急性出血性結(jié)膜炎的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1、附件2急性出血性結(jié)膜炎的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)一、病毒的分離與鑒定（一）標(biāo)本的采集、運(yùn)送和保存1患眼結(jié)膜囊淚液、分泌物是分離CA24v、EV70的主要標(biāo)本。標(biāo)本采集應(yīng)在起病13天以內(nèi)。2. 用滅菌棉拭子涂擦翻轉(zhuǎn)的上、下瞼結(jié)膜并拭取淚液立即投入裝有滅菌生理鹽水或Eagle液或0.5%水解乳蛋白Hanks液2mL的小試管中，貼好標(biāo)簽，置冰壺內(nèi)攜至實(shí)驗(yàn)室或低溫（-20-70）凍存。（二） 病毒分離1 取出標(biāo)本，無(wú)菌條件下揉洗棉拭子，壓擠出標(biāo)本液，加10青霉素、鏈霉素（原濃度青霉素、鏈霉素各1萬(wàn)u/mL），置4作用4h后用作病毒分離。2. 細(xì)胞培養(yǎng)用生長(zhǎng)單層的HeLa細(xì)胞或人胚肺二倍體細(xì)胞或其他敏感細(xì)胞，生長(zhǎng)液為

2、10%牛血清Eagle液，含青霉素100u/mL，鏈霉素100u/mL，pH7.2-7.4。3傾去細(xì)胞管內(nèi)生長(zhǎng)液。每細(xì)胞管接種標(biāo)本液0.2mL吸附10min。每份標(biāo)本液接種4個(gè)細(xì)胞管。加維持液（含2%牛血清的Eagle液，PH 7.27.4）0.8mL/管。余標(biāo)本液置-20或-70凍存。細(xì)胞對(duì)照管4管，每管加維持液1.0mL。     37溫箱靜置培養(yǎng)。每日光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞病變。3-4天更換維持液一次，連續(xù)觀察7天。4細(xì)胞管出現(xiàn)細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、分散、胞漿內(nèi)顆粒增加，最后細(xì)胞自管壁脫落，為分離陽(yáng)性結(jié)果。細(xì)胞病變達(dá)“+ - +”時(shí)，將細(xì)胞收留凍

3、存于-20或-70，備TCID50滴定及病毒鑒定。第1代培養(yǎng)見(jiàn)可疑細(xì)胞病變時(shí)繼續(xù)傳代，待細(xì)胞病變穩(wěn)定出現(xiàn)后-20或-70凍存。第1代培養(yǎng)培養(yǎng)7日不出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)連續(xù)盲傳2代，如仍無(wú)細(xì)胞病變則分離結(jié)果為陰性。（三）病毒TCID50滴定1陽(yáng)性細(xì)胞管凍融3次。2000rpm離心10分鐘，吸取上清，加 Eagle液10倍系列稀釋為10-1至10-8病毒液，各加入細(xì)胞板內(nèi)，每孔25l，每稀釋度4孔細(xì)胞。2每孔加細(xì)胞懸液25l，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照（25l稀釋液+25l 細(xì)胞懸液）， 37培養(yǎng)7天，觀察細(xì)胞病變。3按Reed-Muench法計(jì)算出分離病毒株的TCID50。（四）病毒鑒定（微量中和實(shí)驗(yàn)）1將CA2

4、4v或EV70的標(biāo)準(zhǔn)血清稀釋至20個(gè)單位（例如：血清效價(jià)為1:160時(shí)，進(jìn)行1:8稀釋）。2 在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入20個(gè)單位的標(biāo)準(zhǔn)抗血清25l和100個(gè)TCID50病毒25l，37作用1小時(shí)，最后加入HeLa或其它敏感細(xì)胞懸液25l。同時(shí)設(shè)以下對(duì)照：（1）病毒滴度核實(shí)對(duì)照：第一孔加100個(gè)TCID50病毒25l，從第二孔開(kāi)始進(jìn)行倍比稀釋病毒最后每孔加稀釋液25l 及細(xì)胞懸液25l；（2）陽(yáng)性對(duì)照：加100個(gè)TCID50病毒25l 、稀釋液25l 和細(xì)胞懸液25l；（3）陰性對(duì)照：加稀釋液50l 和細(xì)胞懸液25l；（4）陰性血清對(duì)照：每孔加 100個(gè)TCID50病毒25l 、不含特異性抗

5、體的血清25l 和細(xì)胞懸液25l；（5）將細(xì)胞板輕輕搖勻，37、5CO2溫箱培養(yǎng)7天。3觀察細(xì)胞病變，以完全病變?yōu)榕袛鄻?biāo)準(zhǔn)，不發(fā)生細(xì)胞病變的證明其病毒能被標(biāo)準(zhǔn)血清所中和，以此鑒定病毒。二、間接免疫熒光試驗(yàn)法（一）眼結(jié)膜細(xì)胞涂片1.用棉拭子取結(jié)膜細(xì)胞，涂于清潔的玻片上，室溫干燥，冷丙酮于4固定10min。2. 一個(gè)患者標(biāo)本作兩個(gè)涂片，分別用抗CA24v及抗EV70單克隆抗體作間接免疫熒光試驗(yàn)，檢查結(jié)膜細(xì)胞中的病毒抗原。（二）細(xì)胞培養(yǎng)物涂片1眼拭子標(biāo)本接種于細(xì)胞培養(yǎng)管中，出現(xiàn)可疑細(xì)胞病變時(shí)，取其中一管用毛細(xì)吸管吹打下細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌做細(xì)胞涂片，室溫干燥，冷丙酮固定。2分別用抗CA24V及抗EV7

6、0單克隆抗體作間接免疫熒光試驗(yàn)檢查病毒抗原，既可以確定分離是否為陽(yáng)性，又可以及時(shí)鑒定出病毒型別。（三）間接免疫熒光試驗(yàn)法1上述結(jié)膜細(xì)胞涂片或病毒分離涂片，分別加適當(dāng)稀釋的抗CA24v及抗EV70單克隆抗體，將玻片置于37濕盒內(nèi)30min。2取玻片用pH 7.2-7.4的PBS洗滌3次，每次3min-5min。3加適當(dāng)稀釋的抗鼠IgG熒光素結(jié)合物，置于37濕盒內(nèi)30 min。4取出玻片，同上法用P.B.S洗滌3次，加50%中性甘油P.B.S封片鏡檢，在熒光顯微鏡下細(xì)胞漿內(nèi)見(jiàn)黃綠色熒光為陽(yáng)性。5在實(shí)驗(yàn)中設(shè)陰性或陽(yáng)性對(duì)照。（三） 血清學(xué)檢查1.發(fā)病13天內(nèi)采取患者急性期血清，發(fā)病后24周采取恢復(fù)期血清，分別-20凍存?zhèn)錂z。2雙份血清1:5稀釋，56，30分鐘滅活。3在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上將上述血清從1:5開(kāi)始倍比稀釋至1:1280，每孔量為25l。4每孔加100個(gè)TCID50病毒25l，37作