙矗甲基甲諄試螫（V-P試驗(yàn)接種新鮮的實(shí)騎菌種于培養(yǎng)基中,37t培養(yǎng)2天后，取匍萄糖蛋白除培養(yǎng)液1mL在其中參jD1ml10%的NaOH,混勻，再參加3-4滴2%氯化鐵溶液。數(shù)小 時(shí)后，培養(yǎng)基外表的下層岀觀紅色者，為mil.7明膠液化實(shí)崟將實(shí)驗(yàn)菌接種于明阪根底培養(yǎng)基中，置37弋培養(yǎng),以一支未接種的試管作為對(duì)照。將接種的和未接種的對(duì)照管置于冰箱或冷水中,等待對(duì)照管IS固后記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 反夏觀察比照廈次。如對(duì)照管牌固時(shí)，接種管液化為皿性反IO固為明性反響