β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物ppt課件

1、-內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物 山東省藥品檢驗(yàn)所 張雷一.高分子聚合物的研究 （一-內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物的定義與分類 1.定義 藥物中的高分子聚合物系指藥物中分子量大于藥物本身的雜質(zhì)的總稱。其分子量一般在10005000，個(gè)別可至10000道爾頓左右。 2.來源與分類 -內(nèi)酰胺類抗生素藥物中的高分子雜質(zhì)按其來源可分為兩類：外源性雜質(zhì)與內(nèi)源性雜質(zhì)。 2.1外源性雜質(zhì)：一般來源于發(fā)酵工藝，為蛋白、多肽、多糖等雜質(zhì)或與抗生素結(jié)合的雜質(zhì)。如：青霉素中的青霉噻唑蛋白，青霉噻唑多肽。 2.2內(nèi)源性雜質(zhì)：系指抗生素藥物自身聚合產(chǎn)物。聚合物即可來自生產(chǎn)過程，又可在儲(chǔ)存過程中形成；甚至在用藥時(shí)也可以產(chǎn)生，如

2、阿莫西林顆粒。 隨著現(xiàn)代生產(chǎn)工藝的不斷改進(jìn)和提高，目前產(chǎn)品中外源性雜質(zhì)日趨減少，故對(duì)內(nèi)源性聚合物的控制是當(dāng)前抗生素藥物高分子雜質(zhì)控制的重點(diǎn)。 （二-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)的形成機(jī)理及結(jié)構(gòu)特征 -內(nèi)酰胺類抗生素主要包括青霉素和頭孢菌素兩大類。RCONHCHNSCH3CH3COOHO1R2CH2COOHNSONHCHCOR 除青霉素G和V外,臨床中常用的-內(nèi)酰胺類抗生素均為半合成抗生素,故除青霉素G和V中還含有少量的青霉噻唑蛋白外,其他制劑中的高分子雜質(zhì)主要是聚合物。 1. 青霉噻唑蛋白，多肽 制劑中青霉噻唑蛋白，多肽的分子量主要分布在24003500，由青霉素的-內(nèi)酰胺環(huán)和多肽上的伯氨基按親核

3、反應(yīng)機(jī)理縮合而成，主要在發(fā)酵工藝中形成，高pH環(huán)境有利于縮合反應(yīng)的進(jìn)行；樣品在儲(chǔ)存過程中，多肽類雜質(zhì)殘留的自由氨基仍能和-內(nèi)酰胺環(huán)反應(yīng)，直至飽和。1. 青霉素聚合物青霉素的聚合反應(yīng)可按兩種方式進(jìn)行：（1） 反應(yīng)僅和母核結(jié)構(gòu)有關(guān)，側(cè)鏈中的活性基團(tuán)不參與反應(yīng)。CONHCHNSCH3CH3COOOO-COCOOCH3CH3NS-CO NHNHCO-NSCH3CH3COOOCHn（1） 側(cè)鏈參與的聚合反應(yīng)主要以氨芐青霉素為代表，反應(yīng)時(shí)側(cè)鏈的氨基親核攻擊-內(nèi)酰胺抗生素的羰基碳原子，形成聚合物。CONHCHNSCH3CH3OHCOO-CNHCHNH2CHC-COOHOCH3CH3NSNHCHCOCONHC

4、HNSCH3CH3OCOOCCHNHH1. 頭孢菌素的聚合反應(yīng)也包括兩種類型：只依賴于母核的N型聚合反應(yīng)和側(cè)鏈參與的L型聚合反應(yīng)。對(duì)于7位側(cè)鏈中不含有自由氨基的頭孢菌素只能發(fā)生N型聚合反應(yīng)。(三)-內(nèi)酰胺類抗生素質(zhì)量和過敏反應(yīng)的關(guān)系引發(fā)過敏反應(yīng)的過敏原a. 分子量大b. 具有一定抗原決定簇青霉素過敏反應(yīng)中主要抗原決定簇青霉噻唑基BPO）頭孢菌素過敏反應(yīng)中主要抗原決定簇7位R1側(cè)鏈c. 多價(jià)RCONHCHNSCONHHCH3CH3COOH-內(nèi)酰胺類抗生素本身并不是過敏原，而只有當(dāng)它們與蛋白、多肽、多糖等大分子載體共價(jià)結(jié)合成全抗原或本身聚合成多價(jià)半抗原后才能引發(fā)過敏反應(yīng)。（四）.影響聚合物形成的因

5、素1. 青霉素的聚合物青霉素的聚合物反應(yīng)速度在液體條件下和溶液的酸堿度關(guān)系密切；在固體條件下主要和樣品的水分含量有關(guān)。2. 頭孢菌素的聚合物固體狀態(tài)下頭孢菌素類產(chǎn)品聚合速度與含水量和貯存溫度關(guān)系密切，試驗(yàn)表明，貯存溫度較低時(shí)，含水量差異堆聚合物含量盡管有影響，但影響不大。但當(dāng)貯存溫度上升至37攝氏度時(shí)含水量差異對(duì)聚合物含量的影響十分顯著。3.工藝不同 如氨芐青霉素有溶媒結(jié)晶和噴霧干燥兩種，一般后者的聚合物要明顯多于前者。（五）.口服青霉素類藥物使用前進(jìn)行皮試的必要性 口服青霉素，如青霉素V鉀與其他注射用青霉素一樣可以形成高分子聚合物，其聚合速度與藥物濃度、反應(yīng)溫度及pH等有關(guān)。制備的青霉素V聚

6、合物的豚鼠皮膚被動(dòng)過敏試驗(yàn)PCA陽性，口服青霉素V高聚物后，30分鐘血清中可檢出高聚物；在30分鐘到1小時(shí)可引發(fā)豚鼠PCA反應(yīng)陽性，從而證明青霉素中高分子聚合物可經(jīng)胃腸道吸收而引發(fā)過敏反應(yīng)。二.高分子雜質(zhì)分析方法（一概述： 國(guó)內(nèi)外已有許多分離、分析-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)的報(bào)道。色譜法是主要分離分析的方法。其分離模式有三類：（1反相模式2離子交換模式3凝膠色譜模式 由于結(jié)構(gòu)不同的高分子雜質(zhì)通常有相似的生物學(xué)特性，因此，在藥品質(zhì)量控制中一般不需分別控制不同結(jié)構(gòu)的高分子雜質(zhì)含量，而只需控制商品中高分子雜質(zhì)的總量。故根據(jù)分子量差異進(jìn)行分離的凝膠色譜模式是簡(jiǎn)便易行的分離模式。（一凝膠色譜分析法的原

7、理：1. 分離原理利用凝膠色譜的分子篩機(jī)制，讓藥物分子自由進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，而高分子雜質(zhì)被排阻不能進(jìn)入，在色譜過程中不被保留，最早被流動(dòng)相洗脫。2. 凝膠介質(zhì)根據(jù)-內(nèi)酰胺類抗生素和其高分子雜質(zhì)分子量的特點(diǎn)，比較數(shù)種凝膠介質(zhì)，最后選用Sephadex G-10作為凝膠介質(zhì)排阻分子量在1000道爾頓左右）。（一分析方法1. 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)為保證不同實(shí)驗(yàn)室間測(cè)定的精密度符合規(guī)定，要求方法系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)：理論板數(shù)及拖尾因子：用藍(lán)色葡聚糖2000的溶液1mg/ml作為參比溶液，測(cè)定在流動(dòng)相A、B中的Kav0的保留時(shí)間，并計(jì)算出理論板數(shù)及拖尾因子。在兩種流動(dòng)相系統(tǒng)中藍(lán)色葡聚糖2000峰的保留時(shí)間比值應(yīng)在0

8、.931.07之間，對(duì)照溶液主峰與供試品溶液中聚合物峰與相應(yīng)色譜系統(tǒng)中藍(lán)色葡聚糖2000峰的保留時(shí)間比值應(yīng)為0.931.07。藥物分子和凝膠介質(zhì)間的相互作用和藥物的結(jié)構(gòu)有關(guān)。其色譜分析受色譜條件如：流動(dòng)相的組成、濃度、pH、流速等因素的影響。所以可通過改變色譜調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)藥物分子和凝膠介質(zhì)間的相互作用，使高分子雜質(zhì)和藥物分子間的分離良好，通過對(duì)流動(dòng)相與洗脫速度的優(yōu)化，已成功建立數(shù)十種-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)的分析方法。2. 自身對(duì)照的外標(biāo)法由于-內(nèi)酰胺抗生素的高分子雜質(zhì)具有高度的不均一性和不確定性，高聚物本身不穩(wěn)定，不易制備。用高聚物本身作為對(duì)照的外標(biāo)法定量有一定難度。同時(shí)由于高分子雜質(zhì)含量較低

9、，進(jìn)樣量一般相對(duì)較大，是藥物本身色譜峰十分寬大，導(dǎo)致主峰的峰面積積分誤差較大，因此也限制了面積歸一化法的應(yīng)用。試驗(yàn)證明，在特定條件下，-內(nèi)酰胺抗生素可締合形成表觀分子量較大的締和物，締和物在Sephadex G-10凝膠色譜系統(tǒng)種色譜行為與高分子雜質(zhì)一樣，都在Kav0處表現(xiàn)為單一色譜峰，利用這一特點(diǎn)，在Sephadex G-10凝膠色譜系統(tǒng)種制定了新的定量方法自身對(duì)照外標(biāo)法。三2019年版-內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物法增修訂概況（一）.修訂內(nèi)容1. 對(duì)原收載的8個(gè)品種的色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)均與新增品種項(xiàng)下書寫格式相同。2. 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：統(tǒng)一為理論板數(shù)以藍(lán)色葡聚糖2000峰計(jì)算均不低于。

10、拖尾因子均應(yīng)小于2.0，在兩種流動(dòng)相系統(tǒng)中藍(lán)色葡聚糖2000峰保留時(shí)間比值均應(yīng)在0.931.07之間；對(duì)照溶液主峰與供試品溶液中聚合物峰與相應(yīng)色譜系統(tǒng)中藍(lán)色葡聚糖2000峰保留時(shí)間的比值均應(yīng)在0.931.07。3. 對(duì)照品溶液修改為對(duì)照溶液4. 頭孢他啶聚合物項(xiàng)下，流動(dòng)相A由原來的含3.5硫酸銨的pH7.0的0.01M磷酸鹽緩沖液修訂為含3.5硫酸銨的pH7.0的0.1M磷酸鹽緩沖液。四. 操作要點(diǎn)(一).色譜條件中流動(dòng)相A的組成與濃度，pH值及流速對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。1. 流動(dòng)相的組成與濃度：本方法流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液。用不同濃度的磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相時(shí)，藥物分子的色譜行為隨其濃度的增加，主

11、峰的保留時(shí)間也隨之增大。2. 流動(dòng)相的pH值對(duì)聚合物檢出的影響：相同濃度，pH不同，樣品分離情況也不同，如阿莫西林在pH7.0的0.05M磷酸鹽緩沖液分析時(shí)無聚合物峰檢出，而改用pH8.0的0.05M磷酸鹽緩沖液則分離良好。3. 流速：調(diào)節(jié)流速可改變色譜峰的保留時(shí)間，已達(dá)到最佳分離效果。（二）.有關(guān)對(duì)照溶液測(cè)定的幾個(gè)注意點(diǎn)試驗(yàn)證明，-內(nèi)酰胺類抗生素在特定的條件下，如水，0.01SDS或0.5葡萄糖溶液作為流動(dòng)相B，可締合成表觀分子量極大的締和物，其色譜行為與高分子雜質(zhì)一樣，都在Kav0流出，表現(xiàn)為單一色譜峰，利用這一特點(diǎn)，作為測(cè)定方法中新的定量法自身對(duì)照外標(biāo)法。但由于-內(nèi)酰胺類抗生素品種繁多，

12、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，故在研究制定各品種方法學(xué)時(shí)，出現(xiàn)以下幾個(gè)問題：1. 有關(guān)對(duì)照溶液保留時(shí)間與藍(lán)色葡聚糖2000峰保留時(shí)間不一致的問題。如頭孢拉定，可能Sephedex G-10對(duì)頭孢拉定有一定吸附作用引起，可以通過用0.2M氫氧化鈉和0.5M氯化鈉溶液約350ml沖洗凝膠柱，然后用水沖洗至中性，使凝膠柱活化，改善保留時(shí)間不一致情況。1. 標(biāo)準(zhǔn)中系統(tǒng)適用性試驗(yàn)項(xiàng)下要求：取對(duì)照溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，其峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于5.0%。經(jīng)試驗(yàn)證明，青霉素鈉，頭孢曲松鈉，頭孢呋辛鈉等大部分品種均能符合要求，且五次記錄的色譜圖峰的重現(xiàn)性好，但阿莫西林連續(xù)五次進(jìn)樣，峰高逐漸降低，而峰寬逐漸增加，色譜柱用上述方法處理

13、活化后略有改善，但仍不可能道道五個(gè)峰的重疊。以上現(xiàn)象可能與阿莫西林分子結(jié)構(gòu)有關(guān)?？紤]阿莫西林為青霉素的半合成產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)中有與青霉素相似的母核，而其分子量也較接近，而青霉素在水中的締合物穩(wěn)定，重現(xiàn)性好故決定用青霉素作為對(duì)照品，并加校正因子計(jì)算結(jié)果。 -內(nèi)酰胺類個(gè)別品種在特定條件下出現(xiàn)不能完全締合現(xiàn)象。如硫酸頭孢噻利，硫酸頭孢匹羅。（三）.樣品測(cè)定的幾個(gè)注意點(diǎn)1. 低聚物對(duì)高聚物分離度的影響。1. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的積分處理凝膠色譜結(jié)果的特殊性a. 色譜峰不能達(dá)到基線分離b. 色譜峰的對(duì)稱性較差或拖尾嚴(yán)重上述情況帶來數(shù)據(jù)處理的復(fù)雜性，難以調(diào)整峰寬、斜率等參數(shù)得到合理的積分值。（四）.有關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)1. 凝膠

14、的預(yù)處理要求新使用的凝膠：充分溶脹 室溫20攝氏度需3小時(shí)以上，煮沸需1小時(shí)已使用過的凝膠再生：先用0.2MNaOH與0.5MNaCl混合液浸泡半小時(shí)后用水洗至中性，裝柱。1. 裝柱要點(diǎn)a. 凝膠漿濃度應(yīng)適合一般為70）水混懸液，分散均勻不結(jié)團(tuán)不宜強(qiáng)烈攪拌）。b. 避免空氣泡。c. 填充時(shí)應(yīng)盡可能使?jié){液均勻分布，防止分層與氣泡產(chǎn)生。1. 色譜柱維護(hù)保養(yǎng)a. 葡聚糖凝膠耐受壓力為0.3兆帕，過高壓力會(huì)損傷填料性能。b. 防止柱子長(zhǎng)霉可用20乙醇或0.04疊氮鈉保存。c. 防止柱子受污染可用0.2M氫氧化鈉和0.5M氯化鈉混合液沖洗凝膠柱，然后用水沖洗至中性1. 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)要求（1） 藍(lán)色葡聚糖2000色譜行為的特殊意義a. 保留時(shí)間表示流動(dòng)相流速確定條件下的Kav0的洗脫時(shí)間，即相當(dāng)于被排阻的聚合物洗脫